一种蛋白在防治草地贪夜蛾和或棉铃虫中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种蛋白在防治草地贪夜蛾和/或棉铃虫中的应用。


背景技术：

2.草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)是一种原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫，其具有繁殖、适应和迁徙能力强等特点。其幼虫可取食禾本科、菊科、豆科、苋菜科为主的76科353种植物。自2019年1月入侵我国后，草地贪夜蛾在全国范围内迅速扩散，对粮食生产安全和生态安全产生重大威胁。目前草地贪夜蛾的防治主要采取化学防治和生物防治两种策略。生物防治主要依靠昆虫病原菌，如苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis，bt)。然而，随着转bt cry类基因作物的持续种植，草地贪夜蛾逐渐对该类基因产生了抗性。
3.因此，有必要寻找在田间抗性基因频率维持在低的水平抗草地贪夜蛾基因。


技术实现要素：

4.本发明之一提供了一种蛋白，其为氨基酸序列如seq id no.4所示的蛋白的突变蛋白，所述突变蛋白为在s543n、i544l和e627a三个位点同时发生突变的突变蛋白和/或在s543n、i544l和s686r三个位点同时发生突变的突变蛋白。
5.本发明之二提供了一种组合物，其含有如本发明之一所述的蛋白。
6.本发明之三提供了编码如本发明之一所述的蛋白的核酸。
7.在一个具体实施方式中，编码所述第一突变蛋白的核酸为对如seq id no.1所示的序列的第1627
‑
1629位的tcc突变为aac，第1630
‑
1632位的ata突变为tta，第1879
‑
1881位的gaa突变为gct；编码所述第二突变蛋白的核酸为对如seq id no.1所示的序列的第1627
‑
1629位的tcc突变为aac，第1630
‑
1632位的ata突变为tta，第2056
‑
2058位的agt突变为cgt。
8.本发明之四提供了一种微生物，其含有如本发明之三所述的核酸，且所述核酸能表达如本发明之一所述的蛋白。
9.在一个具体实施方式中，所述微生物为大肠杆菌和/或苏云金芽胞杆菌。
10.本发明之五提供了根据本发明之一所述的蛋白、本发明之二所述的组合物、本发明之三所述的核酸和本发明之四所述的微生物中的一种在防治草地贪夜蛾和/或棉铃虫中的应用。
11.本发明的有益效果：
12.本发明首次发现对如氨基酸序列如seq id no.4所示的蛋白进行s543n、i544l和e627a三个位点同时发生突变的突变蛋白或进行s543n、i544l和s686r三个位点同时发生突变的突变蛋白显著提高了对草地贪夜蛾和棉铃虫的活性，这为开发新一代生物杀虫剂和转基因植物奠定了基础，丰富了我国杀虫工程微生物的基因资源库。
具体实施方式
13.以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
14.如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
15.实施例1
16.vip蛋白的表达
17.基于如seq id no.1所示的核苷酸序列设计引物f1/r1(seq id no.2/seq id no.3；atgaacaagaataatactaaattaagc；ctacttaatagagacatcgtaaaaatg tac)，如seq id no.1的核苷酸序列和引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，如seq id no.1所示的核苷酸编码如seq id no.4所示的蛋白(即vip蛋白)。
18.以f1/r1为模板，以合成的如seq id no.1所示的核苷酸为模板，进行pcr扩增，之后将扩增后的产物连接到pet28a载体上，得到pet
‑
vip重组质粒，然后将阳性的重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)中，筛选出阳性转化子bl21(de3)/pet
‑
vip。
19.挑取bl21(de3)/pet
‑
vip新鲜的菌落接种于5ml的lb液体培养基中活化8小时，然后以1％的接种量接种于装有20l已灭菌lb培养基的发酵罐中(加入1/1000的氨苄青霉素)，37℃，220rpm培养3.5h左右至od
600nm
为0.6时，加iptg至终浓度为0.5mmol/l，设定诱导温度20℃，诱导培养12h，然后于4℃下以10000g 15min的方式离心收集被诱导的菌体，菌体再用20mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)悬浮均匀，接下来以70％的功率对菌体进行超声破碎6min(超3s停5s)，然后4℃，10000g离心25min，分别收集上清和沉淀，其中，沉淀用20mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)悬浮。对上清和悬浮的沉淀进行sds
‑
page检测，结果显示vip蛋白在上清(可溶性组分)中的表达量比在沉淀(不可溶性组分)中的表达可多达一倍以上，因此，以可溶性组分进行杀虫活性分析。
20.在活性测定前，通过bsa定量vip蛋白的浓度。
21.实施例2
22.突变蛋白的表达
23.设计突变引物p
‑
i544l(seq id no.5)，从而对seq id no.4进行i544l突变；设计突变引物p
‑
w552a(seq id no.6)，从而对seq id no.4进行w552a突变；设计突变引物p
‑
n624a(seq id no.7)，从而对seq id no.4进行n624a突变；设计突变引物p
‑
e627a(seq id no.8)，从而对seq id no.4进行e627a突变；设计突变引物p
‑
s686r(seq id no.9)，从而对seq id no.4进行s686r突变；设计突变引物p
‑
s543n/i544l(seq id no.10)，从而对seq id no.4进行s543n/i544l突变；设计突变引物p
‑
n624a/e627a(seq id no.11)，从而对seq id no.4进行n624a/e627a突变。以pet
‑
vip质粒为模板，用超高保真聚合酶(phusion)和上述突变引物分别进行pcr扩增，得到pcr产物，将得到的pcr产物用dpn i内切酶去除作为模板的质粒以排除后期对转化的影响，得到酶切pcr产物。酶切pcr产物纯化后转大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取单斑摇菌后对菌液进行测序，分别得到阳性重组菌株dh5α/pet
‑
vip
‑
i544l，dh5α/pet
‑
vip
‑
w552a，dh5α/pet
‑
vip
‑
n624a，dh5α/pet
‑
vip
‑
e627a，dh5α/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l，dh5α/pet
‑
vip
‑
n624a/e627a。其中，各个突变对应的密码子如表1所示。
24.以p
‑
e627a(seq id no.8)为突变引物，以pet
‑
vip
‑
s543n/i544l为模板，用超高保真聚合酶(phusion)进行pcr，从而对seq id no.4进行s543n/i544l/e627a突变。将得到的
pcr产物用dpn i内切酶去除作为模板的质粒以排除后期对转化的影响，得到酶切pcr产物。酶切pcr产物纯化后转大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取单斑摇菌后对菌液进行测序，分别得到阳性重组菌株dh5α/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l/e627a。其中，突变对应的密码子如表1所示。
25.以p
‑
s686r(seq id no.9)为突变引物，以pet
‑
vip
‑
s543n/i544l为模板，用超高保真聚合酶(phusion)进行pcr，从而对seq id no.4进行s543n/i544l/s686r突变。将得到的pcr产物用dpn i内切酶去除作为模板的质粒以排除后期对转化的影响，得到酶切pcr产物。酶切pcr产物纯化后转大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取单斑摇菌后对菌液进行测序，分别得到阳性重组菌株dh5α/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l/s686r。其中，突变对应的密码子如表1所示。
26.表1
[0027][0028][0029]
从重组菌株dh5α/pet
‑
vip
‑
i544l、dh5α/pet
‑
vip
‑
w552a、dh5α/pet
‑
vip
‑
n624a、dh5α/pet
‑
vip
‑
e627a、dh5α/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l、dh5α/pet
‑
vip
‑
n624a/e627a、dh5α/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l/e627a和dh5α/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l/s686r中分别提取质粒，然后将质粒分别转化bl21(de3)，得到重组菌株bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
i544l、bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
w552a、bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
n624a、bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
e627a、bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l、bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
n624a/e627a、bl21(de3)/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l/e627a和bl2(de3)1/pet
‑
vip
‑
s543n/i544l/s686r以用于表达突变蛋白。
[0030]
以实施例1同样的方式诱导表达突变蛋白，结果显示突变蛋白在上清(可溶性组分)中的表达量比在沉淀(不可溶性组分)中的表达要多，因此，以可溶性组分进行杀虫活性分析。
[0031]
同样，在活性测定前，通过bsa定量突变蛋白的浓度。
[0032]
实施例3
[0033]
对草地贪夜蛾杀虫活性测定
[0034]
草地贪夜蛾由吉林省农业科学院植物保护研究所提供。
[0035]
以20mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)作为空白对照；将vip蛋白及其单位点突变蛋白的浓度依次设置为0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml，得到各待测蛋白样品。以用于测定vip蛋白及其单位点突变蛋白对草地贪夜蛾的活性。
[0036]
杀虫活性测定步骤：称取5g人工饲料(配方见表2)于灭菌培养皿中，加入1ml各个浓度下的待测蛋白样品或空白对照，充分混合均匀，均匀的分装于已消毒的24孔细胞培养板中，室温放置至饲料中多余水分全部蒸发；用毛笔将健康的、个体活跃的、未经取食的草
地贪夜蛾初孵幼虫(孵化后12h内)拉线接入装有上述饲料的孔内，每孔1头虫铺上湿润卫生纸后盖上塑料盖，用橡皮筋捆紧，竖立放入生化培养箱中，于28℃，光周期16l:8d，相对湿度65％培养，每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结；7d后调查死虫数，结果见表2。然后计算死亡率。每个处理24头虫，重复3次。利用poloplus软件分析蛋白的致死中浓度(lc
50
)。结果见表3。
[0037]
表2
[0038]
饲料组分1份用量2份用量琼脂55g110g黄豆粉110g220g麦麸/麦胚粉210g420g酵母粉40g80g山梨酸4g8g干酪素55g110g抗坏血酸4g8g复合维生素3ml6ml甲醛3ml6ml乙酸6ml12ml特克多1ml2ml蒸馏水1800(1600 200)ml3600(3400 200)ml
[0039]
表3
[0040]
蛋白lc
50
(μg/g饲料)95％置信限(μg/g)vip2.2011.491
‑
3.194i544l2.8281.914
‑
5.358w552a
‑ꢀ
n624a
‑ꢀ
e627a3.3831.998
‑
5.488s686r2.2901.619
‑
3.891
[0041]
注：
“‑”
表示丧失活性。
[0042]
以20mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)作为空白对照；将vip蛋白、其双位点突变蛋白和其三位点突变蛋白的浓度依次设置为0.375μg/ml、0.75μg/ml、1.5μg/ml、3.0μg/ml、6.0μg/ml、12.0μg/ml、24μg/ml，得到各待测蛋白样品。以用于测定vip蛋白、其双位点突变蛋白和其三位点突变蛋白对草地贪夜蛾的活性。
[0043]
草地贪夜蛾的杀虫活性测定步骤同上。
[0044]
结果见表4。
[0045]
表4
[0046]
蛋白lc
50
(μg/g饲料)95％置信限(μg/g)vip0.9460.584
‑
1.571s543n/i544l0.9020.407
‑
1.654
n624a/e627a0.8460.557
‑
1.458s543n/i544l/e627a0.118*0.056
‑
0.191s543n/i544l/s686r0.365*0.268
‑
0.480
[0047]
注：*表示数值与vip之间有显著差异，p≤0.05。
[0048]
如表4所示，s543n/i544l/e627a突变蛋白是突变前活性的8.02倍，s543n/i544l/s686r突变蛋白是突变前活性的2.59倍，活性均有显著的提高。
[0049]
实施例4
[0050]
对棉铃虫杀虫活性测定
[0051]
以20mmol/l tris
‑
hcl(ph 8.0)作为空白对照；将vip蛋白和三位点突变体蛋白s543n/i544l/s686r的浓度分别依次设置为1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.00μg/ml、10.00μg/ml、20.00μg/ml、40.00μg/ml、80.00μg/ml、160.00μg/ml。
[0052]
称取15g人工饲料(配方见实施例3中的表1)于灭菌培养皿中，加入3ml各个浓度下的待测蛋白样品或空白对照，充分混合均匀，均匀的分装于已消毒的24孔细胞培养板中，室温放置至饲料中多余水分全部蒸发；用毛笔将健康的、未经取食的棉铃虫初孵幼虫(孵化后12h内)拉线接入装有上述饲料的孔内，每孔1头虫铺上湿润卫生纸后盖上塑料盖，用橡皮筋捆紧，竖立放入生化培养箱中，于25℃，光周期16l:8d，相对湿度30％培养，每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气的凝结。7d后调查死虫数。然后计算死亡率。每个处理24头虫，重复3次。利用poloplus软件分析蛋白的致死中浓度(lc
50
)，结果见表5。
[0053]
表5
[0054]
蛋白lc
50
(μg/g饲料)95％置信限(μg/g)vip9.8918.229
‑
12.193s543n/i544l/s686r2.756*1.954
‑
3.928
[0055]
如表5所示，s543n/i544l/s686r突变蛋白是突变前活性的3.59倍，活性有显著的提高。
[0056]
虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。