本发明涉及一种基于磁性纳米晶体酶制剂的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂比色检测方法，属于生物酶传感器领域。
背景技术：
芳氧苯氧丙酸酯类(aopp)除草剂是一类广泛使用的防除禾本科杂草的高活性除草剂，主要通过抑制乙酰辅酶a羧化酶来抑制细胞脂肪酸合成，破坏分生组织生长使杂草坏死。aopp除草剂是一种在禾本科杂草和双子叶作物间有高选择性的新型旱田茎叶处理剂，因其高效、低毒而在我国及世界100多个国家广泛应用。2014年，全球aopp除草剂销售额约121.7亿美元，占世界除草剂销售总额的4.6％。当前我国市场上销售量最大的三种aopp除草剂包括精喹禾灵、精恶唑禾草灵和高效氟吡甲禾灵，2010年的销售额分别占该类除草剂总销售量的33.7％。尽管aopp除草剂的毒性相对较低，但大量研究表明哺乳动物和人体长期接触即使微量的aopp除草剂残留(10-100μm)也会诱发肝肾损伤，严重威胁人类健康。同时，农产品中aopp除草剂残留超标也会影响我国农产品在国际市场的竞争力，制约我国农业可持续、稳定发展。
由于aopp除草剂的结构复杂性和稳定性，环境样品中aopp除草剂残留的快速检测一直是个世界性难题。目前，aopp除草剂残留检测高度依赖高效液相色谱(hplc-ms)和气相色谱(gc-ms)等大型精密仪器。这些检测方法往往耗费时间较长，费用高，操作繁琐且需要复杂的样品处理过程，不适合快速、方便地进行大量样品的实时测定。基于生物大分子的电化学传感器具有简单、低成本和一步式分析的特点，已被应用于复杂环境样品中有机污染物残留检测。已经报道的用于传感器的生物大分子包括dna、抗体/抗原和酶分子，其中dna传感器和免疫分子传感器灵敏度和稳定性较低，且制备过程较为复杂，成本较高，而生物酶传感器具有酶分子的高活性和高特异性受到人们越来越多的关注。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种基于磁性纳米晶体酶制剂的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂比色检测方法，通过一步合成法将mnps、aopp除草剂水解酶qpeh、乙醇氧化酶(aox)同时包埋于zif-8(zif-8是mofs中一种常见晶体结构)晶体内，制备磁性纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8，将其作为生物酶传感器通过比色法检测环境样品中的aopp除草剂残留。
在生物酶传感器中，酶分子通常通过不同的方法被固定在工作电极上，而固定化方法和载体的选择对酶催化活性和稳定性有非常重要的影响。金属-有机化合物框架(metal-organicframeworks，mofs)是一类新型的多孔无机晶体材料，具有孔径大、比表面积高、孔隙率可调节等特点，作为酶固定化载体应用方面吸引了研究者的广泛关注。mofs可以通过有机组分和金属离子在水溶液中以酶分子为核心自组装成纳米晶体，将一种或多种酶分子同时包埋于晶体内部，形成酶-mofs晶体复合物。该过程不发生剧烈的化学反应，不会对酶催化活性造成严重影响；另一方面酶分子被包埋于晶体内，避免长期使用过程中酶分子的聚集和泄露。而且mofs晶体外壳对内部的酶分子能够提供有效保护，可以提高酶的化学和储存稳定性。
为了提高酶-mofs晶体复合物的易回收性，同时赋予酶制剂新的催化活性——模拟过氧化酶活性，磁性fe3o4纳米颗粒(mnps)在zif-8晶体合成过程中被加入到溶液中，制备磁性纳米晶体复合物mzif-8。该复合物能够利用过氧化酶活性在h2o2作用下催化邻苯二胺(opd)氧化生成橙色产物2,3-二氨基吩嗪(dap)，该产物可以通过比色法在波长450nm进行检测。
本发明基于磁性纳米晶体酶制剂的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂比色检测方法，包括如下步骤：
步骤1：磁性fe3o4纳米颗粒(mnps)的合成
在200ml的圆底烧瓶中加入6.5gfecl3·6h2o和3.342gfeso4·7h2o，完全溶解于100ml去离子水中，将体系加热至50℃并在真空状态下搅拌30min，然后将12.5ml氨水快速加入体系中并升温至75℃，磁力搅拌1h，然后加入12.5ml1.5moll-1柠檬酸三钠，升温至85℃并搅拌1.5h，待反应完成后，收集fe3o4纳米粒子，然后依次用乙醇和去离子水洗涤三次，60℃下真空干燥6h。
步骤2：aopp除草剂水解酯酶qpeh的提取和纯化
2a、酯酶qpeh的提取
将含有qpeh基因原核表达质粒pet-29a-qpeh的大肠杆菌bl21(de3)接种于10ml液体lb培养基中，37℃、220rpm下振荡培养过夜，然后按1％的量转接到2l液体lb培养基中，加入100μl卡那霉素(100mgml-1)在37℃、220rpm继续培养3h，使od600达到0.6，加入2mliptg(10％，w/v)后置于22℃、160rpm的恒温振荡培养箱中诱导过夜；将诱导培养后的菌液在7000g、4℃离心10min收集菌体，将菌体洗涤三次后用100mlph8.0的te缓冲液将菌体重悬，用ats高压均质机在4℃、800pa下破碎15min，然后在10000g、4℃离心20min，取上清进行蛋白纯化。
2b、酯酶qpeh的纯化
1)用10×柱体积ni-native-0缓冲液(ph8.0)洗涤镍柱(5ml)；
2)将2a提取的酯酶qpeh用0.45nm滤膜过滤，进一步去细胞碎片，防止堵塞镍柱，控制上柱的流速为0.5mlmin-1；
3)用20×柱体积ni-native-10缓冲液平衡镍柱，使其od280降到小于0.04，其流速为1.0ml/min；
4)分别依次用5×柱体积洗脱缓冲液ni-native-20、ni-native-50、ni-native-100、ni-native-250洗脱酯酶qpeh，流速为1.0mlmin-1，并依次收集不同浓度的qpeh洗脱液；
5)用15×柱体积、浓度为0.5mnaoh清洗树脂30min，；
6)用10×柱体积、50mmpbs重新平衡树脂，并用25％的乙醇存储；
7)纯化后的酯酶qpeh，用te透析48h去除过多的离子和咪唑，再用peg20000浓缩至10ml。4℃保存，并用bradford法测定酯酶qpeh的蛋白浓度。
步骤3：纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8的合成
先配制0.4mol/l的zn(no3)2溶液和1.25mol/l的2-甲基咪唑溶液，将20mgmnps重悬于2ml去离子水(di)中，超声波脱气15min；酯酶qpeh、aox溶液分别稀释至终浓度15mg/ml和5mg/ml；将2mlmnps重悬液和10ml2-甲基咪唑溶液倒入50ml烧杯中，立即加入1ml的zn(no3)2溶液和酯酶qpeh、aox溶液，室温下磁力搅拌30min，6000rpm室温离心10min，用50mmpbs将沉淀洗涤3次，真空冷冻干燥8h即获得纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8。
步骤4：aopp的检测
首先将待测试样重悬于3ml去离子水(di)中，5000rpm离心2min去除固体颗粒后进行连续倍比稀释至10×、100×；然后分别与含有5mgqpeh/aox@mzif-8的1mlnaac溶液(0.2m，ph4.0)和1mlopd(1.0mm)混合，在室温下避光孵育10min，用磁铁去除反应液中的qpeh/aox@mzif-8后，检测在450nm处的吸光值od450。选择在0.11-0.32范围内的吸光值根据od450与不同除草剂浓度的线性方程计算出相应除草剂的浓度值，从而获得待测样品中除草剂残留的浓度平均值。如果仅仅用于判定待测样品中是否有除草剂残留而不需要定量分析，室温避光孵育10min后可以直接通过肉眼观察是否有颜色变化。若溶液反应后变为黄色即可判断待测样品中有aopp除草剂残留。
在检测过程中，首先传感器利用晶体酶制剂中包埋的qpeh特异性地催化aopp除草剂的酯键水解生成醇类化合物，然后在aox的作用下被氧化生成h2o2；再利用mzif-8的模拟过氧化酶活性在h2o2作用下催化opd氧化生成颜色产物dap(图1)。由于dap在450nm的吸光值与三种aopp除草剂在不同浓度下(6.7-268μm)都具有良好的线性关系，因此可以实现aopp除草剂残留的快速、高灵敏、实时检测。这种基于mzif-8制备的多酶系统传感器，一方面可以通过简单的比色法甚至肉眼快速地检测我国目前使用量最大的三种aopp除草剂(精喹禾灵、精恶唑禾草灵和高效氟吡甲禾灵)，检测下限达到10μm以下，灵敏度和特异性均较高；另一方面，该传感器具有良好的稳定性和易回收性，通过外加磁铁在2min内即可回收，在4℃的保质期至少为50d，且可重复使用次数在10次以上，可以大大降低使用成本。
虽然mofs作为载体使用已有报道，但在固定化过程中往往需要加入有机溶剂(如甲醇)。已有研究表明有机溶剂的使用可导致酶活性降低，并出现二次污染。本研究中生物酶传感器的制备完全在水溶液中进行，避免了有机溶剂的使用，真正实现了绿色合成。另外在合成过程中也无需添加聚乙烯吡咯烷酮或纤维素等化合物促进结晶，即可有效将酶分子包埋于有规则的晶体内部，酶的装载量可达8％，也进一步降低了制造成本。
aopp除草剂是一种结构复杂的有机化合物，通过一步催化反应难以将其转化为可识别的信号分子进行检测。本发明以zif-8为载体通过生物矿化作用将两种酶分子和磁性fe3o4纳米颗粒(mnps)同时包埋于晶体内，巧妙地利用aopp水解酯酶qpeh、乙醇氧化酶aox和类过氧化酶mnps通过三步级联反应将aopp除草剂转化为颜色产物dap进行比色法检测。因涉及到多步级联反应，因此qpeh、aox和mnps三者在传感器中的比例以及检测反应中opd的浓度与传感器检测的灵敏度、反应时间和检测限等都有重要的关系。本发明通过反复试验不断优化，最终确定了qpeh、aox和mnps三者在传感器制备过程中的摩尔比以及opd的浓度，可以在较宽浓度范围内10min内完成aopp除草剂的检测，且检测下限达到10μm以下。
由于zif-8的密度较低、分散性较差，mnps的加入可以增强酶传感器可回收性和分散性。更重要的是，mnps具有模拟过氧化酶活性，也被称为“纳米酶”，mnps的加入赋予了传感器一种新的催化活性，而该活性在传感器对aopp除草剂的比色法检测中至关重要，qpeh/aox@mzif-8正是利用这一活性将opd转化为颜色产物dap进行比色法检测。本发明有效利用了纳米酶mnps的稳定、简单、低廉的特点，与生物酶(qpeh、aox)特异性强、活性高的特性相结合制备qpeh/aox@mzif-8多酶系统传感器，有效解决了aopp除草剂难以准确、快速、实时检测的难题。
附图说明
图1是qpeh/aox@mzif-8生物酶传感器的合成及比色法检测aopp除草剂示意图。
图2是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8的扫描电镜照片。
图3是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8粒子的尺寸分析。
图4是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8粒子的xrd分析测试结果。
图5是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8粒子的ft-ir测试结果。
图6是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8粒子的tga测试结果。
图7是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8粒子的n2吸附试验结果。
图8是纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8粒子的vsm试验结果。
图9是qpeh/aox@mzif-8酶传感器对三种aopp除草剂的检测结果。
图10是qpeh/aox@mzif-8生物酶传感器的储存稳定性(a)和重复使用性(b)。
具体实施方式
实施例1：磁性纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8的制备
1、磁性fe3o4纳米颗粒(mnps)的合成
在200ml的圆底烧瓶中加入6.5gfecl3·6h2o和3.342gfeso4·7h2o，完全溶解于100ml去离子水中，将体系加热至50℃并在真空状态下搅拌30min，然后将12.5ml氨水快速加入体系中并升温至75℃，磁力搅拌1h，然后加入12.5ml1.5moll-1柠檬酸三钠，升温至85℃并搅拌1.5h，待反应完成后，收集fe3o4纳米粒子，然后依次用乙醇和去离子水洗涤三次，60℃下真空干燥6h。
2、aopp除草剂水解酯酶qpeh的提取和纯化
2a、酯酶qpeh的提取
将含有qpeh基因原核表达质粒pet-29a-qpeh的大肠杆菌bl21(de3)接种于10ml液体lb培养基37℃、220rpm振荡培养过夜，然后按1％的量转接到2l液体lb培养基中，加入100μl卡那霉素(100mgml-1)在37℃、220rpm继续培养3h，使od600达到0.6，加入2mliptg(10％，w/v)后置于22℃、160rpm的恒温振荡培养箱中诱导过夜；将诱导培养后的菌液在7000g4℃离心10min收集菌体，将菌体洗涤三次后用100mlph8.0的te缓冲液将菌体重悬，用ats高压均质机在4℃800pa破碎15min，然后在10000g4℃离心20min，取上清进行蛋白纯化。
2b、酯酶qpeh的纯化
1)用10×柱体积ni-native-0缓冲液(ph8.0)洗涤镍柱(5ml)；
2)将2a提取的酯酶qpeh用0.45nm滤膜过滤，进一步去细胞碎片，防止堵塞镍柱，控制上柱的流速为0.5mlmin-1；
3)用20×柱体积ni-native-10缓冲液平衡镍柱，使其od280降到小于0.04，其流速为1.0ml/min；
4)分别依次用5×柱体积洗脱缓冲液ni-native-20、ni-native-50、ni-native-100、ni-native-250洗脱酯酶qpeh，流速为1.0mlmin-1，并依次收集不同浓度的qpeh洗脱液；
5)用15×柱体积、浓度为0.5mnaoh清洗树脂30min，；
6)用10×柱体积、50mmpbs重新平衡树脂，并用25％的乙醇存储；
7)纯化后的酯酶qpeh，用te透析48h去除过多的离子和咪唑，再用peg20000浓缩至10ml。4℃保存，并用bradford法测定酯酶qpeh的蛋白浓度。
3、纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8的合成
先配制0.4mol/l的zn(no3)2溶液和1.25mol/l的2-甲基咪唑溶液，将20mgmnps重悬于2ml去离子水(di)中，超声波脱气15min；酯酶qpeh、aox溶液分别稀释至终浓度15mg/ml和5mg/ml；将2mlmnps重悬液和10ml2-甲基咪唑溶液倒入50ml烧杯中，立即加入1ml的zn(no3)2溶液和酯酶qpeh、aox溶液，室温下磁力搅拌30min，6000rpm室温离心10min，用50mmpbs将沉淀洗涤3次，真空冷冻干燥8h即获得纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8。
实施例2：qpeh/aox@mzif-8纳米晶体酶制剂的特性检测
如图2扫描电镜所示，qpeh/aox@mzif-8具有正十二面体晶体形态，表面粗糙，平均直径约为494.5nm(图3)。x-raydiffraction(xrd)(图4)和fouriertransformedinfraredspectroscopy(ft-ir)(图5)检测结果表明，mnps、qpeh和aox被包埋于zif-8晶体内，qpeh/aox@mzif-8具有完整的zif-8晶体形态，mnps、qpeh和aox的加入并没有影响zif-8晶体的形成。thermalgravimetricanalysis(tga)(图6)结果表明在mzif-8中qpeh和aox的装载量约为8％。n2吸附试验结果(图7)表明qpeh/aox@mzif-8晶体具有典型的i型吸附-解吸曲线特征，通过bet法测得其比表面和空隙直径分别为526.2m2g-1和15.2nm。vibratingsamplemagnetometer(vsm)试验(图8)表明qpeh/aox@mzif-8的饱和磁力强度为44.7emug-1。该磁力强度允许在外加磁铁的作用下，2min内完全从水悬液中回收qpeh/aox@mzif-8传感器(图8内插图)。
实施例3：qpeh/aox@mzif-8酶传感器检测aopp除草剂的性能评价
将5mgqpeh/aox@mzif-8分散在1mlnaac溶液(0.2m，ph4.0)中，加入1mlopd(1.0mm)和3ml不同浓度的精喹禾灵(qpe)、精恶唑禾草灵(fpe)或高效氟吡甲禾灵(hpe)溶液，然后在室温下避光孵育10min。用磁铁去除反应液中的qpeh/aox@mzif-8后，检测在450nm处的吸光值od450。如图9所示，在6.7～214.6μm、6.7～214.6μm和13.4～268.2μm较宽的浓度范围内，qpeh/aox@mzif-8传感器的od450与qpe、fpe或hpe的浓度之间都具有良好的线性关系，且可以通过肉眼观察到明显的颜色变化。根据方程：lod＝3σ/s(其中σ表示生物传感器响应值相对于空白的标准差，s表示校准曲线的斜率值)计算出三种除草剂的检测下限(lod)分别为8.2μm、6.5μm、11.5μm，完全可以满足这三种aopp除草剂低残留检测的要求。
生产qpe农药厂的工业废水和受qpe污染的土壤样品中的除草剂残留含量也通过传感器被测定。10g表层(0-20cm)土壤样品重悬于100mldi水中振摇15min，所获得的土壤悬液与工业废水12000rpm离心10min后，取4ml上清与1mlopd、1ml含有5mgqpeh/aox@mzif-8naac溶液在暗处反应10min后进行检测。同时，取土壤悬液和工业废水上清进行高效液相色谱(hplc)检测验证。如表1所示，qpeh/aox@mzif-8酶传感器比色法对真实环境样品中qpe残留的检测结果与hplc法高度一致，表明该传感器对qpe的检测快速、灵敏、准确。比色法检测的qpe浓度稍高于hplc结果，主要由于hplc检测过程中需要复杂的样品准备步骤，包括抽提和反复的溶解过程，都可能会导致qpe检测浓度偏低。
表1qpeh/aox@mzif-8酶传感器比色法和hplc法对qpe检测结果的比较
qpeh/aox@mzif-8酶传感器的长期储存稳定性被检测，结果显示(图10a)，4℃密闭保存50天，仍具有90％以上的催化活性，对214.6μmqpe检测的od450达到0.32左右，依然可以观察到明显的颜色变化。qpeh/aox@mzif-8酶传感器重复使用性结果显示(图10b)，通过外加磁铁回收重复使用5次催化活性几乎没有降低，重复使用12次后，仍具有85％以上的催化活性，对214.6μmqpe检测的od450达到0.3左右。该酶传感器的高稳定性、易回收性和可多次重复使用性大大降低了其使用成本，有利于其运输和大范围应用推广。
1.一种基于磁性纳米晶体酶制剂的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂比色检测方法，其特征在于：
通过一步合成法将磁性fe3o4纳米颗粒mnps、aopp除草剂水解酶qpeh、乙醇氧化酶aox同时包埋于zif-8晶体内，制备磁性纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8，将其作为生物酶传感器通过比色法检测环境样品中的aopp除草剂残留。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：磁性fe3o4纳米颗粒mnps的合成
在圆底烧瓶中加入6.5gfecl3·6h2o和3.342gfeso4·7h2o，完全溶解于去离子水中，将体系加热至50℃并在真空状态下搅拌30min，然后将12.5ml氨水快速加入体系中并升温至75℃，磁力搅拌1h，然后加入12.5ml1.5moll-1柠檬酸三钠，升温至85℃并搅拌1.5h，待反应完成后，收集fe3o4纳米粒子，然后依次用乙醇和去离子水洗涤，真空干燥；
步骤2：aopp除草剂水解酯酶qpeh的提取和纯化
将含有qpeh基因原核表达质粒pet-29a-qpeh的大肠杆菌bl21(de3)接种于10ml液体lb培养基中，37℃、220rpm下振荡培养过夜，然后按1％的量转接到2l液体lb培养基中，加入100μl卡那霉素在37℃、220rpm继续培养3h，使od600达到0.6，加入2mliptg后置于22℃、160rpm的恒温振荡培养箱中诱导过夜；将诱导培养后的菌液在7000g、4℃离心10min收集菌体，将菌体洗涤三次后用100mlph8.0的te缓冲液将菌体重悬，用ats高压均质机在4℃、800pa下破碎15min，然后在10000g、4℃离心20min，取上清进行蛋白纯化；
步骤3：纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8的合成
先配制0.4mol/l的zn(no3)2溶液和1.25mol/l的2-甲基咪唑溶液，将20mgmnps重悬于2ml去离子水di中，超声波脱气15min；酯酶qpeh、aox溶液分别稀释至终浓度15mg/ml和5mg/ml；将2mlmnps重悬液和10ml2-甲基咪唑溶液倒入烧杯中，立即加入1ml的zn(no3)2溶液和酯酶qpeh、aox溶液，室温下磁力搅拌30min，6000rpm室温离心10min，用50mmpbs洗涤沉淀，真空冷冻干燥即获得纳米晶体酶制剂qpeh/aox@mzif-8；
步骤4：aopp的检测
将qpeh/aox@mzif-8作为生物酶传感器通过比色法检测环境样品中的aopp除草剂残留。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤2中，酯酶qpeh的纯化过程包括如下步骤：
1)用10×柱体积ni-native-0缓冲液洗涤镍柱；
2)将2a提取的酯酶qpeh用0.45nm滤膜过滤，进一步去细胞碎片，防止堵塞镍柱，控制上柱的流速为0.5mlmin-1；
3)用20×柱体积ni-native-10缓冲液平衡镍柱，使其od280降到小于0.04，其流速为1.0ml/min；
4)分别依次用5×柱体积洗脱缓冲液ni-native-20、ni-native-50、ni-native-100、ni-native-250洗脱酯酶qpeh，流速为1.0mlmin-1，并依次收集不同浓度的qpeh洗脱液；
5)用15×柱体积、浓度为0.5mnaoh清洗树脂30min；
6)用10×柱体积、50mmpbs重新平衡树脂，并用25％的乙醇存储；
7)纯化后的酯酶qpeh，用te透析48h去除过多的离子和咪唑，再用peg20000浓缩至10ml；4℃保存，并用bradford法测定酯酶qpeh的蛋白浓度。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤4中，检测过程包括如下步骤：
首先将待测试样重悬于3ml去离子水di中，5000rpm离心2min去除固体颗粒后进行连续倍比稀释至10×、100×；然后分别与含有5mgqpeh/aox@mzif-8的1mlnaac溶液和1mlopd混合，在室温下避光孵育10min，用磁铁去除反应液中的qpeh/aox@mzif-8后，检测在450nm处的吸光值od450；选择在0.11-0.32范围内的吸光值根据od450与不同除草剂浓度的线性方程计算出相应除草剂的浓度值，从而获得待测样品中除草剂残留的浓度平均值。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤4中，检测过程包括如下步骤：
首先将待测试样重悬于3ml去离子水di中，5000rpm离心2min去除固体颗粒后进行连续倍比稀释至10×、100×；然后分别与含有5mgqpeh/aox@mzif-8的1mlnaac溶液和1mlopd混合，在室温下避光孵育10min，直接通过肉眼观察是否有颜色变化，若溶液反应后变为黄色即可判断待测样品中有aopp除草剂残留。
技术总结