爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物及其应用的制作方法

1.本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物及其应用。


背景技术：

2.病原真菌的次生代谢产物在真菌的寄生、致病和适应性中起重要的作用，也是药物和药剂开发的重要来源。爪哇棒束孢(isaria javanica)，原名爪哇拟青霉(paecilomyces javanicus)，隶属于盘菌亚门(pezizomycotina)粪壳菌纲(sordariomycetes)肉座菌目(hypocrellales)虫草科(cordycipitaceae)棒束孢属(isaria)。该菌广泛存在于昆虫栖息的生境及土壤中。爪哇棒束孢是重要的昆虫病原真菌，可寄生鳞翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目等昆虫，在害虫的防控中具有广阔的生防应用潜能。对爪哇棒束孢的基因组分析发现，爪哇棒束孢基因组中具有丰富的次生代谢基因簇，表明爪哇棒束孢能够产生丰富的次生代谢产物。在对爪哇棒束孢次生代谢化合物的分离、纯化和生物活性测定中，我们筛选出一种对细菌具有高杀菌活性的化合物，该化合物对昆虫肠道细菌及植物病原细菌都有很好的抑制效果，该化合物具有重要的开发和应用价值。
3.植物青枯病菌(pseudomonas solanacearum/ralstonia solanacearum)是一种重要的植物病原细菌，能引起番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科蔬菜及其它植物的青枯病，感病植株迅速萎蔫、枯死，茎叶仍保持绿色。植物青枯病是世界性的土传病害，防治难度大。目前的防治措施主要通过轮作、土壤改良和消毒等方法，开发新的有效的防控产品是当前生产上所急需的。本化合物有望开发成青枯病防治的新产品。


技术实现要素：

4.鉴于上述的分析，本发明通过从昆虫病原真菌爪哇棒束孢的大麦发酵产物中用乙酸乙酯提取，分离和纯化出一种主要次生代谢化合物，经分子结构鉴定为十九碳二烯酸(c
19
h
34
o2)，旨在提供爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物及其应用。本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的：
5.本发明提供了一种爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物，该次生代谢化合物为十九碳二烯酸，分子式为c
19
h
34
o2。
6.本发明还提供了一种爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，次生代谢化合物应用于抑制细菌。
7.进一步地，次生代谢化合物应用于抑制植物青枯病菌。
8.进一步地，次生代谢化合物对植物青枯病菌的最小抑菌浓度为25.6μg/ml。
9.进一步地，次生代谢化合物应用于抑制大肠杆菌。
10.进一步地，次生代谢化合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为51.2μg/ml。
11.进一步地，次生代谢化合物应用于抑制阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌。
12.进一步地，次生代谢化合物对阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌的最小抑菌浓度为12.8μg/ml。
13.进一步地，次生代谢化合物应用于抑制蒙氏肠球菌。
14.进一步地，次生代谢化合物对蒙氏肠球菌的最小抑菌浓度为6.4μg/ml。
15.与现有技术相比，本发明至少具有如下实用效果之一：
16.1、本发明的爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物，从昆虫病原真菌爪哇棒束孢中分离出杀细菌活性的次生代谢化合物：十九碳二烯酸；
17.2、本发明的爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物，该次生代谢化合物对多种昆虫肠道微生物具有明显的抑制作用，有可能作为药剂成分，用于动物肠道细菌病害的控制；
18.3、本发明的爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物，该次生代谢化合物对植物病原菌青枯病菌也有较好的抑制作用，有望开发成生防制剂，用于植物青枯病的防治。
19.本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分的特征和优点从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
20.附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。
21.图1为爪哇棒束孢(isaria javanica)的菌落、菌丝和孢子形态；
22.图2为爪哇棒束孢大麦培养基发酵产物乙酸乙酯粗提组分5(fr5)高效液相色谱分离峰图；
23.图3为单品fr5
‑
1核磁共振氢谱图(一次测试)；
24.图4为单品fr5
‑
1核磁共振碳谱图；
25.图5为单品fr5
‑
1核磁共振c
‑
h cosy谱图；
26.图6为单品fr5
‑
1核磁共振hsqc谱图；
27.图7为单品fr5
‑
1核磁共振hmbc谱图；
28.图8为单品fr5
‑
1核磁共振氢谱图(二次测试)；
29.图9为单品fr5
‑
1质谱图谱；
30.图10为次生代谢化合物十九碳二烯酸的结构式；
31.图11为次生代谢化合物fr5
‑
1对马铃薯块茎蛾幼虫优势肠道细菌蒙氏肠球菌(enterococcus mundtii)的抑菌活性测试结果：a
‑
测试结果图；b
‑
测试结果示意图；
32.图12为次生代谢化合物fr5
‑
1对6种不同昆虫肠道细菌的抑菌活性测试结果：a
‑
测试结果图；b
‑
测试结果示意图；
33.图13为次生代谢化合物fr5
‑
1对植物青枯病菌(pseudomonas solanacearum)的抑菌活性测试结果：a
‑
测试结果图；b
‑
测试结果示意图；
34.图14为次生代谢化合物fr5
‑
1对大肠杆菌(escherichia coli)的抑菌活性测试结果：a
‑
测试结果图；b
‑
测试结果示意图。
具体实施方式
35.下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本发明一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。
36.实施例1
37.爪哇棒束孢菌株ijb01(isaria javanica strain ijb01)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc3.18094。菌落形态、菌丝和分生孢子形态如图1。
38.实施例2
39.爪哇棒束孢菌株ijb01次生代谢化合物的分离、纯化与鉴定方法包括如下步骤：
40.s1：挑取少量爪哇棒束孢菌株ijb01的菌丝到100ml的syma种子培养液中，在27℃，150rpm振荡条件下培养5天，得到培养液；
41.s2：取1ml培养液接种到100ml大麦培养基上，发酵30天，得到固体发酵物；
42.s3：向固体发酵物中加入乙酸乙酯，优选的，固体发酵物与乙酸乙酯的体积比为1：2，示例性的，将200ml乙酸乙酯加入到上述大麦培养基中，捣碎，充分混匀，静置30min，超声30min，过滤获得乙酸乙酯提取液；再用旋转蒸发仪蒸干，称重后4℃保存；
43.s4：将获取的乙酸乙酯发酵物用不同比例的石油醚/乙酸乙酯/甲醇溶剂在硅胶柱中进行分离，共获28个组分，石油醚/乙酸乙酯/甲醇溶剂的具体成分配比以及相应的组分序号，得到的分离液重量如表1所示。将各组分分离液旋转蒸干，称重，4℃保存；
44.表1不同比例石油醚/乙酸乙酯/甲醇溶剂的组分序号及分离液重量
45.[0046][0047]
s5：将8％乙酸乙酯/石油醚分离获取的组分5(fr5，1069mg)用色谱柱agilent zorbax sb
‑
c18(5μm，9.4
×
250mm)进行液相分离；液相分离制备条件如表2所示：
[0048]
表2组分5(fr5，1069mg)的液相分离条件
[0049][0050]
具体的，分离条件为：乙腈(即mecn)含量为80％的水溶液中，该溶液的流速为1ml/min，经过19.8分钟后，分离出第一个组分，即fr5
‑
1(70.51mg)；经过20分钟后，分离出第二个组分，即fr5
‑
2(421.8mg)；经过27分钟后，分离出第三个组分，即fr5
‑
3(25.02mg)；经过27.5分钟后，分离出第四个组分，即fr5
‑
4(31.36mg)。也就是说，表1中，第一行(0分钟)为初始条件，第二行(19.8分钟)为分离出第一个组分fr5
‑
1(70.51mg)的条件，第三行(20分钟)为分离出第二个组分fr5
‑
2(421.8mg)的条件，第四行(27分钟)为分离出第三个组分fr5
‑
3(25.02mg)的条件，第五行(27.5分钟)为分离出第四个组分fr5
‑
4(31.36mg)的条件。
[0051]
s6：步骤s5中组分5(fr5，1069mg)分离得到4个单品，也就是4个次生代谢化合物，分离图谱如图3
‑
8所示，4个单品分别为：fr5
‑
1(70.51mg)，fr5
‑
2(421.8mg)，fr5
‑
3(25.02mg)和fr5
‑
4(31.36mg)。将4个单品分别用冷凝浓缩仪浓缩，得到干的物质单品，称重，然后置于
‑
20℃保存；
[0052]
s7：将分离得到的4个单品化合物用氘代氯仿(300ul)溶解，将溶解后的样品分别转移到核磁管中，用bruker avance
‑
500mhz核磁共振波谱仪进行氢谱、碳谱、1h
‑
1h cosy、hmbc和hsqc的测定，所得单体1(fr5
‑
1)的图谱如图3
‑
8所示；同时，用丙酮溶解微量分离得到的4个单品化合物，将溶解后的样品转移到液相小瓶中，用agilent accurate
‑
mass
‑
q
‑
tof lc/ms 6520液质联用仪进行低分辨质谱的测定，所得单体1(fr5
‑
1)的图谱如图9所示；
[0053]
s8：根据图3
‑
9的结构鉴定结果，fr5
‑
1化合物为：十九碳二烯酸(9，12
‑
nonadecadienoic acid)，结构式如图10所示，分子式为c
19
h
34
o2，分子量为：294.476，即得到次生代谢化合物十九碳二烯酸，其余3个单体为其衍生物。
[0054]
实施例3
[0055]
次生代谢化合物十九碳二烯酸的最小抑菌浓度测定方法，具体包括如下步骤：
[0056]
(1)将保存在
‑
80℃的马铃薯块茎蛾幼虫主要肠道细菌蒙氏肠球菌(enterococcus mundtii)在la培养基上划线，恢复菌落活性；
[0057]
(2)将步骤(1)中蒙氏肠球菌(enterococcus mundtii)的单个菌落接种至100ml的lb培养液中，在30℃，220rpm震荡条件下培养24h，得到蒙氏肠球菌液；
[0058]
(3)测定蒙氏肠球菌液od600，利用lb培养基将其od600调整为0.2；
[0059]
(4)按照蒙氏肠球菌液：lb培养基＝1：1000的比例将蒙氏肠球菌液加入lb培养液中，得到lb 菌液混合液；
[0060]
(5)将次生代谢化合物十九碳二烯酸(即fr5
‑
1)用二甲亚砜(dmso)溶解，配制成204.8ug/ml的溶液，充分溶解均匀。同时配制204.8ug/ml的氨苄青霉素(amp)溶液作为阳性对照；
[0061]
(6)取96孔板，在第1列中加入180μl步骤(4)中的lb 菌液混合液，在2至11列中加入100μl步骤(4)中的lb 菌液混合液，最后1列加入不含菌液100μl的lb培养液，作为阴性对照(ck
‑
)；
[0062]
(7)在96孔板的第1列中的6个孔中，分别加入20μl配制好的fr5
‑
1溶液、fr5
‑
2溶液、fr5
‑
3溶液、fr5
‑
4溶液、氨苄青霉素amp(样品浓度为204.8μg/ml)、二甲亚砜dmso溶剂，用排枪反复混匀后，吸取100μl加入下1列横向对应孔的菌液培养基中，依次重复以上操作，直至第10列。第11列孔中不做处理，即为步骤(4)中的lb 菌液混合液，作为菌液对照(ck )；
[0063]
(8)将处理完毕的96孔板放入30℃培养箱中培养8h，之后在每孔中加入10μlresazurin dye，混匀，避光染色30min。96孔板中的孔内如果有细菌生长(如ck )，则孔内呈红色；如果孔内无细菌生长(如ck
‑
)，则孔内呈蓝色；
[0064]
(9)试验结果如图11所示，填充阴影代表蓝色，说明孔内无细菌生长，即具有抑制细菌生长的效果；未填充阴影则代表红色，说明孔内有细菌生长，即不能抑制细菌生长。第一行中的孔内均添加次生代谢化合物fr5
‑
1，第一行的孔内多半填充阴影，即呈蓝色，表明此次生代谢化合物fr5
‑
1具有明显的抑制蒙氏肠球菌活性的作用，当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度稀释至6.4μg/ml时仍呈蓝色，而3.2μg/ml时呈红色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1的最小抑菌浓度为6.4μg/ml，其抑菌效果与氨苄青霉素相近，而第二行fr5
‑
2、第三行fr5
‑
3、第四行fr5
‑
4的小孔均未填充阴影，试验结果呈红色，说明fr5
‑
2、fr5
‑
3、fr5
‑
4均无抑菌活性。
[0065]
实施例4
[0066]
采用实施例3的方法测试次生代谢化合物fr5
‑
1对阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌共6种昆虫肠道菌的抑制效果。
[0067]
测试结果如图12所示，当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度大于等于12.8μg/ml时，则孔内填充阴影，说明孔内呈蓝色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1对阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌均具有抑制效果；当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度小于等于6.4μg/ml时，则孔内未填充阴影，说明孔内呈红色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1对阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌均不具有具有抑制效
果。
[0068]
可见，次生代谢化合物fr5
‑
1对阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌的最小抑菌浓度为12.8μg/ml。
[0069]
实施例5
[0070]
采用实施例3的方法测试次生代谢化合物fr5
‑
1对重要农作物病原菌植物青枯病菌(pseudomonas solanacearum)的抑制效果。
[0071]
测试结果如图13所示，当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度大于等于25.6μg/ml时，则孔内填充阴影，说明孔内呈蓝色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1对植物青枯病菌具有抑制效果；当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度小于等于12.8μg/ml时，则孔内未填充阴影，说明孔内呈红色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1对植物青枯病菌不具有抑制效果。
[0072]
可见，次生代谢化合物fr5
‑
1对植物青枯病菌的最小抑菌浓度为25.6μg/ml。
[0073]
实施例6
[0074]
采用实施例3的方法测试次生代谢化合物fr5
‑
1对大肠杆菌(escherichia coli)的抑制效果。
[0075]
测试结果如图14所示，当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度大于等于51.2μg/ml时，则孔内填充阴影，说明孔内呈蓝色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1对大肠杆菌(escherichia coli)具有抑制效果；当次生代谢化合物fr5
‑
1的浓度小于等于25.6μg/ml时，则孔内未填充阴影，说明孔内呈红色，说明次生代谢化合物fr5
‑
1对大肠杆菌(escherichia coli)不具有抑制效果。
[0076]
可见，次生代谢化合物fr5
‑
1对大肠杆菌(escherichia coli)的最小抑菌浓度为51.2μg/ml。
[0077]
本申请从昆虫病原真菌爪哇棒束孢的大麦发酵产物中用乙酸乙酯提取，分离和纯化出一种主要次生代谢化合物；经分子结构鉴定为十九碳二烯酸(c
19
h
34
o2)；生物活性测定显示，该化合物对昆虫(马铃薯块茎蛾)肠道细菌活性具有明显的抑制作用，最小抑菌浓度为6.4μg/ml；该次生代谢化合物对其它肠道菌及重要的农作物病原菌植物青枯病菌也有明显的抑制作用。该次生代谢化合物可用于药剂和生物制剂的开发，在动植物细菌病害的控制中具有广泛的应用潜能。
[0078]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物，其特征在于，该次生代谢化合物为十九碳二烯酸，分子式为c
19
h
34
o2。2.一种权利要求1所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物应用于抑制细菌。3.根据权利要求2所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物应用于抑制植物青枯病菌。4.根据权利要求3所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物对植物青枯病菌的最小抑菌浓度为25.6μg/ml。5.根据权利要求2所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物应用于抑制大肠杆菌。6.根据权利要求5所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为51.2μg/ml。7.根据权利要求2所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物应用于抑制阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌。8.根据权利要求7所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物对阿氏肠杆菌、鞘氨醇杆菌、葡萄球杆菌、代尔福杆菌、黄杆菌、假单胞菌的最小抑菌浓度为12.8μg/ml。9.根据权利要求2所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物应用于抑制蒙氏肠球菌。10.根据权利要求9所述爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物的应用，其特征在于，所述次生代谢化合物对蒙氏肠球菌的最小抑菌浓度为6.4μg/ml。
技术总结
本发明公开了爪哇棒束孢菌株的次生代谢化合物及其应用，该次生代谢化合物为十九碳二烯酸，分子式为C


技术研发人员：成新跃 邹曼凌
受保护的技术使用者：北京师范大学
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29