一株黑臭底泥中苯并[a]蒽降解菌的筛选及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物降解技术和环境保护领域，具体涉及一株对苯并[a]蒽有 降解效果的菌株sg
‑
1(microbacterium laevaniformans)的筛选及其应用。


背景技术：

[0002]
我国现阶段黑臭底泥污染严重，其中的污染物种类繁多，除了日常用水产生 的氮磷等营养元素，还包括燃料燃烧、各类工业废水产生的各种重金属及难降解 有机物。多环芳烃类物质是黑臭底泥中的主要难降解有机物之一，因其具有较强 的疏水性、难降解性，在环境中能持久存在，使得黑臭底泥治理难度加大。另外， 多环芳烃是一类强有毒物质，会对人体造成致畸、致癌等危害。因此，如何有效 去除黑臭底泥中的多环芳烃成为目前底泥修复中的研究难点和热点。
[0003]
多环芳烃在黑臭底泥中主要附着于固体颗粒上，可采用物理处理(固化、生 物淋滤、湿式空气氧化)、化学处理(溶剂浸提、分解、化学脱毒等)及生物处 理(植物修复、动物修复、微生物修复)等技术去除。相较于物理及化学处理， 生物处理具有针对性强、经济成本低、不易造成二次污染等优势，是一种经济、 高效、生态友好型修复技术。微生物修复即利用微生物的氧化、还原、分离及转 移元素价态的能力去除环境中污染物。利用受污染环境中微生物较强的耐受性、 特定的适应性以及遗传多样性，通过驯化和富集培养具有专项性能的微生物来解 决特定环境中的污染问题，已成为目前解决土壤及底泥污染问题的重要发展方 向。
[0004]
现阶段，多环芳烃微生物菌剂研究主要是针对受污染土壤及活性污泥等环境 领域。其中，陶佳雨等人发现，麦冬等生长在多环芳烃污染土壤中的植物内可分 离出多环芳烃降解菌。kumar等人从油泥沉积物中筛选出了4种荧蒽降解菌，对 受荧蒽污染的油泥具有很好的修复效果。饶丽从受石油污染严重的高盐碱土壤中 筛选出三株耐盐性萘降解菌，通过基因检测，确定这三株菌均为假单胞菌属，并 发现这些菌株可能存在新的耐盐及萘降解机制。王晓朝从某焦化厂活性污泥中分 离筛选出了两种芴降解菌，研究表明，这两株菌能同时降解芘、菲等，因此可应 用于多环芳烃复合污染环境修复。然而，通过文献总结及对比发现，当前多环芳 烃微生物菌剂在黑臭底泥当中的应用较少，且很少有针对苯并[a]蒽降解菌的相 关研究。
[0005]
因此，从黑臭底泥中筛选单一的苯并[a]蒽降解菌，通过研究其生物学特性 及降解性能，可为黑臭底泥中苯并[a]蒽的生物处理提供技术支撑和理论依据。


技术实现要素：

[0006]
本发明首先提供了一种降解苯并[a]蒽的菌株，该菌株可有效降解苯并[a]蒽。
[0007]
具体地，一种降解苯并[a]蒽的菌株，命名为sg
‑
1(microbacteriumlaevaniformans)，保藏号：cgmcc no.20667。
[0008]
该菌株的具体保藏信息如下：
[0009]
名称：microbacterium laevaniformans
[0010]
保藏单位：中国科学院微生物研究所
[0011]
保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路3号院
[0012]
保藏时间：2020年9月18日
[0013]
保藏编号：cgmcc no.20667
[0014]
所述sg
‑
1(microbacterium laevaniformans)属于微杆菌属中的产左聚糖微 杆菌；该菌株的细胞为革兰氏阳性、无孢子形成的杆状细胞；其菌落呈圆形， 菌落颜色为金黄色，菌落中间凸起、边缘整齐，表面光滑有光泽，整体呈不透明 的奶油状。
[0015]
本发明进一步提供了一种用于降解苯并[a]蒽的菌株的筛选方法，从深圳市 茅洲河某河段采集黑臭底泥样品，在无菌室中对该底泥样品进行投加含单一目标 碳源的液体培养液逐级定向驯化后，用含单一目标碳源的固体培养基进行涂布并 置于30℃恒温箱倒置培养，经过多次分离，提纯出具有高效降解苯并[a]蒽的单 一优势菌株。
[0016]
具体地，一种用于降解苯并[a]蒽的菌株的筛选方法，包括以下步骤：
[0017]
1)从深圳市茅洲河某河段采集黑臭底泥样品，避光冷藏保存。取5g底泥 溶于10ml无菌水中，恒温振荡24h后，取1ml底泥浸出液接种于50ml苯并 [a]蒽浓度为1mg/l的液体培养基中。在30℃左右的条件下，以140r/min的转 速在摇床上培养7天。取2ml底泥富集液于50ml苯并[a]蒽浓度为10mg/l的 液体培养基，在相同的条件下培养7天。此操作重复4次，逐步提高苯并[a]蒽 浓度到100mg/l，达到富集驯化的目的；
[0018]
2)将驯化液逐级稀释，用接种环取稀释后驯化液在含苯并[a]蒽的无机盐固 体培养基上进行划线，在30℃左右的条件下，置于恒温培养箱中培养5天；
[0019]
3)挑取不同形态的成型菌落分别接种到新的含有苯并[a]蒽浓度为50mg/l 固体培养基上进行纯化培养。重复多次划线分离纯化，直至固体培养基上形成的 菌落形态一致，即得到具有高效降解苯并[a]蒽的单一优势菌株。
[0020]
作为本发明的一种优选技术方案，以液体培养基1l计，所述的液体培养液 由如下重量的组分组成：
[0021]
2.0g(nh4)2so4，0.2g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2·
2h2o，0.001g feso4·
7h2o，1.5g na2hpo4·
12h2o，1.5g kh2po4，0.004g mncl2·
4h2o，0.001g zncl2，0.001g cocl4·
6h2o，0.002g nicl2·
6h2o，0.0003g cuso4·
5h2o。
[0022]
进一步地，作为本发明的一种优选技术方案，以固体培养基1l计，所述的 固体培养基由如下重量的组分组成：
[0023]
2.0g(nh4)2so4，0.2g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2·
2h2o，0.001g feso4·
7h2o， 1.5g na2hpo4·
12h2o，1.5g kh2po4，0.004g mncl2·
4h2o，0.001g zncl2，0.001g cocl4·
6h2o，0.002g nicl2·
6h2o，0.0003g cuso4·
5h2o，18g琼脂。
[0024]
作为本发明的一种优选技术方案，利用固体培养基结合涂布法进行目标菌株 的纯化分离，即取100μl逐级驯化后的液体培养基进行梯度稀释，再通过固体 培养基实验方法步骤涂布到固体培养基上。放入30℃恒温培养箱中进行培养。7 天之后，同样用固体培养基实验方法挑出单菌落培养，在液体培养基中扩大培养 得到菌种，然后将菌液加入灭过菌的50ml离心管中，在6000r/min条件下离心 6min，弃去上清液。
[0025]
本发明用于降解苯并[a]蒽的菌株可用于处理含苯并[a]蒽的黑臭底泥。
[0026]
具体为将本发明用于降解苯并[a]蒽的菌株接种至含有苯并[a]蒽黑臭底泥的 塑料罐中，上覆一层10cm纯水后避光密封放置，获得了良好的苯并[a]蒽降解效 果。
[0027]
本发明用于降解苯并[a]蒽的菌株降解苯并[a]蒽在35℃、ph＝8条件下进行。 实验表明，该菌株可在100h内将液体培养基中不同初始浓度(5
‑
200mg/l，以 250ml锥形瓶体积计算)的苯并[a]蒽彻底降解；该菌株还有良好的底泥广谱性， 能将荧蒽、苯酚、邻苯二甲酸二甲酯作为碳源和能源加以利用。
[0028]
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
[0029]
本发明通过培养并重复多次划线分离纯化，直至固体培养基上形成的菌落形 态一致，即得到具有高效降解苯并[a]蒽的单一优势菌株，命名为sg
‑
1，sg
‑
1 (microbacterium laevaniformans)属于微杆菌属中的产左聚糖微杆菌；该菌株 的细胞为革兰氏阳性、无孢子形成的杆状细胞；其菌落呈圆形，菌落颜色为金黄 色，菌落中间凸起、边缘整齐，表面光滑有光泽，整体呈不透明的奶油状。
[0030]
本发明的降解苯并[a]蒽的菌株具有高效降解苯并[a]蒽的能力，较好耐高温 性，同时能够以荧蒽、苯酚、邻苯二甲酸二甲酯作为碳源和能源，可用于黑臭底 泥中苯并[a]蒽的生物降解处理过程。
附图说明
[0031]
图1为sg
‑
1在固体培养基上的生长状况；
[0032]
图2为sg
‑
1的分子生物学系统发育树；
[0033]
图3为单因素影响sg
‑
1降解苯并[a]蒽实验图；其中，(3a)ph的影响； (3b)温度的影响；(3c)苯并[a]蒽浓度的影响；(3d)投菌量的影响。
具体实施方式
[0034]
以下为结合具体实施例和附图对本发明进行进一步描述。所提供的实施例仅 是对本发明方法的说明，而不以任何方式限值本发明的其它内容。
[0035]
【实施例1】苯并[a]蒽降解菌的驯化及筛选
[0036]
1.菌株的驯化培养
[0037]
本实验样品采自广东省深圳市茅洲河某河段的黑臭底泥，采集后立即放于实 验室4℃冷库中避光保存。取5g底泥溶于10ml无菌水中，恒温振荡24h后， 取1ml底泥浸出液接种于50ml苯并[a]蒽浓度为1mg/l的液体培养基中。在 30℃左右的条件下，以140r/min的转速在摇床上培养7天。取2ml底泥富集液 于50ml苯并[a]蒽浓度为10mg/l的液体培养基(培养基成分：2.0g/l(nh4) 2
so4，0.2g/l mgso4·
7h2o，0.01g/l cacl2·
2h2o，0.001g/l feso4·
7h2o，1.5g/l na2hpo4·
12h2o，1.5g/l kh2po4，0.004g/l mncl2·
4h2o，0.001g/l zncl2，0.001g/l cocl4·
6h2o，0.002g/l nicl2·
6h2o，0.0003g/l cuso4·
5h2o)，在相同的条 件下培养7天。此操作重复4次，逐步提高苯并[a]蒽浓度到100mg/l，达到富 集驯化的目的。sg
‑
1在固体培养基上的生长状况如图1所示。
[0038]
2.菌株的筛选纯化
[0039]
苯并[a]蒽降解菌的筛选纯化：将驯化液逐级稀释，用接种环取稀释后驯化 液在含苯并[a]蒽的无机盐固体培养基(培养基成分：2.0g/l(nh4)2so4，0.2g/l mgso4·
7h2o，
0.01g/l cacl2·
2h2o，0.001g/l feso4·
7h2o，1.5g/l na2hpo4·
12h2o，1.5g/l kh2po4，0.004g/l mncl2·
4h2o，0.001g/l zncl2，0.001g/l cocl4·
6h2o，0.002g/l nicl2·
6h2o，0.0003g/l cuso4·
5h2o，18g/l琼脂) 上进行划线，在30℃左右的条件下，置于恒温培养箱中培养5天。挑取不同形 态的成型菌落分别接种到新的含有苯并[a]蒽固体培养基上进行纯化培养。重复 多次划线分离纯化，直至固体培养基上形成的菌落形态一致，即得到具有高效降 解苯并[a]蒽的单一优势菌株。将该菌株进行斜面平板划线，待长出菌落后进行 菌种鉴定。菌株命名为sg
‑
1。
[0040]
3.菌株形态及分子生物学鉴定
[0041]
sg
‑
1(microbacterium laevaniformans)属于微杆菌属中的产左聚糖微杆菌； 该菌株的细胞为革兰氏阳性、无孢子形成的杆状细胞；其菌落呈圆形，菌落颜色 为金黄色，菌落中间凸起、边缘整齐，表面光滑有光泽，整体呈不透明的奶油状。 对得到的用于降解苯并[a]蒽的菌株进行16s rdna测序，包括了菌株dna提取、 16s rdna体外pcr扩增((使用16s通用引物27f和1492r，27f：5
′‑
agagtttgatcctggctcag
‑3′
)，1492r：5
′‑
taccttgttacgactt
‑3′
) 获得1500bp的基因片段。。将测序得到的序列结果带入ncbi的数据库中进行 blast基因序列比对，经过mega软件分析，与数据库中相似菌株的16s rdna 序列进行比对，建立菌株16s rdna系统发育树，如图2所示。结果表明该菌株 与microbacterium laevaniformans的亲缘关系最近，相似性高达99％以上。因此 将该菌株归属为microbacterium laevaniformans属，并命名为sg
‑
1。
[0042]
该菌株长期保存于中国科学院微生物研究所，地址：中国北京市朝阳区北辰 西路3号院，保藏日期：2020年9月29日，保藏编号：cgmcc no.20667。
[0043]
【实施例2】sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解特性
[0044]
1.不同ph条件(5
‑
9)下sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解特性
[0045]
将sg
‑
1接种于含100mg/l苯并[a]蒽的新鲜无机盐培养液中，置于30℃、 140r/min恒温培养箱中富集培养至对数生长期。将富集液在6000r/min条件下离 心6min，弃去上清液后用灭过菌的磷酸盐缓冲液重悬浮并再次离心，重复操作 三次后，将菌悬液od600调至0.2，冷藏备用。
[0046]
用1mol/l hcl(43ml浓盐酸用去离子水定容到500ml配置)和1mol/l naoh(4g naoh溶于100ml去离子水中配置)将灭过菌的含有200mg/l苯并 [a]蒽新鲜无机盐培养液的ph值分别调节到ph＝5、ph＝6、ph＝7、ph＝8、ph＝9， 分别接种2％的菌悬液，置于30℃、140r/min恒温培养箱中连续培养，间隔一定 时间取样分析(结果如图3(a))。每个ph值设计三个平行样。结果表明，当 ph在5
‑
9之间时，ph的变化对sg
‑
1的影响较小。当ph为8时，sg
‑
1能达到 最佳的降解效果；当ph大于8或者小于8时，sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解会受到 不同的抑制。
[0047]
结果表明，sg
‑
1在碱性条件下能更好地降解苯并[a]蒽，而碱性条件对其降 解苯并[a]蒽的抑制作用较明显。
[0048]
2.不同温度(15
‑
40℃)下sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解特性
[0049]
将sg
‑
1接种于含100mg/l苯并[a]蒽的新鲜无机盐培养液中，置于30℃、 140r/min恒温培养箱中富集培养至对数生长期。将富集液在6000r/min条件下离 心6min，弃去上清液后用灭过菌的磷酸盐缓冲液重悬浮并再次离心，重复操作 三次后，将菌悬液od600调至
0.2，冷藏备用。
[0050]
向灭过菌的含有200mg/l苯并[a]蒽新鲜无机盐培养液(ph＝8)中接种2％的菌 悬液，置于温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃及40℃的恒温培养箱 (140r/min)中连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图3(b))。每个温 度设计三个平行样。结果表明，sg
‑
1在高温条件下表现出较好的降解特性。在 15℃时，培养100h后sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解率只有70％左右，说明低温不利 于sg
‑
1降解苯并[a]蒽。
[0051]
结果表明：其在40℃的条件下的降解效果较为突出，说明sg
‑
1具有较好的 耐高温性。
[0052]
3.不同苯并[a]蒽(5
‑
200mg/l)下sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解特性
[0053]
将sg
‑
1接种于含100mg/l苯并[a]蒽的新鲜无机盐培养液中，置于30℃、 140r/min恒温培养箱中富集培养至对数生长期。将富集液在6000r/min条件下离 心6min，弃去上清液后用灭过菌的磷酸盐缓冲液重悬浮并再次离心，重复操作 三次后，将菌悬液od600调至0.2，冷藏备用。
[0054]
向灭过菌的苯并[a]蒽浓度分别为5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/、 200mg/l新鲜无机盐培养液(ph＝8)中接种2％的菌悬液，置于30℃、140r/min恒 温培养箱中连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图3(c))。每个浓度 设计三个平行样。结果表明，当苯并[a]蒽浓度逐渐增大后，sg
‑
1对苯并[a]蒽的 去除率逐渐降低，但是到23h后，sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解速率逐渐增大。这是 因为当苯并[a]蒽浓度增大以后，由于底物充足，单位时间内生长的微生物量增 多，所以后期对苯并[a]蒽的降解速率也逐渐增大。但是由于底物浓度增加量比 微生物降解量更多，所以苯并[a]蒽去除率随着其浓度增大而降低。另外，sg
‑
1 对苯并[a]蒽耐受性较好，当苯并[a]蒽浓度为200mg/l时，100h内降解率即可达 到96％。
[0055]
4.不同投菌量(0.1
‑
5％)下sg
‑
1对苯并[a]蒽的降解特性
[0056]
将sg
‑
1接种于含100mg/l苯并[a]蒽的新鲜无机盐培养液中，置于30℃、 140r/min恒温培养箱中富集培养至对数生长期。将富集液在6000r/min条件下离 心6min，弃去上清液后用灭过菌的磷酸盐缓冲液重悬浮并再次离心，重复操作 三次后，将菌悬液od600调至0.2，冷藏备用。
[0057]
向灭过菌的苯并[a]蒽浓度分别为200mg/l新鲜无机盐培养液(ph＝8)中分别 接种0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％的菌悬液，置于30℃、140r/min恒温培养 箱中连续培养，间隔一定时间取样分析(结果如图3(d))。每个浓度设计三 个平行样。
[0058]
结果表明，当投菌量逐渐增大时，sg
‑
1对苯并[a]蒽的去除率也逐渐增大； 23h后，苯并[a]蒽降解速率也逐渐增大，这是因为投菌量增大后，单位时间内微 生物的增量也更大。
[0059]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种降解苯并[a]蒽的菌株，其特征在于，命名为sg
‑
1(microbacterium laevaniformans)，保藏号：cgmcc no.20667。2.一种基于权利要求1所述的降解黑臭底泥中苯并[a]蒽的菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取深圳市茅洲河多点位的黑臭底泥共5g，加入500ml超纯水，置于搅拌器上搅拌24h后，取5ml悬浮液加入到145ml灭菌的以苯并[a]蒽液为单一碳源的液体培养液中，恒温培养7天；(2)培养一段时间后，取5ml培养液加入到145ml灭菌的新鲜液体培养液中，继续恒温培养。重复该步骤5次，逐次增大苯并[a]蒽浓度，最终得到驯化后的苯并[a]蒽降解菌群；(3)基于涂布法，借助固体培养基进行目标菌株的纯化分离，得到用于降解苯并[a]蒽的菌株。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，降解苯并[a]蒽的菌株的培养方法，以液体培养基1l计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：2.0g(nh4)2so4，0.2g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2·
2h2o，0.001g feso4·
7h2o，1.5g na2hpo4·
12h2o，1.5g kh2po4，0.004g mncl2·
4h2o，0.001g zncl2，0.001g cocl4·
6h2o，0.002g nicl2·
6h2o，0.0003g cuso4·
5h2o。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，降解苯并[a]蒽的菌株的培养方法，以液体培养基1l计，所述的液体培养基由如下重量的组分组成：2.0g(nh4)2so4，0.2g mgso4·
7h2o，0.01g cacl2·
2h2o，0.001g feso4·
7h2o，1.5g na2hpo4·
12h2o，1.5g kh2po4，0.004g mncl2·
4h2o，0.001g zncl2，0.001g cocl4·
6h2o，0.002g nicl2·
6h2o，0.0003g cuso4·
5h2o，18g琼脂。5.根据权利要求3或4所述的筛选方法，其特征在于，所述的培养液/基组分，将培养液/基的ph调至7.0左右，在121℃条件下密封灭菌20min后，冷却后用于培养降解菌。6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述的方法的培养的温度为30℃，转速为140r/min，培养时长为5
‑
7天，苯并[a]蒽浓度为0
‑
100mg/l，且不为0。7.权利要求1所述的菌株应用于含苯并[a]蒽的黑臭底泥中，降解苯并[a]蒽。
技术总结
本发明公开了一株用于降解黑臭底泥中苯并[a]蒽的菌株，菌株命名为SG


技术研发人员：王宏杰 董文艺 周婷 王锋 赵子龙 杨墨
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学（深圳）
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29