本发明属于三价铬离子的检测分析技术领域，特别涉及一种基于智能手机检测三价铬离子的方法。
背景技术：
三价铬(cr3 )离子在人类生活和健康中起着至关重要的作用。三价铬离子是有效的微量营养素，它通过调节葡萄糖耐量因子和胰岛素作用，参与人体的新陈代谢和饮食，从而调节某些酶的活性并使核酸，碳水化合物，脂质和蛋白质稳定。为了满足均衡成分的要求，人体每天需要摄入三价铬离子约25–200μg。三价铬离子可以从各种食物中获得，例如肉，水果，谷物和蔬菜。但是，对于人体而言，三价铬离子可能具有歧义的功能。三价铬离子缺乏会干扰葡萄糖和脂质的代谢，升高总胆固醇，甘油三酸酯和循环胰岛素的水平，削弱免疫功能，并增加对成熟期糖尿病，神经系统疾病和心血管疾病的威胁。尽管过量摄入的三价铬离子体内毒性比六价铬离子低得多，但是过量吸收三价铬离子会抑制非特异性结合后dna的转录和复制，产生遗传毒性作用，并增加罹患癌症和慢性溃疡的风险。另一方面，三价铬离子也可能是有害的污染物，这是由于越来越频繁的工业活动(例如合金制造，催化，鞣制，镀铬)导致的。因此，在其毒性和必需性之间存在一个相对狭窄的浓度范围。因此迫切需要开发一种方便，灵敏，选择性和快速的检测策略，用于对三价铬离子进行准确分析。
中国专利(cn104215621a)公开了一种利用石墨烯量子点探针检测三价铬离子的方法，利用石墨烯量子点探针作为荧光探针，通过三价铬离子对石墨烯量子点荧光的碎灭特性进行三价铬离子的检测。该方法灵敏性高，但是量子点的合成费时费力，并且合成的量子点颗粒大小不均匀。
因此，目前虽然有多种定性和定量分析方法可测定三价铬离子，包括如：石墨炉原子吸收光谱法(gf-aas)，电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-aes)，icp-质谱法(常规ms)，荧光法x射线荧光(xrf)和伏安法等。尽管这些方法非常准确和灵敏，但它们的局限性包括耗时的准备工作，费用，操作仪器所需的训练有素的人员以及不适合用作现场设备。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于智能手机检测三价铬离子的方法，以解决现有检测方法存在的准备工作耗时、费用昂贵、对仪器操作人员要求高以及现场操作不便等问题。
本发明的第一目的在于提供一种基于智能手机检测三价铬离子的方法，包括：
(1)将三价铬离子依赖型dna酶链与dna底物链按浓度比1.5-3:1混合，退火处理后加入待检液，得到混合液a；其中，所述dna酶链具有如seqidno：1所示的序列；所述dna底物链具有如seqidno：2所示的序列；
(2)在混合液a中加入dna环状模板链进行反应，然后加入t4dna连接酶继续反应，得到混合液b；其中，所述环形dna模板具有如seqidno：3所示的序列；
(3)在混合液b中加入引物1、引物2、脱氧核苷三磷酸和phi29dna聚合酶，调节反应体系的起始ph至8.2，孵育，再加入甲酚红指示剂，得到混合液c；
其中，所述引物1具有如seqidno：4所示的序列；所述引物2具有如seqidno：5所示的序列；
(4)提取步骤(3)所得混合液c的颜色数据，获得所述颜色数据中rgb各色数值；
(5)基于所述颜色数据中rgb各色数值，计算出r/g值；然后带入标准曲线的线性方程，计算得出待检液中三价铬离子的存在与否和/或含量。
进一步的，所述步骤(1)中的三价铬离子依赖型dna酶链与dna底物链的浓度比2.5:1。
进一步的，所述步骤(1)中的退火处理为92-98℃退火3-10分钟；更优选的，退火温度95℃，退火时间5分钟。
进一步的，所述步骤(2)中，在混合液a中加入dna环状模板链终浓度控制在0.7-1μm，于37℃反应1-2小时，然后加入t4dna连接酶终浓度为4u，于37℃反应1-2小时，接着95℃孵育10-15分钟终止反应，得到混合液b。
进一步的，所述步骤(3)中，在混合液b中加入引物1、引物2、脱氧核苷三磷酸和phi29dna聚合酶，并用1m的koh调节反应体系的起始ph至8.2，然后在33℃孵育4小时，反应结束后加入甲酚红指示剂，得到混合液c。
进一步的，所述步骤(3)中的引物1终浓度1-1.5μm,引物2终浓度2-3μm,引物1:引物2为1：2，脱氧核苷三磷酸终浓度400μm，phi29dna聚合酶终浓度8u。
进一步的，所述步骤(3)中加入甲酚红指示剂后，混匀溶液，并且甲酚红指示剂的终浓度为0.1-0.2mm。
进一步的，所述步骤(4)中的提取包括使用颜色数字化处理程序得到所述的颜色数据；且所述颜色数字化处理程序为将待提取对象的颜色信息转化为数值化信息的程序；且所述颜色数字化处理程序负载于智能终端上。
进一步的，所述步骤(4)中的提取还包括对待提取对象进行拍摄，每次拍摄角度一样，并获取所得照片的颜色数据。
进一步的，所述步骤(5)中的线性方程为：r/g＝1.540-0.118logc(r2＝0.993)，线性检测范围为0.5-500μm，检测下限为0.05μm。
进一步的，所述步骤(5)中的标准曲线拟合度r2为0.990-0.999；优选的拟合度r2为0.993。
本发明的第二目的在于提供一种检测三价铬离子的装置，包括：试剂盒和用于提取颜色数据的提取装置；其中，
所述试剂盒，包括：dna酶链，dna底物链，环形dna模板，引物1，引物2、t4dna连接酶、phi29dna聚合酶、甲酚红指示剂以及缓冲体系；其中，
所述dna酶链具有如seqidno：1所示的序列：
5'-tttttttttcgccataggtcaaaggtgggtgcgagtttactcgttatagtgactcgtgac-3'；
所述dna底物链具有如seqidno：2所示的序列：
5'-atcggtcacgagtcactat/ra/ggaagatggcgaaaaaaaaaaaaa-3'；
所述环形dna模板具有如seqidno：3所示的序列：
5'-tcgccatcttcctacccaccctaccgttcgtgttactctctataaactatttttttttttt-3'；
所述引物1具有如seqidno：4所示的序列：
5'-cgaacggtagggtgggta-3'；
以及，所述引物2具有如seqidno：5所示的序列：
5'-tactctctataaactagtag-3'；
所述提取装置包含一载体，以及记录于所述载体上的颜色数字化处理程序。
进一步的，所述缓冲体系由13μmtris,10mmmgcl2以及0.5mmatp(ph为8.2)组成。
本发明的再一目的在于提供上述检测三价铬离子的装置在现场实时快速检测三价铬离子存在与否和/或含量中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的铬离子的检测方法，有益效果在于：
本发明提供的铬离子的检测方法，利用重金属离子与dna酶作用的特异性，超分支滚环扩增产生大量氢离子的特性。三价铬离子依赖型dna酶在三价铬离子的激活下产生连接链，用于是环状dna模板链形成完整的环。在引物1，引物2，聚合酶的作用下发生超分支滚环扩增，使溶液中的ph值发生改变。再用智能手机拍摄下溶液颜色的变化，分析并计算出r/g值。通过r/g数值的变化，来计算出三价铬离子的浓度。
本发明提供的铬离子检测方法，具有操作方便、选择性高、灵敏度高、时间短等优点。
附图说明
图1为本发明提供的基于智能手机检测铬离子的方法的检测原理示意图；
图2为dna酶链和底物链不同比例而测得的吸光度柱形图；
图3为本发明提供的铬离子的检测方法的r/g图；
图4为本发明提供的铬离子的检测方法的标准曲线图；
图5为本发明提供的铬离子的检测方法的选择性测试结果示意图。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例中所用反应试剂均可通过市售获得。
实施例1：基于智能手机检测三价铬离子的方法
步骤1：将三价铬离子依赖型dna酶链(如seqidno：1所示)与dna底物链(如seqidno：2所示)按浓度比1.5-3:1混合，于92-98℃退火2-203-10分钟，然后加入待检液(含或不含三价铬离子)(加入量10μm)，得到混合液a；(dna酶链和dna底物链由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；所用容器为透明96孔板)
步骤2：将dna环状模板链(如seqidno：3所示，终浓度0.7-1μm)置于步骤1的混合液a中，于37℃反应1-2小时，然后加入t4dna连接酶(2μl100u，终浓度为4u)于37℃反应1-2小时，接着95℃孵育10-15分钟终止反应，得到混合液b；(t4dna连接酶由newenglandbiolabs公司提供)
步骤3：在步骤2的混合液b中，加入引物1(如seqidno：4所示，终浓度1-1.5μm),引物2(如seqidno：5所示，终浓度2-3μm)，引物1:引物2为1：2，脱氧核苷三磷酸终浓度400μm，phi29dna聚合酶终浓度8u，并用1m的koh调节反应体系的起始ph至8.2，然后在33℃孵育4小时，反应结束后加入甲酚红指示剂，混匀溶液，并且甲酚红指示剂的终浓度为0.1-0.2mm，得到混合液c；(脱氧核苷三磷酸、phi29dna聚合酶均由newenglandbiolabs公司提供；甲酚红由sigma-aldrich公司提供)
步骤4：将步骤3所得混合液c转移到透明的96孔板中，智能手机拍摄孔里的样品，用智能手机里的pixelpicker软件分析出r值，g值，b值；
步骤5：根据得到的颜色数据rgb数值，计算出r/g值，然后带入标准曲线的线性方程，计算得出三价铬离子的含量。
如图1所示，当反应体系中无铬离子时，溶液的颜色为红色；反应体系中有铬离子存在时，铬离子激活dna酶，产生连接链。连接链与环状滚环模板杂交，发生超分支滚环扩增，产生氢离子，溶液的颜色由红色变成黄色。
实施例2：dna酶链和底物链浓度比的优化筛选
将三价铬离子依赖型dna酶链与dna底物链分别按照1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1的浓度比混合，于95℃退火5分钟，然后加入浓度为1μm的三价铬离子，其余条件参数同实施例1。
吸光度检测：将96孔板放入酶标仪中进行吸光度测定，温度设置为常温。
由图2可以看出，当dna酶链和底物链浓度比例为2.5:1时，对应的吸光度相差值达到饱和。因此，在检测铬离子时，检测灵敏度较高。
综上，本发明提供的铬离子的检测方法，反应体系中dna酶链与底物链比例最佳为2.5:1。
实施例3：绘制标准曲线
设定反应体系体积为50μl，dna酶链和底物连浓度比例为2.5:1，待测溶液的铬离子浓度分别为0μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、25μm、50μm、75μm、100μm、200μm、500μm，其余条件参数同实施例1。
采用智能手机拍摄96孔板的样品溶液颜色，pixelpicker软件分析出r值，g值，b值，并计算出r/g值。
结合图3和图4可以看出，随着铬离子浓度的增加，r/g值越来越小。
由图4可以看出，本发明提供的铬离子的检测方法，线性方程为：r/g＝1.540-0.118logc(r2＝0.993)，线性关系好，线性检测范围为0.5-500μm，检测下限为0.05μm。
由此说明，本发明提供的铬离子的检测方法，具有较低的检测限，可满足实际检测要求。
实施例4：本发明检测方法的特异性测试
为测试本发明提供的铬离子的检测方法的选择性，选用几种常见的金属离子pb2 、al3 、cu2 、fe2 、fe3 、mn2 加入到检测环境中，进行干扰实验；其中，pb2 、al3 、cu2 、fe2 、fe3 、mn2 的浓度为20μm，cr3 的浓度为10μm，并增加空白组做对比实验。
设定反应体系体积为50μl，dna酶链和底物连浓度比例为2.5:1，待测溶液中的cr3 浓度为10μm，pb2 、al3 、cu2 、fe2 、fe3 、mn2 的浓度为20μm，其余条件参数同实施例1。
由图5可以看出，pb2 、al3 、cu2 、fe2 、fe3 、mn2 等金属离子对cr3 的检测基本不造成干扰，主要原因在于金属离子与dna酶作用的高特异性，进而说明本发明提供的铬离子的检测方法具有良好的选择性。
应用实施例：实际样品检测研究
采用实施例1的方法测定水、牛奶、果汁饮料、茶饮料(绿茶)中铬离子的浓度，检测结果如表1所示。可知，本发明的检测方法能够准确测定实际样品中铬离子浓度。
表1实际样品中铬离子浓度检测分析
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110>上海大学
<120>一种基于智能手机检测三价铬离子的方法
<130>权利要求书、说明书
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>60
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tttttttttcgccataggtcaaaggtgggtgcgagtttactcgttatagtgactcgtgac60
<210>2
<211>45
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atcggtcacgagtcactatraggaagatggcgaaaaaaaaaaaaa45
<210>3
<211>61
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcgccatcttcctacccaccctaccgttcgtgttactctctataaactattttttttttt60
t61
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cgaacggtagggtgggta18
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tactctctataaactagtag20
1.一种检测三价铬离子的方法，其特征在于，包括：
(1)将三价铬离子依赖型dna酶链与dna底物链按浓度比1.5-3:1混合，退火处理后加入待检液，得到混合液a；其中，所述dna酶链具有如seqidno：1所示的序列；所述dna底物链具有如seqidno：2所示的序列；
(2)在混合液a中加入dna环状模板链进行反应，然后加入t4dna连接酶继续反应，得到混合液b；其中，所述环形dna模板具有如seqidno：3所示的序列；
(3)在混合液b中加入引物1、引物2、脱氧核苷三磷酸和phi29dna聚合酶，调节反应体系的起始ph至8.2，孵育，再加入甲酚红指示剂，得到混合液c；
其中，所述引物1具有如seqidno：4所示的序列；所述引物2具有如seqidno：5所示的序列；
(4)提取步骤(3)所得混合液c的颜色数据，获得所述颜色数据中rgb各色数值；
(5)基于所述颜色数据中rgb各色数值，计算出r/g值；然后带入标准曲线的线性方程，计算得出待检液中三价铬离子的存在与否和/或含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的三价铬离子依赖型dna酶链与dna底物链的浓度比2.5:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的退火处理为92-98℃退火3-10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，在混合液a中加入dna环状模板链终浓度控制在0.7-1μm，于37℃反应1-2小时，然后加入t4dna连接酶终浓度为4u，于37℃反应1-2小时，接着95℃孵育10-15分钟终止反应，得到混合液b。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，在混合液b中加入引物1、引物2、脱氧核苷三磷酸和phi29dna聚合酶，并用1m的koh调节反应体系的起始ph至8.2，然后在33℃孵育4小时，反应结束后加入甲酚红指示剂，得到混合液c。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的引物1终浓度1-1.5μm,引物2终浓度2-3μm,引物1:引物2为1：2，脱氧核苷三磷酸终浓度400μm，phi29dna聚合酶终浓度8u。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中加入甲酚红指示剂后，混匀溶液，并且甲酚红指示剂的终浓度为0.1-0.2mm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的提取包括使用颜色数字化处理程序得到所述的颜色数据；且所述颜色数字化处理程序为将待提取对象的颜色信息转化为数值化信息的程序；且所述颜色数字化处理程序负载于智能终端上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的提取还包括对待提取对象进行拍摄，每次拍摄角度一样，并获取所得照片的颜色数据。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的线性方程为：r/g＝1.540-0.118logc(r2＝0.993)，线性检测范围为0.5-500μm，检测下限为0.05μm。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的标准曲线拟合度r2为0.990-0.999。
12.一种检测三价铬离子的装置，包括：试剂盒和用于提取颜色数据的提取装置；其中，所述试剂盒，包括：dna酶链，dna底物链，环形dna模板，引物1，引物2、t4dna连接酶、phi29dna聚合酶、甲酚红指示剂以及缓冲体系；
所述dna酶链具有如seqidno：1所示的序列；所述dna底物链具有如seqidno：2所示的序列；所述环形dna模板具有如seqidno：3所示的序列；所述引物1具有如seqidno：4所示的序列；以及所述引物2具有如seqidno：5所示的序列；
所述提取装置包含一载体，以及记录于所述载体上的颜色数字化处理程序。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于：所述缓冲体系由13μmtris,10mmmgcl2以及0.5mmatp(ph为8.2)组成。
14.根据权利要求12或13所述的检测三价铬离子的装置在现场实时快速检测三价铬离子存在与否和/或含量中的应用。
技术总结