一种利用茶渣发酵的固体木霉菌剂及其在茶叶育苗中的应用的制作方法

1.本发明属于生物工程领域，涉及一种利用茶渣固体发酵的固体木霉菌剂及其在茶叶育苗中的应用。


背景技术：

2.木霉属真菌是一类重要的根际促生真菌，其凭借重寄生作用、抗生作用和竞争作用等多种机制产生的良好生防效应已经成为生物有机类肥料的重要开发对象。研究表明，固体发酵比液体发酵更能提高木霉菌种孢子数量和货架期。木霉菌种固体发酵包括木霉菌种的液体培养、固体原料的选择与处理和固体发酵环境的控制等技术。目前，已经有部分学者对木霉菌种固体发酵做了一些研究，如中国专利cn105586279公开了利用作物秸秆发酵木霉固体菌种；cn104059860a公开了利用麦麸和锯木屑固体发酵拟康氏木霉；cn109628321b公开利用甜叶菊渣固体发酵木霉。上述报道的木霉菌种发酵技术涉及到了对原料调整ph的步骤，如果能够寻得一种无需调控ph的原料将极大地节约生产成本。
3.茶渣是指茶叶在生产加工以及深加工、销售、饮用过程中产生的固体有机废弃物，主要包括茶叶深加工过程中经浸泡提取后的废弃茶叶、销售过程产生的滞销粗老茶和加工过程产生的副茶(约占成品茶总产量的10％)。茶叶加工厂挑剩的茶末、茶梗以及数量众多口感不好被淘汰的夏秋茶也属于茶渣范畴。根据现有的报道表明，茶渣自身含有非常丰富的营养物质,氮含量达4.77％、碳含量达50.2％,并富含磷、钙、钾等多种微量元素，并且5种常规重金属含量均在安全范围以内。如何实现茶渣资源的有效利用也具有重要意义。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术存在的不足，本技术旨在提供一种利用茶渣固体发酵的固体木霉菌剂及其应用，本发明所述的固体发酵木霉菌剂对茶叶育苗过程中的促生效果。
5.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
6.本发明提供一种利用茶渣固体发酵的固体木霉菌剂，将贵州木霉njau4742接种到固体培养基中浅盘发酵3天以上获得；所述的固体培养基为重量百分比为60％～100％的茶渣和0％～40％的米糠，含水量为60％～70％。
7.本发明所述的贵州木霉njau4742为现有已知菌株(如专利201810768488.0中公开)，分类命名为贵州木霉(trichoderma guizhouense)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年04月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.12166。
8.本发明所述的茶渣可以为任意茶叶的茶渣，在一些实施例中是经过烘干处理后含水量小于10％，粒径小于5mm的任意茶叶的茶渣。
9.在一些具体的实施例中，所述的固体培养基为重量百分比为60％～80％的茶渣和20％～40％的米糠；更具体的为重量百分比为70％的茶渣和30％的米糠。
10.在一些具体的实施例中，所述的固体培养基的含水量为65％。
11.在一些具体的实施例中，浅盘发酵的厚度为3～6cm；更具体为3cm。
12.在一些具体的实施例中，接种量为10％～20％；更具体为15％。
13.在一些具体的实施例中，发酵时间为3～5天；更具体为4天。
14.在一些具体的实施例中，发酵温度为26～28℃。
15.本发明所述的固体培养基可以按照本领域的常规方法制备，在一种具体的实例中，为配方量的茶渣和米糠调节含水量60％～70％后灭菌即可。灭菌方法可以为本领域的常规方法，例如固体灭菌罐115℃灭菌30分钟。
16.本发明还提供所述的固体木霉菌剂制备的木霉菌液。
17.在一些实例中，所述木霉菌液的制备方法为本发明所述的固体木霉菌剂按照1：(8～10)的比例添加无菌水，摇床培养25～35分钟后获得。
18.本发明还提供所述的固体木霉菌剂或木霉菌液在茶叶育苗中的应用。
19.在一些实施例中，当用于茶叶育苗中时，所述的固体木霉菌剂或木霉菌液的用量为木霉菌1
×
107～1
×
108cfu/ml基质，即每毫升基质中木霉菌为1
×
107～1
×
108cfu；优选为1
×
107cfu/ml基质。
20.有益效果本发明提供了一种利用茶渣固体发酵木霉菌剂及其制备方法，以茶渣为主要原料进行固体发酵木霉菌剂，不仅有效的解决茶渣的资源化利用问题，且生产出来的木霉菌种孢子数量获得显著的提升，可以达到鲜重1.9
×
109cfu/g fw。将其运用到茶叶育苗当中，通过观察茶苗的生长长势以及各项指标的检测，得出发酵的木霉菌种对茶苗有较好的促生效果，同时实现了茶渣在茶叶种植中的循环利用。此外，还具有以下具体优点：
21.1)利用茶渣固体发酵木霉菌种无需对原料进行调整ph，便于操作同时也节约成本。
22.2)茶渣发酵的木霉菌种能显著地促进茶苗的生长，在株高、茎粗等方面均有显著体现，实现了茶渣的资源化利用。
附图说明
23.图1不同固体原料载体对木霉菌种固体发酵的影响。
24.图2茶叶添加不同米糠比例对木霉菌种固体发酵的影响。
25.图3不同浅盘发酵厚度对木霉菌种固体发酵的影响。
26.图4不同浅盘发酵接种量对木霉菌种固体发酵的影响。
27.图5不同浅盘发酵时间对木霉菌种固体发酵的影响。
28.图6直接施用木霉菌种对扦插茶苗的影响。
29.图7木霉菌种对茶苗的盆栽促生效果图。
具体实施方式
30.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
31.若无特别说明，以下实施例中所用原料如下：
32.菌种：贵州木霉njau 4742(trichoderma guizhou njau 4742)由南京农业大学资
源与环境科学学院植物营养课题组实验室保存。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年04月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为cgmcc no.12166。
33.发酵原料：酸解氨基酸、茶渣、米糠。酸解氨基酸由江阴联业生物科技有限公司友情提供，游离氨基酸含量为15％，游离氢离子浓度为3m，也可通过购买方式获得。茶渣由禾瑞升(浙江)生物科技有限公司友情提供，可通过购买方式获得，米糠由市场采购获得。
34.实施例1木霉菌剂固体发酵
35.1、木霉菌种液体培养
36.将贵州木霉njau 4742经过pda固体培养基活化后接种至pda液体培养基，经过170r/min，28℃条件下液体发酵培养4d获得贵州木霉njau 4742液体菌液。
37.2、固体培养基筛选
38.固体培养基设置5个处理，分别为处理1：100％茶渣(调ph)；处理2:25％茶渣 25％米糠 50％秸秆；处理三：30％茶渣 70％秸秆；处理四：70％茶渣 30％米糠；处理五(不调ph)：100％茶渣。贵州木霉njau 4742最适固体发酵初始ph为2.5
‑
3.0，利用酸解氨基酸液调节上述前4个处理ph为2.5
‑
3.0(加入酸解氨基酸的比例为6.6％)，处理五不调ph，五个处理均调节含水量为65％。115℃灭菌30分钟冷却后接种15％上述获得的贵州木霉njau 4742液体菌液，室温下浅盘(物料厚度3cm)固体发酵4天。木霉孢子数量统计：取5g木霉固体培养菌种，在45ml无菌水中稀释，利用涡旋混合器充分混匀，采用血球计数板法测定孢子浓度。如图1所示，不同物料组合对木霉发酵的孢子数量具有一定的影响。茶渣添加30％的米糠发酵效果优于其他处理，孢子数量达到7.75
×
108cfu/g fw。纯茶渣(不调ph)处理孢子数量达到7.25
×
108cfu/g fw，纯茶渣(调ph)处理孢子数量达到6.75
×
108cfu/g fw，表明纯茶渣也适用于木霉菌种固体发酵。相比纯茶渣处理，茶渣添加33％米糠对木霉菌种孢子数有显著的影响，茶渣调节ph值对木霉的生长没有显著的促进作用，而茶渣添加秸秆则不生长木霉。上述结果表明本发明所述的米糠作为茶渣固体发酵木霉菌种的载体，具有显著的效果。
39.3、固体培养基添加比例
40.固体培养基添加比例设置5个处理，分别为处理1：100％茶渣；处理2：90％茶渣 10％米糠；处理3：80％茶渣 20％米糠:处理4：70％茶渣 30％米糠；处理5:60％茶渣 40％米糠。含水量、灭菌方式、接种量以及培养条件同2.2，五个处理均不调ph值。如图2所示，本发明所述的茶渣添加不同比例的米糠对木霉发酵的孢子数量具有显著的影响。特别是茶渣添加30％的米糠发酵效果显著优于其他处理，孢子数量达到鲜重8.75
×
108cfu/g fw。
41.4、浅盘发酵厚度
42.浅盘发酵物料厚度设置5个处理，分别为2、3、4、5和6cm。物料为70％茶渣 30％米糠。含水量、灭菌方式、接种量、温度、湿度以及培养时间同2.2，五个处理均不调ph值。如图3所示，本发明所述的浅盘发酵物料厚度对木霉发酵孢子数量具有显著的影响。特别是3cm物料厚度具有显著的优势效果。
43.5、浅盘发酵接种量
44.浅盘发酵接种量设置5个处理，分别为5％、10％、15％、20％和25％。物料为70％茶渣 30％米糠，物料厚度为3cm。含水量、灭菌方式、温度、湿度以及培养时间同2.2，五个处理均不调ph值。如图4所示，本发明所述浅盘发酵物料接种比例对木霉发酵孢子数量具有显著
的影响。为了节约工业生产成本，优选15％为接种比例。
45.6、浅盘发酵培养时间
46.浅盘发酵接种量设置5个处理，分别为2、3、4、5和6天。物料为70％茶渣 30％米糠，接种量为15％。含水量、灭菌方式、温度、湿度以及物料厚度同2.5。如图5所示，本发明所述浅盘发酵时间对木霉发酵孢子数量具有显著的影响。为了节约时间生产成本，优选4天为发酵时间。
47.实施例2直接施用木霉菌种对扦插茶苗的影响
48.茶叶扦插育苗基质为草炭：红壤土：蛭石：珍珠岩＝30:30:20:20，在该基质中添加0cfu/ml、6
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107cfu/ml、12
×
107cfu/ml、18
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107cfu/ml和24
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107cfu/ml的木霉菌种分别定义为ck处理、t1处理、t2处理、t3处理和t4处理。由图6可得，随着木霉添加量的增加，大面积扦插苗叶片枯萎，扦插切面发黑，扦插苗的成活率也呈现递减的趋势。因此，在扦插苗中直接添加木霉菌种，会严重降低茶叶扦插苗的成活率，这可能由于木霉腐生特性导致扦插苗切面受到了破坏。
49.实施例3木霉菌种盆栽促生效应
50.盆栽试验材料为一年生带根扦插苗(根长2cm，须根较少)，基质为：草炭：红壤土：蛭石：珍珠岩＝30:30:20:20。盆栽试验设置1个空白对照和4个木霉梯度处理，分别是空白对照处理ck；t1：1
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108cfu/ml；t2：5
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107cfu/ml；t3：1
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107cfu/ml；t4：5
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106cfu/ml。盆栽试验方法具体操作为将扦插苗移栽到24孔穴盘中，培养一周左右后开始分五次浇木霉菌液。木霉菌液的制备为将发酵好的固体木霉菌种按照1:9的比例添加无菌水(即稀释十倍)，放入摇床30min，过滤后使用。
51.由图7和表1可知，浇菌完成培育45天以后，相比对照处理，施入木霉菌种对茶苗各项生物量指标均有显著的差异，其中随着施用木霉菌种量的减少根长和地上部鲜重呈现递减的趋势并达到显著性差异，株高、茎粗没有达到显著性差异，添加木霉的四个处理各项指标均显著高于空白对照。t1、t2和t3之间在根长、株高、茎粗、叶绿素、地上部和地下部鲜重均无明显差异，而比t4效果更佳，且明显优于ck组。为了节约成本，优选菌种的施用量为t3，即1
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107cfu/ml。由于本发明制备的木霉菌种数量为1.9
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109cfu/ml fw，所以施用量为稀释190倍。该结果对本发明木霉菌种产品在茶叶育苗生产中具有重要的指导意义。
52.表1不同处理对茶苗生物量的影响
[0053][0054]
注：ck:空白对照处理；t1:1
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108cfu/ml；t2:5
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107cfu/ml；t3:1
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107cfu/ml；t4:5
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106cfu/ml