肉毒毒素的制造方法与流程

1.本发明涉及一种肉毒毒素的制造方法。
背景技术：
：：2.肉毒杆菌为形成芽孢的严格嫌气性革兰氏阳性杆菌，产生引起全身性麻痹的神经毒素(肉毒毒素)。由肉毒杆菌产生的肉毒毒素形成在神经毒成分ntx上结合有无毒成分的复合体。该复合体根据分子量的不同而被分类为ll毒素(900kda)、l毒素(500kda)、m毒素(300kda)。m毒素在ntx上结合有无毒性并且没有红细胞凝集活性的蛋白质(无毒性非ha蛋白质)即ntnh，l毒素在m毒素上结合有无毒性并且具有红细胞凝集活性的ha蛋白质，ll毒素结合有2分子l毒素。仅由ntx构成的毒素被称为s毒素(150kda)。仅由ntx构成的s毒素将复合体毒素供于碱条件并使ntx与ntnh解离，从而进行分离。3.肉毒毒素被分类为a～g型的血清型，进而在相同血清型的毒素中，根据毒素基因的结构的不同而被分类为几个亚型。例如a型肉毒杆菌被分类为a1型～a5型的亚型，a1型肉毒杆菌产生ll毒素、l毒素和m毒素，但a2型肉毒杆菌仅产生m毒素。b型、c型和d型肉毒杆菌产生ll毒素和m毒素。e型和f型肉毒杆菌仅产生m毒素，g型肉毒杆菌仅产生l毒素。4.肉毒毒素利用其神经阻断作用而在临床上被应用。作为适用例，可举出：脑中风后上肢/下肢痉挛、肌张力障碍、半侧面部痉挛、脑血管障碍后后遗症、美容整形等。5.从上述临床上的有用性出发，提出了各种由肉毒杆菌制造肉毒毒素的方法。在肉毒毒素的制造方法中，以往使用以下方法，利用酸处理肉毒杆菌培养后的培养基，从而使肉毒毒素进行酸沉淀，并对上述方法进行改良。例如，专利文献1记载了一种用于纯化非复合肉毒毒素的方法，其包含：将包含肉毒毒素的发酵培养物供于酸沉淀而得到酸沉淀物，得到被浓缩的酸沉淀物的样品；将样品供于核酸酶消化之后载入疏水性相互作用柱而捕捉肉毒毒素复合体；洗脱肉毒毒素复合体并使其解离，得到包含粗非复合肉毒毒素的混合物；以及供于阴离子交换柱和阳离子交换柱。另外，专利文献2公开了一种肉毒毒素的制造方法，其包含：利用酸处理肉毒毒素生产菌株培养液，使肉毒毒素进行酸沉淀的工序；在沉淀的肉毒毒素中添加缓冲溶液之后，提取利用蛋白酶抑制剂和核酸分解酶进行处理的肉毒毒素的工序；利用酸处理提取的肉毒毒素而使肉毒毒素进行酸沉淀之后，使沉淀物溶解于缓冲溶液的工序；以及利用阴离子交换色谱纯化肉毒毒素的工序。6.另一方面，在肉毒毒素的制造方法中，也可采用不进行上述的酸沉淀的方法。例如，专利文献3公开了一种得到a型肉毒杆菌神经毒素复合体的工艺，其包含：培养和发酵肉毒杆菌的步骤；除去存在于发酵培养基的细胞残屑而采取发酵培养基的步骤；使采取的培养基与阴离子交换介质接触而捕捉肉毒杆菌神经毒素的步骤；使从阴离子交换介质洗脱的洗脱液与阳离子交换介质接触的步骤。另外，专利文献4公开了一种肉毒毒素的制造方法，其包含：通过膜过滤法从肉毒杆菌培养液除去肉毒杆菌菌体的工序；将除去肉毒杆菌菌体的肉毒毒素溶液在阴离子交换色谱柱中展开的工序；将阴离子交换色谱柱的回收级分在阳离子交换色谱柱中展开而使肉毒毒素成分吸附的工序；以及洗脱肉毒毒素的工序。现有技术文献专利文献7.专利文献1：日本特表2013‑508388号公报专利文献2：日本特表2016‑521968号公报专利文献3：日本特表2012‑532932号公报专利文献4：日本特开2011‑74025号公报技术实现要素：发明所要解决的问题8.在进行酸沉淀的肉毒毒素的制造方法中，在酸沉淀物中细胞成分(菌体成分)和核酸成分共沉淀，通过对该酸沉淀物进行核酸酶消化，核酸成分被片段化。应予说明，通过酸沉淀使菌体暴露于酸性条件，从而使毒素从菌体溶出，该毒素也与菌体成分以及核酸成分一起沉淀。片段化的核酸成分和细胞成分通过其后的使用色谱等的纯化操作而被除去。但是，使用酸沉淀的方法设想存在以下风险等：酸沉淀的操作繁琐；在与肉毒毒素一起片段化的核酸成分和细胞成分(菌体成分)大量共存的状态下供于纯化，因此色谱等中的分离不敏锐且分离性能低；以及对夹杂物大量共沉淀的不溶物进行核酸酶消化而残存未消化的核酸。另一方面，在不进行酸沉淀的肉毒毒素的制造方法中，使用阴离子交换柱色谱进行核酸除去。但是，使用基于阴离子交换柱色谱的核酸除去的方法也因毒素和核酸这两者吸附于阴离子交换载体而在毒素的收率反面存在限制，另外，得到的毒素的比活性也不能达到可满足的水平。9.因此，本发明的目的在于，提供一种简便且毒素收率高、且可得到比活性高的毒素的肉毒毒素的制造方法。用于解决问题的技术方案10.本发明人进行深入研究，结果发现：迄今为止通过对从肉毒杆菌培养发酵物除去菌体成分得到的肉毒毒素混合物实施仅对菌体成分与肉毒毒素不可避免地共存的酸沉淀物适用的核酸酶处理，既不使用酸沉淀，也不使用用于核酸除去的阴离子交换色谱，可制造毒素收率高且比活性高的肉毒毒素。本发明是基于该见解并进一步重复进行研究从而完成的发明。11.即，本发明提供以下揭示的方式的发明。项1.一种肉毒毒素的制造方法，其包含：(a)在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自上述肉毒毒素的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a的工序；(b)将上述混合物a供于上述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b的工序；(c)在上述混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c的工序；(d)将上述混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d的工序。项2.根据项1记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(c)工序中，上述核酸内切酶为源自粘质沙雷氏菌serratiamarcescens的核酸内切酶。项3.根据项1或2记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在ph5.8～6.5的条件下进行上述(c)工序。项4.根据项1～3中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(c)工序中，多次添加上述核酸内切酶。项5.根据项1～4中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(d)工序中，上述核酸分解物的除去包含使用膜的除去。项6.根据项1～5中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，上述肉毒毒素的制造方法还包含：(e)将上述肉毒毒素分离液d供于阳离子交换色谱，得到肉毒毒素复合体的纯化物的工序。项7.根据项6记载的肉毒毒素的制造方法，其中，上述肉毒毒素的制造方法还包含：(f)将上述肉毒毒素复合体的纯化物在无毒性非ha蛋白质从上述肉毒毒素复合体中解离的条件下供于阴离子交换色谱，得到肉毒毒素非复合体的纯化物的工序。项8.根据项1～7中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，至少上述(a)工序包含预培养工序和主培养工序，至少上述预培养工序在静置培养下进行。项9.根据项1～8记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在静置培养下进行上述预培养工序和上述主培养工序这两者。项10.根据项8或9记载的肉毒毒素的制造方法，其中，上述(a)工序依次包含：(a1)在ph6.8～8.0的培养基中进行上述肉毒毒素产生菌的菌体增殖的工序；(a2)在ph5.0～6.5的培养基中进行上述肉毒毒素产生菌的发酵的工序。项11.根据项1～10中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(a)工序中，上述肉毒毒素产生菌为以芽孢的形态保存的菌体的萌发体。项12.根据项1～11中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(b)工序中，上述菌体成分的除去包含过滤器过滤。项13.根据项7～12中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(f)工序中，上述条件为ph7.3～8.5。项14.根据项7～13中任一项记载的肉毒毒素的制造方法，其中，在上述(f)工序中，阴离子交换色谱为弱阴离子交换色谱。项15.一种纯化肉毒毒素，其特征在于，上述纯化肉毒毒素的比活性为3.0×107u/mg以上。项16.一种纯化肉毒毒素，其特征在于，特征在于，上述纯化肉毒毒素通过项1～14中任一项记载的肉毒毒素的制造方法制造。发明效果12.根据本发明，能够实现简便、毒素收率高、且可得到比活性高的毒素的肉毒毒素的制造。附图说明13.图1表示显示实施例1中的肉毒毒素纯化的电泳凝胶的染色图像。图2表示显示比较例1中的肉毒毒素纯化的电泳凝胶的染色图像。图3表示显示实施例2中的肉毒毒素纯化的电泳凝胶的染色图像。图4表示显示实施例3中的肉毒毒素纯化的电泳凝胶的染色图像。具体实施方式14.本发明的肉毒毒素的制造方法包含：(a)在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自上述肉毒毒素的菌体成分及核酸成分和肉毒毒素的混合物a的工序；(b)将上述混合物a供于上述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b的工序；(c)在上述混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c的工序；(d)将上述混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d的工序。此外，本发明的肉毒毒素的制造方法可以包含：(e)将上述肉毒毒素分离液d供于阳离子交换色谱，得到肉毒毒素复合体的纯化物的工序；或者，进一步(f)将上述肉毒毒素复合体的纯化物在无毒性非ha蛋白质从上述肉毒毒素复合体解离的条件下供于阴离子交换色谱，得到肉毒毒素非复合体的纯化物的工序。15.本发明中的肉毒毒素，作为血清型，可举出a型、b型、c型、d型、e型、f型和g型的血清型。另外，在肉毒毒素中可包含肉毒毒素复合体和肉毒毒素非复合体。肉毒毒素复合体，可举出ll毒素(900kda)、l毒素(500kda)和m毒素(300kda)。另外，肉毒毒素非复合体是指仅由ntx构成的s毒素(150kda)。ntx具有50kda的轻链和100kda的重链介由二硫醚而结合的双链碎片结构。16.(a)来自肉毒毒素产生菌中的肉毒毒素的产生在(a)工序中，在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自上述肉毒毒素的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a。17.作为本工序中产生的肉毒毒素，可举出天然肉毒毒素和修饰肉毒毒素。修饰肉毒毒素是指：与天然肉毒毒素相比，其氨基酸中的至少1个被缺失、修饰、附加、插入或替换的肉毒毒素。修饰肉毒毒素可以为重组产生的神经毒。修饰肉毒毒素只要具有结合于肉毒毒素受体的能力、阻碍来自神经元的神经传递物质的释放的能力等的天然肉毒毒素的生物学活性中的至少1个即可。作为修饰肉毒毒素的实例，可举出具有源自肉毒毒素血清型(血清型a等)的轻链和源自不同的肉毒毒素血清型(血清型b等)的重链的肉毒毒素。另外，在本工序中，可以产生1种肉毒毒素，也可以产生多种肉毒毒素。从纯化效率等观点出发，优选产生1种肉毒毒素。18.肉毒毒素产生菌(以下，也记为肉毒杆菌)为产生上述肉毒毒素的菌即可，例如可举出肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)及其重组体。更具体而言，可举出产生ll毒素、l毒素和m毒素的a1型肉毒杆菌；仅产生m毒素的a2型肉毒杆菌；产生ll毒素和m毒素的b型、c型和d型肉毒杆菌；仅产生m毒素的e型和f型肉毒杆菌；以及仅产生l毒素的g型肉毒杆菌。优选举出仅产生m毒素的a2型、e型和f型肉毒杆菌，更优选举出a2型肉毒杆菌。具体而言，作为a2型肉毒杆菌株，可举出婴儿肉毒中毒综合征病原菌，更具体而言，可举出kyoyo‑f、chiba‑h、y‑8036、7i03‑h、7i05‑h、kz1828等，优选举出chiba‑h。另外，肉毒毒素产生菌优选为以芽孢的形态保存的肉毒杆菌体的萌发体。由此，作为种子菌株的稳定性提高，可高效产生毒素。19.作为在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素的方法，可以使用任意的方法。例如可举出sakaguchi等的方法(sakaguchig.,biomedicalaspectsofbotulism:purificationandoraltoxicitiesofclostridiumbotulinumprogenitortoxins.,21‑34,lewisge.,1981,academicpress,newyork)。在(a)工序中，可包含预培养工序和主培养工序。预培养工序优选可通过静置培养而进行，主培养工序优选可通过搅拌培养或静置培养进行。进一步优选可在静置培养下进行预培养工序和主培养工序这两者。20.预培养工序为进行菌体的扩大培养的工序，主培养工序为进行菌体的生产培养的工序。主培养工序优选依次包含：(a1)进行肉毒毒素产生菌的菌体增殖的工序；(a2)进行肉毒毒素产生菌的发酵的工序。在(a2)工序中，进行肉毒毒素的溶出(溶菌)和菌的增殖这两者。21.此外，从更良好进行菌的增殖的观点出发，(a1)工序中的培养基的ph优选为6.8～8.0。具体而言，准备调整为ph7.0～8.0，优选为ph7.1～8.0，更优选为ph7.2～8.0，进一步优选为ph7.2～7.8的培养基，可使用该培养基开始(a1)工序。22.另外，从更良好进行肉毒毒素的溶出(溶菌)和菌的增殖的观点出发，(a2)工序中的培养基的ph优选为5.0～6.5。23.作为在(a2)工序中调整为上述ph的方法的示例，可举出以下方法，通过在(a2)工序中将ph调整剂添加于培养基而人为降低ph。人为降低ph的操作可在确认基于(a1)工序的菌的增殖达到峰值之后进行。上述人为降低ph的方法优选在搅拌培养的情况下进行。24.作为在(a2)工序中调整为上述ph的方法的其它例，可举出利用以下现象的方法，从(a1)工序开始不人为控制，ph自然下降。利用ph自然下降的现象的调整，可优选在静置培养的情况下进行。应予说明，在通过ph自然下降而从(a1)工序转移至(a2)工序的情况下，(a)工序进行和结束的确认可通过确认培养基的ph优选下降至5.5～6.5来进行。25.(a)工序中使用的培养基没有特别限定，可由本领域技术人员适当选择。优选培养基包含植物性胨和源自动物的胨中的至少任一种。植物性胨为从植物中得到的蛋白质的分解产物，可举出源自豌豆、大豆、棉籽、小麦谷蛋白等的物质，优选举出源自豌豆的胨。源自动物的胨为源自动物组织的蛋白质分解产物，可举出源自猪、牛、羊等的胨，优选举出源自猪的胨。作为预培养工序中使用的培养基中的植物性胨和源自动物的胨的总含量，例如可举出1～12w/v％，优选为2～10w/v％，作为主培养工序中使用的培养基中的植物性胨和源自动物的胨的总含量，优选少于预培养工序中使用的培养基中的植物性胨和源自动物的胨的总含量，例如作为植物性胨和源自动物的胨的总含量，可举出0.1～5w/v％，优选1～3w/v％。应予说明，本说明书中，单位“w/v％”是指第十七改正日本药典中的质量相对于容量的百分率。26.另外，在培养基中，可包含碳源和培养基还原剂。作为碳源，可举出单糖(例如，葡萄糖、果糖等)、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖等)、低聚糖、多糖(例如，糊精、环糊精、淀粉等)或糖醇(例如，木糖醇、山梨糖醇、赤藓醇等)，优选举出单糖，更优选举出葡萄糖。作为培养基还原剂，可举出硫代乙醇酸钠、半胱氨酸、l‑抗坏血酸钠等，优选举出硫代乙醇酸钠。27.在(a)工序结束时的培养基中，产生肉毒毒素产生菌的肉毒毒素与源自肉毒毒素产生菌的菌体成分和核酸成分共存。因此，通过(a)工序，可得到包含源自肉毒毒素产生菌的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a。在混合物a中，除菌体成分、核酸成分和肉毒毒素外，也包含培养基成分。28.(b)菌体成分的除去在(b)工序中，将(a)工序中得到的混合物a供于上述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b。在本发明中，例如，不进行由酸沉淀这样的混合物a使菌体成分和核酸成分与肉毒毒素同时沉淀的方法，也不进行先除去核酸成分的方法。因此，本发明不需要酸沉淀等沉淀处理这样繁琐的操作。另外，由于不进行酸沉淀，因此肉毒毒素的损失少，可实现优异的收率。此外，由于肉毒毒素不暴露于强的酸性条件，因此可良好保持肉毒毒素的毒素活性。应予说明，在本发明中，在进行基于(b)工序的菌体成分的除去之前，也不进行在混合物a中添加核酸酶。29.作为用于除去菌体成分的方法，没有特别限定，具体而言，只要是具有与通过孔径为0.22μm以下的过滤器过滤混合物时的溶出液同等以上的菌体成分的分离能力的方法即可。即，作为本发明中菌体成分的除去的除去精度，至少满足与通过孔径为0.22μm以下的过滤器实现的情况同等以上的除去精度即可。30.作为用于除去菌体成分的方法的更具体的示例，例如可举出过滤器过滤、离心分离、膜过滤，优选举出过滤器过滤。作为用于过滤器过滤的过滤器的孔径，例如可举出10μm以下。过滤器过滤使用孔径不同的过滤器，可以经过多个阶段而进行，以使得供给过滤对象的过滤器的孔径阶段性地变小。此时，过滤器过滤可经过2～4阶段，优选3～4阶段而进行。在将过滤器过滤经过多个阶段而进行的情况下，从进一步适当除去菌体成分的观点出发，最终阶段中使用的过滤器的孔径优选为0.22μm以下。作为使用的过滤器的材质，可举出纤维素、珠光体、树脂、硅藻土、聚醚砜、醋酸纤维素、聚偏二氟乙烯等。31.(b)工序除去的物质主要是菌体成分。另外，在(b)工序中，也可以与菌体成分一起部分除去核酸成分。在进行过滤器过滤的情况下，菌体成分滞留在过滤器上，将溶出液作为混合物b进行回收。32.如此通过从混合物a除去菌体成分，可得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b。另外，混合物b可以适当作为浓缩的物质得到。例如，可以将通过上述过滤器的溶出液进一步浓缩而得到。作为浓缩的方法，没有特别限定，优选举出膜浓缩。此时，优选使用超滤膜，利用磷酸缓冲液、mes缓冲液等可溶解肉毒毒素的缓冲液进行缓冲液置换。作为超滤膜的孔径(级分分子量)，可举出20～40kda，优选25～35kda。33.混合物b除去有菌体成分，可作为实质上澄清的液体而得到。更优选混合物b能够以核酸成分和肉毒毒素与上述缓冲液一起包含的方式得到。另外，在混合物b中，也可继续包含上述培养基成分。34.(c)核酸内切酶处理在(c)工序中，在混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c。如上述所示，在本发明中，不进行以下方法，在肉毒毒素的制造中通常进行的使菌体成分和核酸成分与肉毒毒素一起沉淀的酸沉淀等方法。首先，为了除去核酸成分，在预先除去菌体成分的混合物b中添加核酸内切酶。通过核酸内切酶的作用，混合物b中的核酸成分片段化，产生核酸分解物。由此，即使不使用阴离子交换柱色谱，也可在后述的(d)工序中以优异的效率除去核酸分解物(除去核酸种，使得残存的核酸种进一步变少)。另外，在本发明中，由于混合物b预先除去菌体成分，因此，不受菌体成分干扰，核酸内切酶容易对核酸成分发挥作用。因此，也可抑制未消化核酸的残存而有效片段化。这一点也有助于在后述的(d)工序中以优异的效率除去核酸分解物。35.作为核酸内切酶，可以没有特别限制地使用具有核酸内切酶活性的酶。另外，成为核酸内切酶的基质的核酸成分可举出dna和rna，优选举出可分解dna和rna这两者的酶。作为具体的核酸内切酶，可举出源自希瓦氏菌(shewanellasp.)的核酸内切酶、源自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的核酸内切酶、源自粘质沙雷氏菌serratiamarcescens的核酸内切酶，在这些核酸内切酶中，特别优选源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶。36.作为源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶的具体例，可举出benzonase(merckkgaa注册商标)、denarase(c‑lectagmbh注册商标)和kaneka核酸内切酶(kaneka公司制造)，优选举出benzonase和denarase，更优选举出benzonase。与通常的核酸内切酶相比，源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶的最适ph高，具体而言为7.5～9.2左右。更具体而言，benzonase的最适ph为8.0～9.2，denarase的最适ph为8.0～9.0，kaneka核酸内切酶的最适ph为7.5～9.0。37.在(c)工序中，从抑制肉毒毒素的解离和/或分解的观点出发，优选在以下条件下使核酸内切酶发挥作用，优选为ph5.8～6.5，更优选为ph5.9～6.3。在使用上述优选的核酸内切酶即源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶的情况下，虽然远远偏离上述最适ph，但优选在上述ph条件下发挥作用。在本发明中，即使使源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶在ph5.8～6.5的条件下发挥作用，也可在后述的工序(d)中有效除去核酸成分。38.在(c)工序中，作为在混合物b中添加核酸内切酶的次数，没有特别限定，可以为1次，也可以为多次。在使用源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶的情况下，从将核酸更有效片段化的观点出发，优选多次添加。可优选添加该核酸内切酶2～4次，更优选2～3次。作为多次添加的各次的添加时机，没有特别限制，例如能够以1～12小时，优选2～9小时，进一步优选3～7小时的间隔添加。应予说明，作为使核酸内切酶发挥作用的温度，例如可举出25～40℃，优选28～38℃。另外，作为核酸内切酶处理的总时间，例如可举出10～24小时，优选12～20小时。应予说明，在使用源自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶的情况下，可以重复多次上述(c)工序和后述的(d)工序这一系列工序。此时，在每1次的(c)工序中，在混合物b中添加核酸内切酶的次数优选位1次。作为重复(c)工序和(d)工序这一系列工序时的具体的重复次数，例如可举出2～4次，优选2～3次。例如，在重复2次该一系列工序的情况下，本发明依次包含(a)工序、(b)工序、(c)工序、(d)工序、(c)工序、(d)工序。39.如此通过对混合物b进行核酸内切酶处理，可得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c。另外，为了除去未完全分解的核酸等，混合物c可以适当以经过过滤器过滤等过滤处理的滤液的形式得到。具体而言，混合物c能够以与核酸分解物和肉毒毒素一起包含核酸内切酶残渣和缓冲液的方式得到。另外，混合物c也可继续包含上述培养基成分。40.(d)核酸分解物的除去在工序(d)中，将混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d。作为除去核酸分解物的方法，只要是可分离核酸分解物和肉毒毒素的方法，就没有特别限定，不使用阴离子交换载体。在使用阴离子交换载体的情况下，毒素收率存在限制，不仅最初在捕捉毒素和核酸种这两者之后以ph梯度洗脱使毒素洗脱的情况，而且在最初仅捕捉核酸种不捕捉毒素而洗脱的情况下，毒素的回收也变得不充分。另外，如果使用阴离子交换载体，则也不能得到比活性充分的毒素。此外，如果使用阴离子交换载体，则操作员的操作时间长，污染的机会也增加。因此，在本发明中，从毒素收率、毒素的比活性、操作性等观点出发，核酸分解物的除去不使用阴离子交换载体。41.另外，在本发明中，不进行酸沉淀等从混合物a使菌体成分和核酸成分与肉毒毒素一起沉淀的处理，且在除去菌体之后分解残存核酸成分，因此，在供于肉毒毒素的分离的对象(本发明中为混合物c)中，应除去的夹杂物少且也低分子化。因此，可分离性能良好地进行夹杂物(即核酸分解物)的除去。42.作为除去核酸分解物的方法，以不使用阴离子交换载体为限度，可以没有特别限制地使用可分离核酸分解物和肉毒毒素的方法。具体而言，可举出使用膜的除去，优选举出膜过滤。由此，可使核酸分解物等低分子物质进行膜透过，与没有膜透过的肉毒毒素分离。作为使用膜的除去中使用的膜的孔径，作为级分分子量，例如可举出20～40kda，优选25～35kda。作为膜分离液，优选使用磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等可溶解肉毒毒素的缓冲液。43.如此通过从混合物c除去核酸分解物，可得到良好除去核酸等夹杂物的肉毒毒素分离液d。肉毒毒素分离液d中的肉毒毒素以维持在(a)工序中产生的形态的状态得到。例如，在(a)工序中将a1型肉毒杆菌用作肉毒毒素产生菌的情况下，(d)工序中得到的肉毒毒素分离液d中的肉毒毒素以ll毒素、l毒素和m毒素的形态包含，在(a)工序中将a2型肉毒杆菌用作肉毒毒素产生菌的情况下，(d)工序中得到的肉毒毒素分离液d中的肉毒毒素以m毒素的形态包含。肉毒毒素分离液d能够以澄清的液体的形式得到。更优选肉毒毒素分离液d能够以与上述的缓冲液一起包含肉毒毒素的方式得到。另外，在肉毒毒素分离液d中，也存在继续包含上述培养基成分的情况。44.肉毒毒素分离液d可进一步供于能够纯化肉毒毒素的任意的纯化工序。作为肉毒毒素纯化的方法，没有特别限定，本领域技术人员可根据肉毒毒素的形态而适当选择。从得到优异的纯度的观点出发，可举出基于柱色谱的纯化，更优选举出离子交换柱色谱。离子交换柱色谱的具体方法可根据肉毒毒素的ph依赖性而适当确定。应予说明，肉毒毒素具有以下性质：在酸性条件，优选ph4.0～5.0，优选ph4.0左右形成阳离子，在ph7.0以上，优选ph7.5左右形成阴离子。另外，肉毒毒素复合体具有以下性质：在弱酸性条件，优选ph5.5～6.5，优选ph6.0左右以复合体的形式稳定存在，通过ph上升，例如ph7.3～8.0，解离而形成非复合体。优选举出以下基于(e)工序的肉毒毒素复合体的纯化，或者，进一步基于以下(f)工序的肉毒毒素非复合体的纯化。45.(e)肉毒毒素复合体的纯化在(e)工序中，将肉毒毒素分离液d供于阳离子交换色谱，得到肉毒毒素复合体的纯化物。肉毒毒素复合体在酸性条件下形成阳离子，因此基于阳离子交换色谱的纯化，在能够稳定捕捉肉毒毒素复合体并纯化方面优异。另外，基于阳离子交换色谱的纯化在在能够抑制肉毒毒素复合体的解离的ph条件下纯化方面也优异。46.阳离子交换载体可预先利用优选ph4.0～4.5，作为具体例的ph4.2的缓冲液进行平衡化。作为用于该平衡化的缓冲液的盐浓度，例如为0.3mol/l以下，优选为0.2mol/l以下，作为具体例可举出0.2mol/l。作为缓冲液的种类，没有特别限定，例如可举出醋酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甲酸缓冲液、巴比妥酸缓冲液，优选举出醋酸缓冲液。通过将肉毒毒素分离液d供于如此平衡化得到的阳离子交换载体，使阳离子交换载体捕捉肉毒毒素(肉毒毒素复合体)。47.捕捉到的肉毒毒素(肉毒毒素复合体)的洗脱可以通过以下方法进行，使与用于平衡化的缓冲液相同的缓冲液在从用于平衡化的缓冲液的盐浓度至例如0.5～0.8mol/l，作为具体例的0.7mol/l的梯度条件下流动。由此，可将纯化的肉毒毒素复合体作为洗脱物得到。48.作为阳离子交换载体，没有特别限定，例如可举出spsepharosefastflow(gehealthcare)、cmsepharosefastflow(gehealthcare)、ssepharosefastflow(gehealthcare)、sptoyo‑pearl(东曹)等市售的阳离子交换树脂。缓冲液中的盐的种类没有限定，以离子强度达到相当于上述浓度的氯化钠的浓度的方式使用即可。作为缓冲液中的盐，优选举出氯化钠。49.通过如此使用阳离子交换色谱的纯化，可得到肉毒毒素复合体。肉毒毒素复合体，为了使其稳定化，根据需要可将ph调整为5.5～6.5，作为具体例为ph6.0。根据需要，也能够以进行浓缩和过滤等处理的物质的形式得到。作为浓缩的具体方法，可选自上述(b)工序中叙述的方法。作为过滤的具体方法，可举出为了灭菌或最终过滤而使用的方法，例如可举出使用孔径0.15～0.3μm，作为具体例为0.22μm的过滤器的方法。另外，在以肉毒毒素复合体的形态提供肉毒毒素制剂的情况下，在过滤之前，还可以配合保存剂等添加物。50.(f)肉毒毒素非复合体的纯化在(f)工序中，将肉毒毒素复合体的纯化物在无毒性非ha蛋白质从肉毒毒素复合体解离的条件下供于阴离子交换色谱，得到肉毒毒素非复合体的纯化物。51.肉毒毒素复合体的纯化物在供于阴离子交换色谱之前，可以预先供于无毒性非ha蛋白质从肉毒毒素复合体解离的条件。作为无毒性非ha蛋白质从肉毒毒素复合体解离的条件，优选为ph7.3～8.5，更优选为ph7.4～8.0，作为具体例可举出7.5。温度优选为10℃以下。具体而言，使用超滤膜。利用调整为上述ph的盐浓度为0.1mol/l以下，优选0.05mol/l以下的磷酸缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液等缓冲液，优选磷酸缓冲液进行缓冲液置换，从而使无毒性非ha蛋白质解离。作为超滤膜的孔径(级分分子量)，可举出5～30kda，优选为8～20kda，更优选为9～15kda。52.阴离子交换载体可预先利用调整为无毒性非ha蛋白质从肉毒毒素复合体解离的条件(优选ph7.3～8.5，作为具体例为ph7.5)的缓冲液进行平衡化。另外，作为用于上述平衡化的缓冲液的盐浓度，可举出0.1mol/l以下，优选为0.05mol/l以下。作为缓冲液的种类，没有特别限定，例如可举出磷酸缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液，优选举出磷酸缓冲液。将肉毒毒素复合体的纯化物或预先将其供于无毒性非ha蛋白质解离的条件而得到的处理物供于如此平衡化的阴离子交换载体，从而捕捉通过接触环境的ph进行阴离子化的肉毒毒素(肉毒毒素非复合体)。53.捕捉的肉毒毒素非复合体的洗脱，可通过以下方法进行，使与用于平衡化的缓冲液相同的缓冲液，在从用于平衡化的缓冲液的盐浓度至例如0.1～0.5mol/l，优选0.2～0.4mol/l，作为具体例为0.3mol/l的梯度条件下流动。由此，能够以洗脱物的形式得到纯化的肉毒毒素非复合体。54.应予说明，解离的无毒性非ha蛋白质也可被载体捕捉，但可通过以下方法与肉毒毒素非复合体分离利用，即，利用洗脱时机因流动相的盐浓度梯度等不同等的方法。55.作为阴离子交换载体，没有特别限定，从通过更容易进行肉毒毒素非复合体的洗脱而更容易进行分离肉毒毒素非复合体和解离的无毒性非ha蛋白质的观点出发，优选为弱阴离子交换载体。例如可举出deaesepharosefastflow(gehealthcare)、deaetoyo‑pearl(东曹)、diaionwa10(三菱化学)、fractogeldeae(默克)等的市售阴离子交换树脂。缓冲液中的盐的种类没有限定，以离子强度达到相当于上述浓度的氯化钠的浓度的方式使用即可。作为缓冲液中的盐，优选举出氯化钠。56.这样通过使用有阴离子交换色谱的纯化，可以得到肉毒毒素非复合体。肉毒毒素非复合体也可以根据需要作为进行浓缩和/或过滤等的处理的物质得到。另外，为了将肉毒毒素非复合体作为肉毒毒素制剂提供，可以进一步配合保存剂等添加物。作为浓缩及过滤的具体的方法。可以在上述的(e)工序中从叙述的方法中选择。57.纯化肉毒毒素本发明的方法中得到的肉毒毒素的纯化体(也记为纯化肉毒毒素)的比活性优异。作为具体的比活性，例如可举出3.0×107u/mg以上，优选为4.0×107u/mg以上、更优选为5.0×107u/mg以上，进一步优选为6.0×107u/mg以上，进一步优选为7.0×107u/mg以上，更进一步优选为8.0×107u/mg以上，特别优选为9.0×107u/mg以上，最优选为10.0×107u/mg以上。58.在此，比活性为每蛋白质1mg的效价(u/mg)。此处所谓的效价为通过小鼠腹腔内给药法算出的对小鼠的致死活性(基于腹腔内给药的ld50值)，为1u＝1ld50。另外，效价可以利用小鼠的尾静脉给药法算出。基于小鼠尾静脉给药法的纯化肉毒毒素的效价测定法为通常使用的小鼠腹腔内给药法的代替法，可将高浓度的纯化肉毒毒素给药于小鼠的尾静脉并研究存活时间，由预先验证的小鼠的存活时间和基于腹腔内给药的ld50值的回归直线算出效价。蛋白质可通过紫外吸收测定法(280nm)、lowry法或bca法等测定。作为比活性的具体测定方法，例如在以液体(肉毒毒素液)的形式得到肉毒毒素的情况下，测定每肉毒毒素液1ml的ld50值(u)，将得到的测定值除以该肉毒毒素液1ml中的蛋白质量(mg)而导出。59.肉毒毒素制剂通过本发明的制造方法得到的纯化肉毒毒素作为肉毒杆菌制剂的有效成分是有用的。作为肉毒杆菌制剂的用途，可举出临床上被应用的所有用途，例如可举出脑中风后上肢/下肢痉挛、肌张力障碍、半侧面部痉挛、脑血管障碍后后遗症、美容整形等。60.肉毒杆菌制剂在有效成分即纯化肉毒毒素中可以包含药学上可接受的追加成分。作为上述追加成分，可举出赋形剂、稳定化剂、缓冲剂等，作为赋形剂，可举出蔗糖、海藻糖、乳糖、多聚糖等，优选举出蔗糖。作为稳定化剂，可举出人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、辛酸、乙酰基色氨酸、氯化钠、聚山梨酯‑80、辛酮酸、精氨酸(l‑精氨酸盐酸盐)等，优选举出重组人血清白蛋白、l‑精氨酸盐酸盐。作为缓冲剂，可举出磷酸二氢钠水合物、磷酸氢二钠水合物等。作为上述追加的成分，可使用1种或多种。61.作为肉毒杆菌制剂的形态，没有特别限定，可以为液体，也可以为固体。固体的肉毒杆菌制剂可以为液体制剂的冻干物、真空干燥物或喷雾干燥物，使用时，可以溶于食盐水或水而复原为液体制剂。实施例62.以下，举出实施例和比较例，对本发明详细进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。63.[试验例1][1]肉毒毒素的制造[0064]＜实施例1＞按照以下顺序制造肉毒毒素。(a)肉毒杆菌的产生进行包含静置培养1和静置培养2的预培养工序、以及包含基于搅拌培养形成的菌体增殖阶段和发酵阶段的主培养工序。即，进行预培养工序和(a1)主培养工序的菌体增殖阶段之后，进行(a2)主培养工序的发酵阶段。[0065]在静置培养1中，在包含bactoproteosepeptoneno.3(猪蛋白胨，becton‑dickinson公司制造)(终浓度8w/v％)、酵母提取物(终浓度1w/v％)、硫代乙醇酸钠(终浓度0.025w/v％)和葡萄糖(终浓度0.5w/v％)的、调整为ph7.3的培养基20ml中，播种由芽孢状态的婴儿肉毒中毒综合征病原菌chiba‑h(a2型肉毒杆菌chiba‑h株)制作的种子菌体0.5ml，在35℃培养至od660达到0.5以上。在静置培养2中，在上述组成且上述ph的培养基400ml中，播种静置培养1的培养物20ml，在35℃培养至od660达到2.5以上。[0066]在主培养工序的菌体增殖阶段中，在包含bactoproteosepeptoneno.3(猪蛋白胨，becton‑dickinson公司制造)(终浓度2w/v％)、酵母提取物(终浓度1w/v％)、硫代乙醇酸钠(终浓度0.025w/v％)和葡萄糖(终浓度0.5w/v％)的ph7.3的培养基10l中，播种静置培养2的培养物约150ml，在氮气气氛下，在35℃进行搅拌培养，菌的增殖达到峰值之后，通过提交1mol/l的hcl而使培养基的ph下降至5.8，进行发酵阶段。在发酵阶段根据需要添加1mol/l的hcl，将培养基的ph维持在5.8至结束。应予说明，主培养工序需要的时间为约44小时。[0067](b)菌体成分的除去使用以下过滤器和膜将通过上述主培养工序得到的培养物进行粗过滤和膜浓缩。过滤器过滤通过使主培养工序得到的培养物依次通过过滤器‑1[3m公司制造zetaplus过滤器(05sp)/1020cm2；相当于孔径1.0～10μm]、过滤器‑2[3m公司制造zetaplus过滤器maximizer(60sp03a)/1020cm2；相当于孔径0.1～1.0μm]和过滤器‑3[sartorius公司制造sartopore2(孔径0.45μm 0.2μm)/0.1m2]的过滤器过滤进行。使用包含0.1mol/lnacl和20mmol/l柠檬酸的20mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)，将通过膜过滤得到的滤液进行膜浓缩。将由此得到的0.9l的膜浓缩液也记为回收液11。接着，使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)，将0.9l的半量(0.45l)进行膜浓缩。将由此得到的膜浓缩液也记为回收液12。[0068](c)核酸内切酶处理将终浓度为1mmol/l的mgcl2和终浓度为20u/ml的benzonase(merckkgaa注册商标)添加于回收液12，一边在ph6.0的条件下搅拌，一边在30℃反应约15小时。benzonase的添加次数为1次。其后，使用3m公司制造zetaplusencapsulatedfilter，将核酸内切酶处理物进行过滤器过滤。[0069](d)核酸分解物的除去使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)，将得到的滤液进行膜浓缩，除去核酸分解物。应予说明，基于该膜的核酸分解物的除去使用切向流过滤。由此得到膜浓缩液。使用包含0.2mol/lnacl的50mmol/l醋酸钠(ph4.2)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)，将得到的膜浓缩液进行膜浓缩。将由此得到的膜浓缩液也记为肉毒毒素分离液1。[0070](e)肉毒毒素复合体的纯化将肉毒毒素分离液1供于阳离子交换色谱。作为阳离子交换载体，使用sp‑sepharose‑fastflow，在70×550mm尺寸的柱中填充载体30cm。使用包含0.2mol/lnacl的50mmol/l醋酸钠(ph4.2)作为清洗液对柱进行平衡化，供给肉毒毒素分离液1，使用包含0.7mol/lnacl的50mmol/l醋酸钠(ph4.2)作为洗脱液，在8柱体积的梯度条件下洗脱至0.7mol/lnacl。流速为约15ml/分钟。使用包含0.2mol/lnacl的50mmol/l醋酸缓冲液(ph6.0)及孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)将得到的洗脱液进行膜浓缩，进一步使用孔径0.22μm过滤器(corning公司制造bottletopfilters、pes制)将得到的浓缩液进行过滤，得到肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物。[0071](f)肉毒毒素非复合体的纯化使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph7.5)和孔径(级分分子量)10kda的膜(sartorius公司制造sartoconslice50hydrosart10kd、以及millipore公司制造pelliconxlultracel10kd)，将得到的肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物进行膜浓缩。其后，将膜浓缩物供于阴离子交换柱色谱。作为阴离子交换柱载体，使用弱阴离子交换载体即deae‑sepharose‑fastflow，在10×450mm的柱中填充载体30cm。使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph7.5)作为清洗液，对柱进行平衡化，供给膜浓缩物，使用包含0.3mol/lnacl的10mmol/l磷酸缓冲液(ph7.5)作为洗脱液，在10柱体积的梯度条件下洗脱至0.3mol/lnacl。流速为约1ml/分钟。使用孔径0.22μm过滤器(starlab公司制造pes制syringefilter)过滤得到的洗脱液，以终浓度达到1w/v％的方式添加保存剂(l‑精氨酸盐酸盐)，得到肉毒毒素非复合体(s毒素)的纯化物(以下，也记为s毒素纯化物1)。[0072]＜比较例1＞除将上述(c)工序和(d)工序替换为以下方法以外，与实施例1同样进行，得到肉毒毒素非复合体(s毒素)的纯化物。具体而言，使用实施例1的(b)工序中得到的回收液11(过滤器滤液)的剩余的一半0.45l，进行以下阴离子交换色谱、膜浓缩和过滤，其后，进行实施例1的(e)工序和(f)工序。[0073]将回收液11供于阴离子交换色谱。作为阴离子交换载体，使用qsepharose‑fastflow，在140×500mm的柱中填充载体10cm。使用包含0.1mol/lnacl和20mmol/l柠檬酸的20mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)作为清洗液，对柱进行平衡化，供给实施例1的(b)工序中得到的回收液11，使相同的清洗液以流速约150ml/分钟流动，不使毒素级分吸附而作为通过级分回收。使用包含0.2mol/nacl的50mmol/l醋酸钠(ph4.2)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartoconslicehydrosart30kd)将回收液进行膜浓缩。将得到的膜浓缩液也记为肉毒毒素分离液1’。进一步进行与实施例1相同的(e)工序和(f)工序，得到肉毒毒素非复合体(s毒素)的纯化物(以下，也记为s毒素纯化物1’)。[0074][2]纯化的确认关于实施例1，将回收液12、肉毒毒素分离液1和s毒素纯化物1分别进行sds‑page展开，关于比较例1，将回收液11、肉毒毒素分离液1’和s毒素纯化物1’进行sds‑page展开，分别进行cbb染色，确认肉毒毒素的纯化。将得到的染色凝胶示于图1(实施例1)和图2(比较例1)。图中，a2‑ntx(h)表示约100kda的重链，a2‑ntx(l)表示约50kda的轻链。[0075]另外，在图1中，标记的右侧相邻的泳道表示主培养液的培养上清液，肉毒毒素分离液1和s毒素纯化物1之间的泳道，从左起表示肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物、deae色谱后的含毒素的液体、deae色谱后的杂质液1、deae色谱后的杂质液2。在图2中，标记的右侧相邻的泳道表示主培养液的培养上清液，肉毒毒素分离液1’和s毒素纯化物1’之间的泳道，从左起表示阴离子交换色谱后的杂质液、肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物、阳离子交换色谱后的杂质液1、阳离子交换色谱后的杂质液2、deae色谱后的含毒素的液体、deae色谱后的杂质液1、deae色谱后的杂质液2、deae色谱后的杂质液3、deae色谱后的杂质液4。[0076]如图1和图2的对比所示，可知：比较例1中，残存约75kda附近的杂质，与此相对，实施例1中，该杂质几乎完全被除去。[0077][3]纯化效率的测定测定基于核酸除去操作的纯化效率。具体而言，实施例1中的纯化效率通过以下方法得到，算出(d)工序中得到的肉毒毒素分离液1中的核酸量相对于(b)工序中得到的回收液12(膜浓缩液)中的核酸量的比率(％)，从100％中减去上述比率。比较例1中的纯化效率通过以下方法得到，算出肉毒毒素分离液1’中的核酸量相对于(b)工序中得到的回收液11(过滤器滤液)中的核酸量的比率，从100％中减去上述比率。[0078][数1]实施例1中的基于核酸除去操作的纯化效率＝100－{(肉毒毒素分离液1中核酸量/回收液12中核酸量)×100}比较例1中的基于核酸除去操作的纯化效率＝100－{(肉毒毒素分离液1’中核酸量/回收液11中核酸量)×100}[0079]应予说明，核酸量作为通过使用qubit3.0荧光计(thermofisher公司制造)的dsdnahsassaykit测定的dna量和通过使用相同设备的rnahsassaykit测定的rna量的总量而导出。[0080]其结果，肉毒毒素分离液1’中的核酸量为肉毒毒素分离液1中的核酸量的约2倍。因此，通过实施例1中的核酸除去操作，与比较例1中的核酸除去操作相比，可实现显著高的纯化效率。[0081][4]肉毒毒素收率的测定测定基于核酸除去操作的肉毒毒素收率。具体而言，实施例1中的肉毒毒素收率通过以下方法得到，算出(d)工序中得到的肉毒毒素分离液1中的总毒素量相对于(b)工序中得到的回收液12(膜浓缩液)中的总毒素量的比率；比较例1中的肉毒毒素收率通过以下方法得到，算出肉毒毒素分离液1’中的总毒素量相对于(b)工序中得到的回收液11(过滤器滤液)中的总毒素量的比率。[0082][数2]实施例1中的基于核酸除去操作的毒素收率＝(肉毒毒素分离液1中总毒素量/回收液12中总毒素量)×100比较例1中的基于核酸除去操作的毒素收率＝(肉毒毒素分离液1’中总毒素量/回收液11中总毒素量)×100[0083]应予说明，总毒素量作为分别使用回收液11、回收液12、肉毒毒素分离液1、肉毒毒素分离液1’根据后述的效价测定法进行样本的制备和对小鼠的接种，单位为u(1u＝1ld50)的值而得到。[0084]其结果，实施例1中的基于核酸除去操作的毒素收率为53.18％，比较例1中的基于核酸除去操作的毒素收率为50.46％，实施例1与比较例1相比，为高的毒素收率。[0085][5]肉毒毒素的测定按照以下进行，导出单位为u/ml的效价。适当稀释得到的s毒素纯化物，从小鼠的尾静脉每1只接种0.1ml之后，确认小鼠的存活时间。由预先验证的存活时间和腹腔内给药的ld50值的回归直线算出每s毒素纯化物1ml的ld50值(u/ml)。另外，由280nm的红外线吸收测定每s毒素纯化物1ml的蛋白质质量(mg/ml)。每s毒素纯化物1ml的ld50值(u/ml)除以每s毒素纯化物1ml的蛋白质质量(mg/ml)而导出比活性(u/mg)。[0086]其结果，实施例1中得到的s毒素纯化物1的比活性为8.21×107u/mg，比较例1中得到的s毒素纯化物1’的比活性为2.59×107u/mg，实施例1与比较例1相比，可得到比活性高的纯化物。[0087][试验例2][1]肉毒毒素的制造[0088]＜实施例2＞在本实施例中，在肉毒毒素产生工序中使用无动物成分的培养基，将使用denarase作为核酸内切酶的这一点作为主要的变更点，除此以外，与实施例1同样进行，制造肉毒毒素。具体而言，按照以下顺序制造肉毒毒素。[0089](a)肉毒杆菌的产生作为预培养工序和主培养工序中的培养基，使用vegetablepeptoneno.1(植物胨，thermofisher公司)，将预培养工序(静置培养1和静置培养2)中的培养量设为半量，将静置培养1的培养物约10ml播种于静置培养2的培养基，除此以外，与实施例1同样进行，产生肉毒杆菌。[0090](b)菌体成分的除去使用以下过滤器和膜将通过上述主培养工序得到的培养物进行粗过滤和膜浓缩。过滤器过滤通过使主培养工序得到的培养物依次通过过滤器‑1[3m公司制造zetaplus过滤器(05sp)/1020cm2；相当于孔径1.0～10μm]、过滤器‑2[3m公司制造zetaplus过滤器maximizer(60sp03a)/1020cm2；相当于孔径0.1～1.0μm]和过滤器‑3[sartorius公司制造sartopore2(孔径0.45μm 0.2μm)/0.1m2]的过滤器过滤而进行。使用包含0.1mol/lnacl和20mmol/l柠檬酸的20mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)将膜过滤中得到的滤液进行膜浓缩。此外，使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)进行膜浓缩。将由此得到的膜浓缩液也记为回收液22。[0091](c)核酸内切酶处理使用denarase(c‑lectagmbh注册商标)作为核酸内切酶，将反应时间设为约19小时，除此以外，与实施例1同样进行，进行核酸内切酶处理和过滤，得到滤液。[0092](d)核酸分解物的除去使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)将得到的滤液进行膜过滤约1小时，除去核酸分解物。应予说明，基于该膜的核酸分解物的除去使用切向流过滤。由此得到膜浓缩液。使用包含0.2mol/lnacl的50mmol/l醋酸钠(ph4.2)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)，将得到的膜浓缩液进行膜浓缩约20分钟。将由此得到的膜浓缩液也记为肉毒毒素分离液2。[0093](e)肉毒毒素复合体的纯化与实施例1同样进行，将肉毒毒素分离液2供于阳离子交换色谱。使用包含0.2mol/lnacl的50mmol/l醋酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)将得到的洗脱液进行膜浓缩，进一步使用孔径0.22μm过滤器(corning公司制造bottletopfilters、pes制)进行过滤，得到肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物。[0094](f)肉毒毒素非复合体的纯化与实施例1同样进行，由肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物得到肉毒毒素非复合体(s毒素)的纯化物(以下，也记为s毒素纯化物2)。[0095]＜实施例3＞在本实施例中，在肉毒毒素产生工序的主培养工序中进行静置培养，将进行2次核酸内切酶的添加作为主要的变更点，除此以外，与实施例1同样进行，制造肉毒毒素。具体而言，按照以下顺序制造肉毒毒素。[0096](a)肉毒杆菌的产生播种种子菌体0.4ml，将静置培养1中的培养量设为10ml，将静置培养2中的培养量设为250ml，将静置培养1的培养物约10ml播种于静置培养2的培养基，除此以外，与实施例1同样进行，进行预培养工序(静置培养1和静置培养2)。在主培养工序的菌体增殖阶段中，在包含bactoproteosepeptoneno.3(猪蛋白胨，becton‑dickinson公司制造)(终浓度2w/v％)、酵母提取物(终浓度1w/v％)、硫代乙醇酸钠(终浓度0.025w/v％)和葡萄糖(终浓度1.0w/v％)的ph7.3的培养基10l中，播种静置培养2的培养物约150ml，在密封条件下，在35℃进行静置培养，不进行ph调整，以静置培养的状态自然地转移至发酵阶段。主培养工序中需要的时间为约44小时，培养结束时的培养基的ph约为6.0。[0097](b)菌体成分的除去对通过上述主培养工序得到的培养物，不使用包含0.1mol/lnacl和20mmol/l柠檬酸的20mmol/l磷酸缓冲液(ph6.0)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)进行膜浓缩，除此以外，与实施例1同样进行，得到对应于回收液12的回收液32。[0098](c)核酸内切酶处理将终浓度为1mmol/l的mgcl2和终浓度为50u/ml的benzonase(第一次添加量)添加于回收液32，一边在ph6.0的条件下进行搅拌，一边在30℃下反应约5小时。其后，通过进一步添加benzonase(第二次添加量)50u/ml，使第一次和第二次的benzonase的合计量成为100u/ml，进一步反应约12小时(合计约13小时)。其后，使用3m公司制造zetaplusencapsulatedfilter将核酸内切酶处理物进行过滤器过滤。[0099](d)核酸分解物的除去使用包含0.2mol/lnacl的50mmol/l醋酸缓冲液(ph4.2)和孔径(级分分子量)30kda的膜(sartorius公司制造sartoconslicehydrosart30kd)将得到的滤液进行膜浓缩，除去核酸分解物。应予说明，基于该膜的核酸分解物的除去使用切向流过滤。将由此得到的膜浓缩液也记为肉毒毒素分离液3。[0100](e)肉毒毒素复合体的纯化与实施例1同样进行，将得到的肉毒毒素分离液3供于阳离子交换色谱。使用包含0.7mol/lnacl的50mmol/l醋酸钠(ph4.2)作为洗脱液，在8柱体积的梯度条件下洗脱至0.7mol/lnacl。使用10mmol/l磷酸盐缓冲液(ph7.5)和孔径(级分分子量)10kda的膜(sartorius公司制造sartoconslice50hydrosart10kd)将得到的洗脱液进行膜浓缩，得到肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物。[0101](f)肉毒毒素非复合体的纯化使用10mmol/l磷酸盐缓冲液(ph7.5)和孔径(级分分子量)10kda的膜(millipore公司制造pelliconxlultracel10kd)将得到的肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物进行膜浓缩，供于阴离子交换柱色谱。作为阴离子交换柱载体，使用弱阴离子交换载体即deae‑sepharose‑fastflow，在10×450mm的柱中填充载体30cm。使用10mmol/l磷酸缓冲液(ph7.5)作为清洗液，对柱进行平衡化，供给肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物，使用包含0.3mol/lnacl的10mmol/l磷酸缓冲液(ph7.5)作为洗脱液，在10柱体积的梯度条件下洗脱至0.3mol/lnacl。流速为约1ml/分钟。在得到的洗脱液中以终浓度成为1w/v％的方式添加保存剂(l‑精氨酸盐酸盐)，使用孔径0.22μm过滤器(starlab公司制造pes制syringefilter)进行过滤，得到肉毒毒素非复合体(s毒素)的纯化物(以下，也记为s毒素纯化物3)。[0102][2]纯化的确认关于实施例2，将回收液22、肉毒毒素分离液2和s毒素纯化物2分别进行sds‑page展开，关于实施例3，将回收液32、肉毒毒素分离液3和s毒素纯化物3进行sds‑page展开，分别进行cbb染色，确认肉毒毒素的纯化。sds‑page和染色的方法与试验例1相同。将得到的染色凝胶示于图3(实施例2)和图4(实施例3)。图中，a2‑ntx(h)表示约100kda的重链，a2‑ntx(l)表示约50kda的轻链。[0103]另外，在图3中，肉毒毒素分离液2和s毒素纯化物2之间的泳道，从左侧起表示肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物、deae色谱后的毒素含有液。在图4中，回收液32的左侧相邻的泳道，表示主培养液的培养上清液，肉毒毒素分离液3和s毒素纯化物3之间的泳道，从左边起表示sp色谱后的含毒素的液体、肉毒毒素复合体(m毒素)的纯化物、deae色谱后的含毒素的液体、deae色谱后的杂质液1、deae色谱后的杂质液2。[0104]如图3和图4所示，可知：在实施例2和3中，杂质几乎完全被除去。[0105][3]肉毒毒素收率的测定测定基于核酸除去操作的肉毒毒素收率。具体而言，实施例2、3中的肉毒毒素收率作为(d)工序中得到的肉毒毒素分离液2、3中的总毒素量相对于(b)工序中得到的回收液22、32(膜浓缩液)中的总毒素量的比率而算出。[0106][数3]实施例2中的基于核酸除去操作的毒素收率＝(肉毒毒素分离液2中总毒素量/回收液22中总毒素量)×100实施例3中的基于核酸除去操作的毒素收率＝(肉毒毒素分离液3中总毒素量/回收液32中总毒素量)×100[0107]应予说明，总毒素量作为分别使用回收液22、32、肉毒毒素分离液2、3，根据前述的效价测定法进行样本的制备以及对小鼠的接种，单位为u(1u＝1ld50)的值而得到。[0108]其结果，实施例2中的基于核酸除去操作的毒素收率为59.71％，实施例3中的基于核酸除去操作的毒素收率为89.68％。[0109][4]肉毒毒素的测定除利用bca法测定蛋白质含量以外，与试验例1相同，测定得到的肉毒毒素(s毒素纯化物2、3)的比活性。其结果，实施例2中得到的s毒素纯化物2的比活性为10.06×107u/mg，实施例3中得到的s毒素纯化物3的比活性为6.46×107u/mg。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3 
技术特征：
1.一种肉毒毒素的制造方法，其特征在于，包含：(a)在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自所述肉毒毒素的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a的工序；(b)将所述混合物a供于所述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b的工序；(c)在所述混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c的工序；(d)将所述混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d的工序。2.根据权利要求1所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(c)工序中，所述核酸内切酶为源自粘质沙雷氏菌serratia marcescens的核酸内切酶。3.根据权利要求1或2所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在ph5.8～6.5的条件下进行所述(c)工序。4.根据权利要求1～3中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(c)工序中，多次添加所述核酸内切酶。5.根据权利要求1～4中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(d)工序中，所述核酸分解物的除去包含使用膜的除去。6.根据权利要求1～5中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，所述肉毒毒素的制造方法还包含：(e)将所述肉毒毒素分离液d供于阳离子交换色谱，得到肉毒毒素复合体的纯化物的工序。7.根据权利要求6所述的肉毒毒素的制造方法，其中，所述肉毒毒素的制造方法还包含：(f)将所述肉毒毒素复合体的纯化物，在无毒性非ha蛋白质从所述肉毒毒素复合体解离的条件下供于阴离子交换色谱，得到肉毒毒素非复合体的纯化物的工序。8.根据权利要求1～7中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，至少所述(a)工序包含预培养工序和主培养工序，至少所述预培养工序在静置培养下进行。9.根据权利要求1～8中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在静置培养下进行所述预培养工序和所述主培养工序这两者。10.根据权利要求8或9所述的肉毒毒素的制造方法，其中，所述(a)工序依次包含：(a1)在ph6.8～8.0的培养基中进行所述肉毒毒素产生菌的菌体增殖的工序；(a2)在ph5.0～6.5的培养基中进行所述肉毒毒素产生菌的发酵的工序。11.根据权利要求1～10中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(a)工序中，所述肉毒毒素产生菌为以芽孢的形态保存的菌体的萌发体。12.根据权利要求1～11中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(b)工序中，所述菌体成分的除去包含过滤器过滤。13.根据权利要求7～12中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(f)工序
中，所述条件为ph7.3～8.5。14.根据权利要求7～13中任一项所述的肉毒毒素的制造方法，其中，在所述(f)工序中，阴离子交换色谱为弱阴离子交换色谱。15.一种纯化肉毒毒素，其特征在于，所述纯化肉毒毒素的比活性为3.0
×
107u/mg以上。16.一种纯化肉毒毒素，其特征在于，所述纯化肉毒毒素通过权利要求1～14中任一项所述的肉毒毒素的制造方法制造。
技术总结
本发明提供一种简便、毒素收率高、且可得到比活性高的毒素的肉毒毒素的制造方法。一种肉毒毒素的制造方法，其包含：(A)在培养基中由肉毒毒素产生菌产生肉毒毒素，得到包含源自上述肉毒毒素的菌体成分以及核酸成分和肉毒毒素的混合物a的工序；(B)将上述混合物a供于上述菌体成分的除去，得到包含核酸成分和肉毒毒素的混合物b的工序；(C)在上述混合物b中添加核酸内切酶，得到包含核酸分解物和肉毒毒素的混合物c的工序；(D)将上述混合物c供于核酸分解物的除去，得到肉毒毒素分离液d的工序。得到肉毒毒素分离液d的工序。


技术研发人员：横内大辅 三浦亚希子 冈田龙 山下雄三 佐佐木勇弥 西畑省吾
受保护的技术使用者：一般财团法人阪大微生物病研究会
技术研发日：2019.12.17
技术公布日：2021/6/29