利福平的新型rpoB抗性基因及其应用的制作方法

利福平的新型rpob抗性基因及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及利福平的抗性基因及其应用。


背景技术：

2.利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆 菌等多种病原微生物均有抗菌活性，主要应用于肺结核和其他结核病的治疗， 然而，近年来，细菌耐药性的问题已日趋严重，耐药细菌的产生和传播导致抗 生素药效降低甚至彻底失效，对疾病的预防和治疗提出了巨大的挑战。
3.利福平通过与细菌dna依赖的rna聚合酶亚基特异性结合，抑制rna聚合 酶的活性，干扰细菌dna的转录起始，阻碍蛋白质合成从而发挥杀菌作用。rna 聚合酶由5个亚单位组成，其中的β亚单位由rpob基因进行编码。rpob基因突变 是细菌的利福平类抗生素耐药的主要机制。rpob基因的少数密码子发生突变后， 其编码的氨基酸改变，使rna聚合酶分子原有的利福平结合点的构象发生改变。 利福平无法与rna聚合酶分子结合，从而导致利福平耐药，这在多种细菌中都 得到了证实。
4.纳米单分子测序技术由oxford nanopore technologies公司开发，他们设计了 一种特殊的纳米孔，当dna碱基通过纳米孔时，不同的碱基使得电荷发生变化， 从而影响流过纳米孔的电流强度，通过检测这些变化来鉴定所通过的碱基。纳 米孔测序读长很长，可以有效地弥补二代测序读长短的缺点，是一个获取长片 段基因序列的有效方法。


技术实现要素：

5.针对上述背景技术，本发明的目的是提供利福平的抗性基因及其应用，本 发明是从staphylococcus aureus li4中发现了利福平的新型抗性基因rpob_like基 因，补充了利福平耐药的数据库，为深入研究细菌耐药打下了坚实基础。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.本发明第一方面提供利福平的抗性基因，所述抗性基因为rpob突变基因， 其基因序列如seq id no.1所示，命名为rpob_like基因。
8.本发明第二方面提供利福平的抗性基因rpob_like基因的检测方法，所述 rpob_like基因的序列如seq id no.1所示，所述检测方法选自pcr检测方法。
9.本发明第三方面提供检测利福平的抗性基因的试剂盒，所述试剂盒包含检 测seq id no.1序列的试剂。
10.本发明第四方面提供检测seq id no.1序列的试剂在制备检测利福平耐药 性的试剂盒中的应用。
11.进一步地，所述检测seq id no.1序列的试剂为以pcr方法或qpcr方法 对seq id no.1序列进行定性或定量检测构建的试剂。
12.本发明第五方面提供rpob_like基因作为靶基因在提高受试者对利福平敏 感度方面的应用。
13.本发明第六方面提供一种检测利福平耐药性的方法，其特征在于，基于seqid no.1序列信息检测利福平类抗生素耐药性。
14.进一步地，所述方法不以诊断为目的。
15.上述技术方案具有如下优点或者有益效果：
16.本发明提供利福平的一个新型的抗性基因rpob_like基因及其应用，其中 rpob_like基因序列如seq id no.1所示。本发明对了解利福平的耐药机制和补 充耐药数据库提供了帮助，也为之后对抗利福平耐药提供了理论支持。
具体实施方式
17.下述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。因此， 以下提供的本发明实施例中的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范 围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人 员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的 保护范围。
18.实施例1：
19.1.基因组dna提取和测序
20.将2ml经16
‑
18h培养的菌液(利福平敏感菌株：金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureus atcc25923；利福平抗性菌株：金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureus li4)通过6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后收集沉淀， 使用bacteria dna kit试剂盒完成其基因组dna的提取。在promethion和 novaseq 6000平台分别进行nanopore和illumina测序。
21.2.生物信息分析
22.通过unicycler软件对样品的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因 组数据，再经过prokka软件对获得的基因组进行注释，利用danman软件对 注释结果中不同菌株的rpob基因进行比对获得snp位点信息。unicycler软件 的具体参数为：unicycler
‑
1li4_1.fq
‑
2li4_2.fq
‑
l li4.nano.fq
‑
o li4
‑
t 46
‑‑
modenormal
–
min_polish_size 2000。
23.其中li4_1.fq和li4_2.fq为illlumina测序的双端数据，li4.nano.fq为nanopore 测序数据。
24.prokka软件的具体参数为：prokka li4.fa
‑‑
cpus 20
‑‑
outdir li4_annotation
ꢀ‑‑
prefix li4
‑‑
kingdom bacteria。
25.其中li4.fa为unicycler混合组装获得的基因组。
26.(利福平敏感菌株s.aureus atcc25923数据处理方式同上)
27.分别从注释结果中提取s.aureus atcc25923和s.aureus li4的rpob基因核 酸序列及其编码蛋白序列，使用dnaman软件进行序列比对，发现相比较于 敏感菌株s.aureus atcc25923，菌株s.aureus li4的rpob基因上有三处snp 位点，第1412位碱基由a突变为g，第1457为碱基由c突变为t，第2256 位碱基由g突变为a，这三处snp位点导致相应位置的氨基酸发生错义突变， 这三处snp位点分别导致第471位氨基酸天冬氨酸突变成了甘氨酸，第486位 氨基酸丝氨酸突变成了亮氨酸，第752位氨基酸蛋氨酸突变成了异亮氨酸，而 这些snp位点均不在现有已发现的范围之内(第507
‑
533位氨基酸和第563
‑
572 位氨基酸)，表明这些snp位点为新型snp位点，菌株s.aureus li4所带的利 福平抗性基因为一个新型的抗性基因，将其命名为rpob_like基因。
28.3.mic验证基因功能
29.检测菌株s.aureus li4对利福平的最小抑菌浓度mic值之后发现，该菌株 对利福平的mic值达到256μg/ml，而敏感菌株s.aureus atcc25923的mic值 仅为0.016μg/ml，说明菌株s.aureus li4携带的rpob_like基因使得菌株对利福 平具有抗性，rpob_like为利福平的抗性基因。
30.以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡 是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技 术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。