一种重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用与流程

1.本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一种重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与在产木聚糖酶中的应用。


背景技术：

2.木聚糖是植物中半纤维素的主要组成成分，是广泛存在于自然界中含量极其广泛的多糖，为世界第二大可再生资源。木聚糖结构复杂，它的彻底水解需要一系列酶的协同作用，其中最关键的酶是木聚糖酶。目前所知，细菌、真菌、放线菌、酵母菌、藻类以及动物瘤胃中的细菌等大多数微生物都能产木聚糖酶。工程菌成为工业生产木聚糖酶的主要形式，编码木聚糖酶的基因被克隆到同源或者异源宿主中被高效表达。但当前有许多因素制约其应用和发展，木聚糖酶酶活性和产酶效率成为木聚糖推广应用的制约因素。如何通过基因工程等技术获得产酶高，适合工业应用的木聚糖酶是当前亟待解决的问题。
3.酵母细胞具有显著的粘附非生物表面、细胞和组织的能力。粘附是由一类特殊的细胞壁蛋白粘附素引起的，细胞携带几种不同的粘附素，每种粘附素都能粘附到特定的基质上。不同的酵母种类携带不同的粘附素家族，这些粘附素家族反映了该物种的生活方式。例如良性酿酒酵母携带五种flo(絮凝)基因，白色念珠菌携带als和eap基因，光滑念珠菌携带epa基因粘附素家族。酵母絮凝是一种可逆的、无性的和钙依赖性的过程，在这个过程中，细胞粘附形成由数千个细胞组成的絮状物。毕赤酵母中的hsf1基因属于转录抑制因子和激活因子，其go分析的生物进程中包括絮凝功能。酵母生物膜的形成降低了对抗生素药物的敏感性，增加酵母对于外界环境的耐受性。
4.毕赤酵母表达遗传稳定，可对蛋白质进行翻译后加工，表达效率高，产物可分泌至培养基且适于高密度发酵，因此毕赤酵母表达系统被认为是更适用于工业化生产的分泌表达系统。然而毕赤酵母生物成膜能力弱、难以进行固定化发酵的问题亟待解决。目前，关于毕赤酵母菌中的生物成膜基因及通过生物成膜吸附固定化发酵的研究鲜有报道。因此，本发明提供了一种重组毕赤酵母基因工程菌以有效解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一种过表达hsf1基因的重组毕赤酵母基因工程菌。
6.为实现上述目的，本发明公开了一种重组毕赤酵母基因工程菌，由在原始毕赤酵母菌中过表达转录抑制因子和激活因子hsf1得到。
7.其中，所述原始毕赤酵母菌为pichia pastoris gs115。
8.所述转录抑制因子和激活因子hsf1的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.本发明进一步公开了上述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
10.(1)以毕赤酵母基因组为模板，通过pcr扩增hsf1基因片段；
11.(2)将步骤(1)获得的hsf1基因片段克隆到表达质粒上，得到重组质粒；
12.(3)将步骤(2)获得的重组质粒线性化后导入原始毕赤酵母菌中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌。
13.步骤(1)中，所述的毕赤酵母优选为p.pastoris gs115。
14.步骤(1)中，所述pcr扩增所用的引物为引物1和引物2，其核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。
15.步骤(2)中，所述的表达质粒优选为pgapzαa。
16.更进一步地，本发明公开了上重组毕赤酵母基因工程菌在产木聚糖酶中的应用。
17.其中，所述重组毕赤酵母基因工程菌可以通过游离发酵、固定发酵或固定化连续发酵的方式产木聚糖酶，具体地：
18.(i)游离发酵：向发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液；
19.(ii)固定发酵：向含有固定化载体的发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液；
20.(iii)固定化连续发酵：向含有固定化载体的发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液；每一批发酵结束后，用新的发酵培养基替换上一批所得到的发酵液，重复发酵。
21.上述过程中，所述的重组毕赤酵母基因工程菌菌泥为的重组毕赤酵母基因工程菌种子液离心所得。
22.其中，所述重组毕赤酵母基因工程菌种子液的制备方法包括如下步骤：
23.(a)将重组毕赤酵母基因工程菌接种到活化培养基中，培养得到活化液；
24.(b)将步骤(a)所得的活化液接种到种子培养基中，培养得到重组毕赤酵母基因工程菌的种子液。
25.步骤(a)中，所述的活化培养基中，各组分的浓度为蛋白胨10
‑
30g/l、酵母粉5
‑
15g/l、葡萄糖10
‑
30g/l、生物素0.1
‑
5mg/l；优选为蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、葡萄糖20g/l、生物素0.4mg/l。
26.步骤(a)中，所述活化培养基的溶剂为水。
27.步骤(a)中，所述的培养为在28
‑
30℃，200
‑
300rpm条件下培养16
‑
24h，优选为为在30℃，250rpm条件下培养24h。
28.步骤(b)中，所述的种子培养基中，各组分的浓度为蛋白胨10
‑
30g/l、酵母粉5
‑
15g/l、甘油5
‑
15g/l、ynb 10
‑
20g/l、磷酸氢二钾0.1
‑
1g/l、磷酸二氢钾1
‑
5g/l、生物素0.1
‑
5mg/l，优选为蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、甘油10g/l、ynb 13.4g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、磷酸二氢钾1.18g/l、生物素0.4mg/l。
29.步骤(b)中，所述种子培养基的溶剂为水。
30.步骤(b)中，所述培养为在28
‑
30℃，200
‑
300rpm条件下培养16
‑
24h；优选为30℃，250rpm条件下培养24h。
31.上述(ii)固定发酵和(iii)固定化连续发酵中，所述固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合；优选为棉纤维织物。
32.优选地，将固定化载体进行预处理，即将固定化载体剪成2
‑
8cm
×2‑
8cm的正方形，
用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡0.5
‑
4h，再用纯水清洗后沸水浴10
‑
40min后干燥；优选地，所述的预处理为将固定化载体剪成4cm
×
4cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗后沸水浴30min后干燥。
33.其中，所述固定化载体的用量为2
‑
80g/l发酵培养基，优选为40g/l发酵培养基。
34.上述产木聚糖酶的发酵培养基中，各组分的浓度为：蛋白胨10
‑
30g/l、酵母粉5
‑
15g/l、ynb 10
‑
20g/l、磷酸氢二钾0.1
‑
1g/l、磷酸二氢钾1
‑
5g/l、生物素0.1
‑
5mg/l；优选为蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、ynb 13.4g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、磷酸二氢钾1.18g/l、生物素0.4mg/l。
35.其中，所述发酵培养基的溶剂为水。
36.优选地，在上述发酵过程中加入甲醇诱导木聚糖酶的表达。
37.进一步优选地，发酵过程中每24h加入甲醇。
38.更进一步优选地，甲醇的加入量为1％(v/v)。
39.上述发酵的温度为28
‑
30℃，优选为30℃。
40.上述发酵的转速为200
‑
300rpm，优选为250rpm。
41.上述发酵的时间为72
‑
120h，优选为96h。
42.有益效果：本发明首次构建了一株过表达hsf1的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。具体地，单次固定化发酵条件下产酶的酶活力比游离发酵的出发菌提高了28.3％，发酵周期缩短了36.6％；重组菌能够稳定连续进行至少七批次的固定化发酵产酶，经过七批次固定化发酵后，重组菌发酵产酶的酶活比出发菌高出约7倍。
附图说明
43.图1为表达质粒pgapzαa
‑
hsf1示意图；
44.图2中，a为目的基因hsf1的pcr电泳图，泳道m为dl 5000dna marker，泳道1为目的基因hsf1；图b为pgapzαa载体片段的pcr电泳图，泳道m为dl 5000dna marker，泳道1为pgapzαa载体片段；图c为重组质粒pgapzαa
‑
hsf1电泳图，其中泳道m为dl 10000dna marker，泳道1为重组质粒pgapzαa
‑
hsf1；
45.图3为重组菌gs115
‑
hsf1*的验证图，其中泳道m为dl 1000dna marker，泳道1为抗性基因zeocin片段；
46.图4为p.pastoris gs115出发菌和重组菌的电镜图，其中图a为出发菌p.pastoris gs115的电镜图，图b为重组菌株gs115
‑
hsf1*的电镜图；
47.图5为出发菌和重组菌结晶紫染色法半定量测生物膜量实验结果图；
48.图6为出发菌和重组菌发酵产木聚糖酶活力对比图；
49.图7为p.pastoris gs115出发菌和重组菌发酵周期图。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，
均可从商业途径获得。
51.实施例1：构建过表达hsf1基因的过表达质粒。
52.1、目的基因hsf1的扩增：
53.以提取的p.pastoris gs115(购买于淼灵生物公司)基因组为模板，用引物1(seq id no.2)和引物2(seq id no.3)对基因hsf1进行扩增。
54.pcr反应体系见表1。
55.表1目的基因hsf1扩增pcr体系
[0056][0057]
按上述体系分装成每管25μl。
[0058]
pcr条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火55℃，5s；4)延伸72℃，15s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。
[0059]
目的基因hsf1的扩增产物大小为2441bp(seq id no.1)，电泳图如附图2a所示。pcr产物经takara胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
[0060]
2、表达质粒pgapzαa的提取及目的片段扩增：
[0061]
1)表达质粒pgapzαa的提取：将带有质粒pgapzαa的大肠杆菌top 10甘油菌(购买于淼灵生物公司)接种于5ml的lb液体培养基(含有zeocin 25μg/ml)，37℃培养过夜；用2.0ml离心管收集细胞，10000rpm离心2min，弃上清液；依照axyprep质粒dna小量试剂盒说明书中的步骤进行操作，提取质粒pgapzαa。
[0062]
2)pgapzαa片段的扩增
[0063]
以线性化pgapzαa质粒为模板，用引物3(seq id no.4)和引物4(seq id no.5)对pgapzαa片段进行扩增。
[0064]
pcr反应体系见表2。
[0065]
表2表达质粒pgapzαa的扩增pcr体系
[0066]
组分体积(μl)生产厂家primestar max premix(2
×
)25takara bio inc.引物3(10μm)2擎科生物引物4(10μm)2擎科生物模板(pgapzαa质粒)1 无菌水20 [0067]
按上述体系分装成每管25μl。
[0068]
pcr条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火50℃，15s；4)延伸72℃，10s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。pcr产物经takara胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
[0069]
pgapzαa片段的扩增产物大小为2857bp(seq id no.6)，电泳图如附图2b所示。pcr产物经takara胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
[0070]
3、重组质粒的构建
[0071]
将步骤1得到的目的基因片段与步骤2得到的pgapzαa片段按照clonexpress ii一步克隆试剂盒的说明书的步骤相连接，得到重组质粒pgapzαa
‑
hsf1。连接反应体系见表3，37℃水浴30min后，立即冰浴5min，导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，连接反应体系见表3。
[0072]
表3连接反应体系
[0073]
组分体积(μl)pgapza a载体的pcr产物1目的基因hsf11.25*ceⅱbuffer4exnaseⅱ2无菌水11.8合计20
[0074]
将上述得到的连接液转入到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，复苏后涂布于lb抗性平板(25μg/ml zeocin)，37℃培养12h至长出单菌落。
[0075]
挑取上述平板单菌落，接种于lb液体培养基(25μg/ml zeocin)中37℃过夜培养12h后，提取质粒，经测序表明序列无误。
[0076]
重组质粒大小为5298bp(seq id no.7)，pgapzαa
‑
hsf1示意图见附图1，其电泳图见附图2c。
[0077]
实施例2：构建过表达hsf1基因的毕赤酵母基因工程菌。
[0078]
1、重组质粒的转化
[0079]
使用avrⅱ将质粒pgapzαa
‑
hsf1酶切线性化。
[0080]
重组质粒pgapzαa
‑
hsf1线性化体系见表4。
[0081]
表4重组质粒pgapzαa
‑
hsf1线性化体系
[0082]
组分体积(μl)生产厂家quickcut avrⅱ1takara bio inc.10*quickcut buffer5takara bio inc.重组质粒pgapzαa
‑
hsf14 无菌水40 合计50 [0083]
酶切的条件为37℃，1h，酶切反应结束后将酶切产物进行胶回收，用于后续的实验.
[0084]
将上述线性化的重组质粒pgapzαa
‑
hsf1导入毕赤酵母p.pastoris gs115感受态细胞(购买于淼灵生物公司)中，在含有100μg/ml zeocin的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(ypd)抗性平板(100μg/ml zeocin)上进行筛选，28
‑
30℃培养2
‑
3d至长出单菌落。
[0085]
2、重组菌株gs115
‑
hsf1*的验证
[0086]
挑取上述单菌落，以引物5(seq id no.8)和引物6(seq id no.9)进行菌落pcr，验证重组菌基因组上是否含有zeocin基因片段。
[0087]
pcr反应体系见表5。
[0088]
表5重组菌株gs115
‑
hsf1*的菌落pcr体系
[0089]
组分体积(μl)生产厂家primestar max premix(2
×
)25takara bio inc.引物5(10μm)2擎科生物引物6(10μm)2擎科生物模板1 无菌水20 [0090]
按上述体系分装成每管25μl。
[0091]
pcr条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火50℃，15s；4)延伸72℃，5s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。pcr产物以2.0％核酸胶验证。zeocin基因片段pcr产物大小为358bp(seq id no.10)，重组菌验证结果电泳图如附图3所示。
[0092]
实施例3：生物膜的成膜表征检测。
[0093]
如图4所示，a和b分别是出发菌p.pastoris gs115和重组菌株gs115
‑
hsf1*的sem电镜实验进行检测的结果图，可以明显看出重组菌株成膜效果比出发菌成膜效果好，生物膜形成量多。
[0094]
图5是进行的结晶紫染色法半定量测生物膜量实验，在每孔装有200μl的ypd的96孔板中分别加入20μl的出发菌和重组菌的菌液，培养到72
‑
120h时，每隔12h用结晶紫染色法和酶标仪测其od570，从图中可以看出重组菌株gs115
‑
hsf1*成膜效果要比p.pastoris gs115好。
[0095]
实施例4：木聚糖酶活性的测定。
[0096]
1、木糖标准曲线的绘制
[0097]
取10ml离心管，逐个加入各组分，进行木糖标准曲线的绘制。
[0098]
其中，dns试剂每升组分如下：3.5
‑
二硝基水杨酸7.5g，氢氧化钠14.0g，酒石酸钾钠216.0g，苯酚5.0g，偏重亚硫酸钠6.0g，溶剂为水。
[0099]
其中，木糖标准液每升组分如下：木糖10g，溶剂为水。
[0100]
其中，磷酸钾缓冲液每升组分如下：三水磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾11.8g，溶剂为水。
[0101]
其中，木糖标准曲线反应体系见表6。
[0102]
表6木糖标准曲线反应体系
[0103][0104]
按上述体系，于10ml的离心管中逐个加入各组分；充分混匀后，置于沸水中煮沸5min，反应液迅速用冷水冷却至室温，补加蒸馏水至5ml，以空白对照调零，于540nm处测吸光值。以木糖含量为纵坐标，吸光值为横坐标，制作标准曲线，并拟合出回归方程。
[0105]
2、木聚糖酶活性的测定
[0106]
木聚糖酶酶活测定采用3.5
‑
二硝基水杨酸(dns)试剂法：木聚糖酶水解木聚糖(榉木)生成的单糖与3.5
‑
二硝基水杨酸(dns)试剂发生显色反应，使用紫外分光光度法于540nm处检测吸光值，通过测定酶促反应所生成的还原性木糖来定量的计算酶活性。
[0107]
测定方法如下：于0.225ml磷酸钾缓冲液中加入25μl适当稀释的酶液，再加入0.5ml的木聚糖底物，于50℃条件下准确反应15min后，加入1ml dns试剂充分混合煮沸5min，反应液迅速用冷水冷却至室温，补加蒸馏水至5ml，以不加粗酶液的空白对照调零，于540nm处测吸光值。酶活定义为：在此测定的条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(u/ml)。
[0108]
实施例5：重组菌游离发酵产木聚糖酶实验。
[0109]
1、活化培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g、生物素0.4mg，溶剂为水。
[0110]
种子培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、甘油10g、ynb 13.4g、三水磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾1.18g、生物素0.4mg，溶剂为水。
[0111]
发酵培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、ynb 13.4g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾1.18g、生物素0.4mg，溶剂为水。
[0112]
2、活化：将gs115
‑
hsf1*从
‑
80℃冰箱取出，试管中准备5ml活化培养基，接种量50μl，于30℃摇床中培养24h，转速为250rpm。
[0113]
转接：活化完成后分别倒入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。
[0114]
发酵：将发酵液分装于500ml摇瓶，装液量100ml，115℃，20min灭菌。将种子液在4500rpm条件下离心5min，弃去上清，菌泥接入发酵培养基当中，在30℃，250rpm条件下发酵96h。发酵过程中每隔24h加入1％(v/v)的甲醇进行木聚糖酶表达的诱导。
[0115]
3、重组菌游离发酵产木聚糖酶的酶活见附图6；发酵周期数据见图7。
[0116]
实施例6：重组菌单次固定化发酵产木聚糖酶实验。
[0117]
将实施例5中的发酵液中加入预处理过的棉纤维织物载体(40g/l发酵培养基)并灭菌，其余步骤同实施例5。重组菌单次固定化发酵产木聚糖酶的酶活见附图6。
[0118]
对比例1：出发菌游离产酶。
[0119]
将实施例5中接入的重组菌更换为出发菌p.pastoris gs115，其余步骤同实施例5，检测得发酵产物酶活见图6，发酵周期数据见图7。
[0120]
对比例2：出发菌单次固定化产酶。
[0121]
将实施例6中接入的重组菌更换为原始出发菌p.pastoris gs115，其余步骤同实施例6，检测得发酵产物酶活见图6，发酵周期数据见图7。
[0122]
从图6可以看出，相比于重组菌游离和固定化发酵，出发菌游离发酵所得的木聚糖酶酶活较低，且重组毕赤酵母在单次固定化发酵条件下产酶的酶活力比游离发酵的出发菌提高了28.3％；从图7可以看出，相比于游离发酵，固定化发酵的周期均缩短，其中，重组菌固定化发酵周期比出发菌缩短36.6％。
[0123]
实施例7：重组菌固定化连续发酵产木聚糖酶实验。
[0124]
在固定化发酵过程中，第一批时重组菌发菌体已经吸附到固定化载体上，摇瓶培养120h后倒掉发酵液，留下吸附着菌的固定化载体，再倒入新的100ml发酵培养基进行第二批发酵，培养至酶活稳定，约108h，测得木聚糖酶的酶活产见表7。随后批次固定化连续发酵均采用此法。其余步骤同实施例6。
[0125]
对比例3：出发菌固定化连续发酵产酶。
[0126]
将实施例7中接入的重组菌更换为原始出发菌p.pastoris gs115，其余步骤同实施例7，检测得发酵产物酶活见表7。
[0127]
从表7可以看出，相比于重组菌固定化发酵，出发菌在固定化发酵的第四批时产酶能力开始显著下降，而重组菌能够稳定连续进行至少七批次固定化发酵。经过七批次固定化发酵后，重组菌发酵产酶的酶活比出发菌高出约7倍。上述重组菌能够连续固定化发酵批次数的提高是因为过表达hsf1基因增强了重组菌的成膜能力。
[0128]
表7出发菌和重组菌固定化连续发酵产酶的酶活(u/ml)
[0129]
批次一二三四五六七出发菌2899.12174.31916.81291.4883.6591.3502.4重组菌3992.03947.74023.33988.64202.14045.24019.5
[0130]
本发明提供了一种重组毕赤酵母基因工程菌的构建思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一种重组毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，由在原始毕赤酵母菌中过表达转录抑制因子和激活因子hsf1得到。2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述原始毕赤酵母菌为pichia pastoris gs115。3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述转录抑制因子和激活因子hsf1的核苷酸序列如seq id no.1所示。4.权利要求1
‑
3中任意一项所述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以毕赤酵母基因组为模板，通过pcr扩增hsf1基因片段；（2）将步骤（1）获得的hsf1基因片段克隆到表达质粒上，得到重组质粒；（3）将步骤（2）获得的重组质粒线性化后导入原始毕赤酵母菌中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌。5.权利要求1所述重组毕赤酵母基因工程菌在产木聚糖酶中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组毕赤酵母基因工程菌通过游离发酵、固定发酵或固定化连续发酵的方式产木聚糖酶。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在固定发酵和固定化连续发酵中，所述固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜、丝绸、甘蔗渣和玉米秸秆中的任意一种或几种的组合，固定化载体的用量为2
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80 g/l发酵培养基。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，产木聚糖酶发酵的发酵培养基中，各组分的浓度为：蛋白胨10
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30 g/l、酵母粉5
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15 g/l、无氨基酵母氮源10
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20 g/l、磷酸氢二钾0.1
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1 g/l、磷酸二氢钾1
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5 g/l、生物素0.1
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5 mg/l。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在发酵过程中加入甲醇诱导木聚糖酶的表达。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵的温度为28
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30℃，发酵的转速为200
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300 rpm，发酵的时间为72
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120 h。
技术总结
本发明公开了一种重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用，该毕赤酵母基因工程菌是通过在毕赤酵母菌中过表达转录抑制因子和激活因子HSF1构建得到的。所述构建方法包括如下步骤：（1）对毕赤酵母菌基因组进行PCR扩增得到HSF1基因片段；（2）将HSF1基因片段克隆到表达质粒上，得到重组质粒；（3）将线性化的重组质粒导入毕赤酵母菌中，筛选得到毕赤酵母基因工程菌。毕赤酵母基因工程菌能够有效提高自身生物膜成膜能力，使得重组毕赤酵母在单次固定化发酵条件下产酶的酶活力比游离发酵的出发菌提高了28.3％，发酵周期缩短了36.6%。重组菌能够稳定连续进行至少七批次的固定化发酵产酶，经过七批次固定化发酵后，重组菌发酵产酶的酶活比出发菌高出约7倍。活比出发菌高出约7倍。活比出发菌高出约7倍。


技术研发人员：应汉杰 牛欢青 宋佳睿 闵志迪 陈勇 刘庆国 柳东
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29