基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法及其生产方法与流程

1.本发明涉及葛根汤的制备工艺的质量控制方法，具体涉及一种百合地黄汤固体制剂的制备工艺。


背景技术：

2.葛根汤出自汉代张仲景的《伤寒论》，为辛温解表剂，具有发汗解表，升津舒筋之功效。葛根汤颗粒现行标准收载于《中国药典》2015年版一部，用于风寒感冒，症见：发热恶寒，鼻塞流涕，咳嗽咽痒，咯痰稀白，无汗，头痛身疼，项背强急不舒，苔薄白或薄白润，脉浮或浮紧。
3.葛根汤来源于中医经典方剂，包括葛根60g，麻黄45g，桂枝30g，生姜45g，炙甘草30g，赤芍30g，大枣45g或者按照此重量比例混合均匀，以上7味，加水2000ml或者按照此体积比例添加，先煮葛根和麻黄，武火煎开，文火煮至1600ml或者煮至此体积比例，祛除白沫，加入其余药味，文火煮至600ml或者煮至此体积比例，即得颗粒。
4.为了对中药组分进行有效地质量监控，必须对原料成分进行鉴别和有效含量的测定。其中，薄层鉴别法是药物质量标准建立中常用的方法，鉴别时将适宜的固定相涂抹在玻璃板、塑料或铝片上，从而形成均匀的薄层，展开后根据比移植与适宜的对照物进行对比，从而完成药品的鉴别、含量的测定。
5.近年来，利用指纹图谱技术来检测中药组分成为高效便捷的质量检测或监控的方法。所谓指纹图谱技术，是利用高效液相色谱(hplc)对中药提取溶液进行液相质谱分析，通过图谱中表征中药特定组分的图谱特定峰线及其组合，以形成该中药特有的指纹图谱，从而完成对中药制剂的质量检测或监控。
6.例如，肖洪贺(葛根汤hplc指纹图谱及多指标成分定量分析，《中国实验方剂学杂志》，2015年底15期)公开了对葛根汤建立指纹图谱，分析38个共有峰，通过对比对照品、单味药材、阴性样品、葛根汤样品出峰位置，35个共有峰得到归属，10个共有峰得到化学成分指认，以及选取与其抗原发性痛经活性密切相关的14个指标成分。虽然该文献全面分析了葛根汤的所有可鉴别的指纹峰，但鉴别指标太多，需要分析和校对的数据处理量太大，并不适合利用葛根汤的指纹图谱进行快速初步的定性鉴别。
7.申请人和发明人在先的发明专利申请cn201711009683.7、“一种中药制剂的制备工艺”公开了利用指纹图谱对包括葛根汤在内的多种制剂进行鉴别分析。该方法包括对于制备的小柴胡汤颗粒提取液，根据柴胡、黄芩、人参、制半夏、炙甘草、生姜、大枣的所有hplc质谱峰选择特征指纹图谱，从而为7种成分分别建立各自的特征指纹图谱，取得较好的检测效果。该发明基于该检测方法，还建立了小柴胡汤制剂的新制备方法。然而，该发明实质上公开了针对小柴胡汤的指纹图谱模型的建立过程，既未公开葛根汤的指纹图谱模型，同时需要通过大量试验测试7种药味的各自的指纹特征峰，因此也未公开具有鉴别意义的特征指纹峰及其用途，这对于建立指纹图谱的过程带来繁琐和不便。因此也不符合现有技术中利用葛根汤的指纹图谱进行快速初步的定性鉴别的需求。
8.至于其他中药制剂的指纹图谱研究，例如，郑如文(小柴胡颗粒的高效液相指纹图谱研究，《中国医院用药评价与分析》2017年第17卷第8期)报道了利用hplc对小柴胡颗粒与其组成的7味中药(党参、甘草、大枣、生姜、柴胡、黄芩、半夏)的指纹图谱进行对比分析，并研究了小柴胡颗粒指纹图谱共有模式中35个共有峰中的26个峰在7味中药中的分布情况；而根据每味药材所对应的共有峰特点，可在一定程度上反应出小柴胡颗粒中药材的使用情况，从药材角度辨别出产品质量。然而该方法需要通过大量试验测试共有的特征峰，同时所检测的指纹峰多达26个，这对于建立指纹图谱的过程带来繁琐和不便。
9.魏惠珍(麻杏石甘汤多波长切换指纹图谱研究，《时珍国医国药》2012年第23卷第1期)报道了利用agilent1100
‑
dad检测器，流动相:乙腈
‑
0.1％磷酸，梯度洗脱，检测波长:0
‑
32min:215nm；32
‑
40min:350nm；40
‑
50min:254nm；进样量10μl，柱温:25℃，流速:1ml/min，确定了麻杏石甘汤中12个共有指纹峰，从而建立hplc指纹图谱模型。该方法可在一定程度上反应出麻杏石甘汤中药材的使用情况，从药材角度辨别出产品质量。然而，该方法需要通过大量试验测试共有的特征峰，同时所检测的指纹峰多达12个，这对于建立指纹图谱的过程带来繁琐和不便。
10.中国授权发明专利cn201510597933.8、发明名称“一种麻杏石甘汤配方颗粒的检测方法”公开了包括红外指纹图谱、薄层定性鉴别及hplc含量测定来检测麻杏石甘汤的质量的方法，其中以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷作为特征峰，建立hplc指纹图谱模型，取得较好的检测效果。然而，该方法需要预先进行红外指纹图谱和薄层分层分析进行初筛，才能得到较少的3个特征指纹峰，整个过程对于建立指纹图谱的过程也带来繁琐和不便。
11.由此可见，现有技术中，对于通过指纹图谱来完成中药的质量检测或监控，以及通过该方法所建立的中药制备方法，普遍存在需要摸索和建立多个药味的特征指纹峰。然而，葛根汤药材成分多达7种，而可检出的活性成分可能达到上百种。如果对于成品的颗粒中的不同活性成分进行逐一鉴别，并进行确定特征指纹峰，则需要相当大的筛选工作。因此对建立葛根汤的指纹图谱检测方法带来更多的技术障碍。
12.因此，目前需要一种通过指纹图谱法对葛根汤的产品质量进行质量监控的方法，以及需要基于该质量监控方法所带来的规范化生产方法。


技术实现要素：

13.本发明原理在于：本发明打破了“对中药组合物中多组分需要进行反复摸索和筛选适宜的指纹峰，才可建立足以表征各种特定药材的指纹图谱模型”的传统研究方式，首次提出了：预先使用标准供试品摸索具有最佳质谱参数的指纹质谱系统，然后用该质谱系统测试单味药的标准对照样品，一次性摸索和确定极少数特定组分的指纹峰，从而建立简化的定性和定量指纹图谱模型。该简化的指纹图谱模型能初步定性筛选不合格质量的葛根汤产品，并能对合格产品进行定量分析。随后联合更全面的薄层层析鉴别法对合格质量产品进行全面分析，从而具有简化质量检测工艺、保留精确定量分析的效果、提高检测效率的技术效果。
14.因此，本发明第一目的是提供一种联合指纹图谱和薄层层析法来对葛根汤制剂进行快速检测方法，步骤包括：
15.(1)建立简化的定性指纹图谱质谱模型，包括：
16.①
称取10批葛根汤颗粒的适量样品，各加水50ml溶解并定容后，作为待测品溶液
17.②
将各待测品溶液进样分析；
18.③
分析待测品溶液的指纹参数，选择葛根素指纹峰的出峰时间约20min，另在出峰时间约24min出现杂峰的色谱条件，建立简化的标准指纹图谱模型；
19.(2)取供试品颗粒约0.2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液；
20.(3)将供试品溶液进样检测，得到色谱图；
21.(4)比较供试品溶液和上述定性指纹图谱模型在出峰时间约20min和约24min的流出的色谱峰以及mau值是否一致，mau是毫吸光度单位(mabsorbance unit)的缩写，如果一致则进行下一步检测，如果不一致直接判定待测样品不合格；
22.(5)对通过质量初筛的待测样品，取待测样品滤液，加入萃取剂进行萃取，合并萃取液；
23.(6)将萃取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液；另用相同方法平行制备阳性对照和阴性对照溶液；
24.(7)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液，分别置于同一硅胶g薄层板上，在薄层鉴别展开剂上展开，取出；
25.(8)加入显色溶液，用热风加热至斑点显色清晰，并置于阳光或紫外光下检视；
26.(9)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点，如果供试品和阳性对照在相应位置上出现相同颜色斑点，且阴性无干扰斑点，则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相近的药物成分；
27.其中，
28.对于葛根、麻黄、甘草、赤芍，以氯仿
‑
甲醇
‑
水(30:10:0.8)为展开剂；
29.对于桂枝和生姜，以石油醚(60
‑
90℃)
‑
氯仿
‑
乙酸乙酯(2:1:1)为展开剂；
30.在一个实施方案中，步骤
②
按照以下参数进样检测，
31.仪器：agilent1100，色谱柱：agela venusil mp c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；
32.柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：250nm；
33.流动相：乙腈
‑
水；
[0034][0035]
进一步的，其中步骤(4)中的判定一致的过程包括：将葛根素参照物峰相应的峰为s峰，计算各主要峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积；其中供试品指纹图谱与对照指纹
图谱的相似度不得低于0.90，且相对保留时间及相对峰面积在规定值的
±
10％之内，表明待测样品符合初级质量标准，如果未达到上述标准直接判定待测样品不合格。
[0036]
进一步的，步骤(6)中，分别将葛根、麻黄、甘草、赤芍、桂枝和生姜，加适量水，煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至20ml，置分液漏斗中，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次15ml，收集乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解；
[0037]
进一步的，步骤(7)中，分别吸取供试品溶液和麻黄、甘草、赤芍对照药材溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇
‑
水(30:10:0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm波长下分析亮蓝色荧光斑点；或，喷以香草醛硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，分析图谱中可见斑点。
[0038]
进一步的，步骤(7)中，分别吸取6
‑
姜辣素对照品溶液、桂枝对照药材溶液和供试品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60
‑
90℃)
‑
氯仿
‑
乙酸乙酯(2:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm波长下分析亮蓝色荧光斑点；或，喷以香草醛硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，分析图谱中可见斑点。
[0039]
本发明第二个目的是提供一种葛根汤制剂的制备方法，包括将7味药加水煎煮，滤过，合并煎液，滤液减压浓缩至清膏，加入麦芽糊精适量，干燥或粉碎，制成葛根汤颗粒，对所制备的颗粒进行质量检测，并根据质量检测结果指导产品规范化生产，其中该质量监控或检测步骤的特征包括：
[0040]
上述步骤(1)
‑
(9)。
[0041]
进一步的，其中包括，分别以重量比为6：4.5：3：4.5：3：3：4.5，称取葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣的饮片。
[0042]
进一步的，其中先葛根和麻黄加水煎煮，然后加入其它饮片，加热煮沸，煎煮1.5小时；
[0043]
进一步的，其中将微沸后的提取液过滤后，然后通过减压低温浓缩，浓缩到相对密度为1.01～1.20；
[0044]
进一步的，其中浓缩液加入辅料或不加辅料，混匀，通过喷雾干燥快速干燥成粉末；
[0045]
进一步的，其中将获得的粉末，通过湿法制粒、干法制粒或沸腾制粒制备成颗粒剂；
[0046]
进一步的，其中按照步骤1
‑
4所建立的指纹色谱模型，对产品进行色谱分析。如果分析结果证明含有预期的葛根素峰和另一特征指纹峰，则判断产品初步合格，并进行下一工序的全成分检测，如果未见预期的指纹峰，则判定不合格，则停止生产，检查所有原料和生产工序；
[0047]
进一步的，其中按照步骤5
‑
9的确定的2种展开剂组合，对葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣进行薄层层析鉴别，根据鉴别结果，确定产品是否符合质量标准要求，如果根据薄层层析结果判定质量合格，则进行总混等后续工序。如果根据薄层层析结果判定不合格，则停止生产，检查所有原料和生产工序。
[0048]
进一步的，将颗粒分装成5g/袋，复合膜包装。
[0049]
进一步的，所谓质量监控包括对产品的质量进行检测和评价，并判断产品质量是否合格，从而确定是否继续或中断产品的生产过程，并指导产品规范化生产，在具体的实施
方案中，在完成整粒工序后，随机抽取样品，使用前述展开剂组进行薄层层析鉴别，以确定是否继续或中断产品的生产过程。
[0050]
与传统工艺相比，本发明具有以下优点：
[0051]
1、现有的指纹图谱法需要确定中药中多种成分的特征图谱。而本发明相应的药材多至7种，可作为特征图谱的成分指纹峰多达上百种，因此需要通过指纹图谱来完成药材的鉴定存在极大的技术困难。本发明创造性：预先摸索具有最佳色谱参数的指纹色谱系统，然后通过确定的指纹色谱系统一次性摸索和确定少量特定组分的指纹峰，从而建立简化的指纹图谱模型。该方法具有初筛检测的作用，符合的再进行综合的薄层层析法，不符合的直接淘汰。这种发明构思，既可以避免需要摸索指纹图谱的繁琐建立过程，同时又避免了直接进行综合性薄层层析的精确质量检测所带来的不必要的浪费；
[0052]
2、为了进一步提高色谱初筛系统的检测稳定性，本发明在进行指纹图谱质量初筛的检测方法之前，还引入用于测量色谱条件与系统适用性的预试验，以及通过大量试验验证了该指纹图谱色谱模型的稳定性和准确性；
[0053]
3、为了进一步检测组合物中是否包含所有药味，在以上基础上，将该初筛系统进一步联合预先确定的更全面tlc检测方法，对合格的药物组合物再次进行定性和定量分析，从而确定是否包含所有符合质量要求的药味。其中，本颗粒薄层色谱鉴别省略了作为佐药的大枣，但增加了桂枝和生姜2种原料药材，采用2种展开系统鉴别处方中6个药材，较《中国药典》收载的4种展开条件鉴别4种药材更加高效；
[0054]
4、发明的质量检测方法中，涉及大量具体的检测数据点值，虽然导致保护范围较为狭窄，但是通过各种具体检测数据点值，排除了效果较差或不足的不合格产品，这非常适合于建立稳定的质量控制标准，符合中药生产的需要；
[0055]
5、本发明通过使用指纹图谱质谱模型、薄层色谱和改进的含量测定等检测方法对产品质量进行全面监控，检验方法较药典方法更加严格，以保证成药的市场化。
附图说明
[0056]
图1：实施例1中葛根素对照品紫外光谱图；
[0057]
图2：实施例1中水、甲醇、乙醇制备的供试品图谱；
[0058]
图3：实施例1中不同提取方法的供试品图谱；
[0059]
图4：实施例1中确定的葛根汤标准指纹图谱；
[0060]
图5：实施例2中供试品、阴性对照与葛根素对照品图谱；
[0061]
图6：实施例3中365nm波长下在葛根和葛根汤样品图谱；
[0062]
图7：实施例3中麻黄、甘草、赤芍和葛根汤样品的香草醛硫酸试液显色斑点图谱；
[0063]
图8a：实施例3中365nm波长下在桂枝、葛根和葛根汤样品图谱；
[0064]
图8b：实施例3中生姜和葛根汤样品的香草醛硫酸试液显色斑点图谱；
[0065]
图9：实施例5中涉及质量检测的制备葛根汤的流程示意图。
具体实施方式
[0066]
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
[0067]
实施例1、指纹图谱色谱的优化条件的确定
[0068]
基于指纹图谱对葛根汤颗粒制备过程的质量控制，进行了以下步骤的试验摸索：
[0069]
分组实验1.1色谱条件与系统适用性预试验：
[0070]
1.1色谱柱选择：由于待测成分葛根素为黄酮类成分，所以选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，本试验使用色谱柱有：a为agela venusil mpc18(4.6
×
250mm，5μm)；b为phenomenex gemini c18(4.6
×
250mm，5μm)；c为：techway jade
‑
pak ods
‑
aq(4.6
×
250mm，5μm)。
[0071]
1.2检测波长选择：
[0072]
取葛根素对照品，用甲醇溶解，于200
‑
400nm范围进行紫外扫描，记录紫外扫描图谱，结果请参阅图1，图1为葛根素对照品紫外光谱图；
[0073]
由紫外扫描结果，葛根素对照品在250nm和305nm波长处有较大吸收，药典方法选择了250nm测定，于是保留药典方法中的250nm为供试品的检测波长。
[0074]
1.3色谱条件的确定：通过流动相的改进和检测波长的比较，确定了葛根汤颗粒中葛根素含量测定的色谱条件：
[0075]
色谱柱：c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；
[0076]
柱温：30℃；
[0077]
流速：1ml/min；
[0078]
检测波长：250nm；
[0079]
流动相：乙腈
‑
水；
[0080][0081][0082]
分组实验1.2提取溶剂的选择：
[0083]
取供试品(批号：20200220)约0.2g，精密称定，置具塞三角瓶中，分别精密加入水、甲醇、乙醇各50ml，密塞，称定重量，分别进行超声处理(250w，40khz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失重量，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，用液相色谱测定含量，结果如下：
[0084][0085]
三种溶剂制备的供试品图谱请参阅图2，图2为水、甲醇、乙醇制备的供试品图谱，从图2的结果可见水提取效果最好，甲醇次之，而乙醇的提取效果不佳，于是选择水作为提取溶剂。
[0086]
分组实验1.3不同提取方法考察：
[0087]
取供试品(批号：20200220)约0.2g，平行2份，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，分别进行超声处理(250w，40khz)、加热回流、振摇提取30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，用液相色谱测定含量：
[0088][0089]
结果请参阅图3，图3为不同提取方法的供试品图谱，结果可见3种提取方法，样品含量基本一致，故供试品只要溶解就能满足要求，于是制备方法改为加50ml水，使溶解。
[0090]
1.4指纹图谱方法的最终优化参数：
[0091]
根据上述实验得到最佳的指纹图谱条件如下，标准指纹图谱见图4：
[0092]
提取溶剂：水；
[0093]
仪器：agilent1100
[0094]
色谱柱：agela venusil mp c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；
[0095]
柱温：30℃；
[0096]
流速：1ml/min；
[0097]
检测波长：250nm；
[0098]
流动相：乙腈
‑
水；
[0099][0100][0101]
结果请参阅图4，图4为葛根汤标准指纹图谱，结果显示，选择葛根素指纹峰的出峰时间是约20min，另在出峰时间约24min的出现杂峰.
[0102]
实施例2：对确定的标准指纹图谱模型，进行验证和样品检测；
[0103]
2.1对标准指纹图谱模型，验证准确度
[0104]
精密称取葛根素对照品(批号：110752
‑
201514，纯度95.5％，中国食品药品检定研究院)19.70mg，加甲醇溶解并定容至20ml，即得浓度为0.9408mg/ml的对照品储备液i。精密量取对照品储备液i 0.5ml、1.0ml和1.5ml，置具塞锥形瓶中，精密称取已知含量的供试品(批号：20200220，含量9.6mg/g)0.1g，置上述锥形瓶中，按照拟定的含量测定方法测定含量，计算葛根素的回收率为100.0％，rsd＝0.80％(n＝9)，结果详见见表1：
[0105]
表1 葛根汤颗粒样品加样回收率试验结果表
[0106][0107]
如表1所示，该质谱模型的检测方法准确度良好。
[0108]
2.2对标准指纹图谱模型，验证重复性和精密度
[0109]
2.2.1重复性
[0110]
取同一供试品(批号：20200220)，精密称取6份，按含量测定方法测定，结果葛根素含量为9.6mg/g，rsd＝0.45％(n＝6)，说明本方法的重复性良好。结果见表2：
[0111]
表2 重复性试验结果
[0112][0113]
2.2.2中间精密度
[0114]
取同一供试品(批号：20200220)，由不同实验人员分别使用不同仪器按照重复性试验要求测定6份平行样品，结果含量为9.63mg/g，rsd＝0.45％(n＝12)，说明中间精密度良好，结果见表3：
[0115]
表3 中间精密度试验结果
[0116][0117][0118]
2.3对多种样品进行指纹图谱模型的定性初筛检测
[0119]
按照上述方法，制备葛根素对照品溶液、葛根汤汤颗粒供试品溶液与黄芩阴性对
照溶液。
[0120]
将葛根素对照品溶液、葛根汤汤颗粒供试品溶液与黄芩阴性对照溶液同时按含量测定的方法测定，比较图谱，图谱详见图5，图5为供试品、阴性对照与葛根素对照品图谱；
[0121]
其中，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版本)计算与所建立的定性指纹图谱模型的相似度：将黄芩苷对照品峰相应的峰为s峰，计算测试品主要峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积；其中供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，且相对保留时间及相对峰面积在规定值的
±
10％之内，表明待测样品符合初级质量标准，如果未达到上述标准直接判定待测样品不合格。
[0122]
结果表明，供试品溶液色谱图中，在与葛根素色谱峰相应的保留时间处呈现相同的色谱峰，相似度超过0.95，分离效果良好，在黄芩阴性对照溶液的色谱图中，在与葛根素色谱峰相应的保留时间处未出现相同的色谱峰，说明阴性无干扰。
[0123]
实施例3、摸索和筛选不同的提取溶剂(即萃取剂)：
[0124]
3.1.仪器与试药
[0125]
3.1.1仪器
[0126]
薄层自动成像仪(camag tlc visualizer2，瑞士camag公司)、薄层板加热板(camag tlc plate heaterⅲ，瑞士camag公司)、电子天平(mettler me2002e，梅特勒
‑
托利多仪器(上海)有限公司)、电子天平(mettler ms 204ts，梅特勒
‑
托利多仪器(上海)有限公司)、超声波清洗器(kq
‑
300de，昆山市超声仪器有限公司)、医用离心机(湘仪h1850湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、恒温水浴锅(hws
‑
26型)、平面色谱点样仪(spdy
‑
1a，南京迈科理特科学仪器有限公司)、硅胶g薄层预制板(青岛海洋化工厂)、硅胶g薄层预制板(德国merck)。
[0127]
3.1.2试药与试剂
[0128]
葛根对照药材(批号：121551
‑
201805)，葛根素对照品(批号：110752
‑
201514)，桂枝对照药材(批号：121191
‑
201605)，麻黄对照药材(批号：121051
‑
201005)，赤芍对照药材(批号：121093
‑
201804)，甘草对照药材(批号：120904
‑
201519)，6
‑
姜辣素对照品(批号：111833
‑
201806)均采购于中国药品生物制品鉴定研究院，其余试剂均为分析纯。
[0129]
葛根汤颗粒三批，由广东志道医药科技有限公司提供。
[0130]
3.2.溶液制备
[0131]
3.2.1供试品溶液制备
[0132]
取本品1g，加水20ml，超声溶解，置分液漏斗中，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次15ml，收集乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。
[0133]
3.2.2对照药材及对照品溶液制备
[0134]
3.2.2.1对照药材溶液制备
[0135]
分别取葛根1g、麻黄1g、甘草0.5g、桂枝0.5g和赤芍0.5g的对照药材，分别加适量水，煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至20ml，置分液漏斗中，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次15ml，收集乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液。
[0136]
3.2.2.2对照品溶液制备
[0137]
(1)取桂皮醛对照品，加乙醇制成每1ml含1μl的溶液，作为对照品溶液。
[0138]
(2)取6
‑
姜辣素加甲醇制成0.5mg/ml溶液，即得6
‑
姜辣素对照品溶液。
[0139]
3.2.3阴性对照药材溶液制备
[0140]
按照处方比例，称取缺葛根、缺麻黄、缺甘草、缺桂枝、缺赤芍及缺生姜的处方，按标准的制法煎煮，取相当于1g颗粒的煎煮液，按上述供试品制备方法，分别制备甘草、黄芩、柴胡及人参阴性对照溶液。
[0141]
3.3.薄层展开条件
[0142]
(1)照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取供试品溶液和麻黄、甘草、赤芍对照药材溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇
‑
水(30:10:0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm波长下在葛根和葛根汤样品图谱可见亮蓝色荧光斑点，请参阅图6；喷以香草醛硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，在麻黄、甘草、赤芍和葛根汤样品图谱可见相应斑点，请参见图7。
[0143]
(2)照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取6
‑
姜辣素对照品溶液、桂枝对照药材溶液和供试品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60
‑
90℃)
‑
氯仿
‑
乙酸乙酯(2:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm波长下在桂枝和葛根汤样品图谱可见亮蓝色荧光斑点，请参见图8a；喷以香草醛硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，在6
‑
姜辣素和葛根汤样品图谱可见相应斑点，请参见图8b)。
[0144]
3.4.方法学验证：
[0145]
取三批中试样品,按照处方工艺分别制备葛根阴性样品、桂枝阴性样品、麻黄阴性样品、甘草阴性样品、赤芍阴性样品和生姜阴性样品，分别按供试品溶液制备方法制备成葛根、桂枝、麻黄、甘草、赤芍和生姜阴性对照溶液，按照标准方法点样展开，结果请参阅6
‑
8，其中图6各条带示意如下：
[0146]
1 葛根阴性对照(乙酸乙酯提取)
[0147]
2 葛根药材(乙酸乙酯提取)
[0148]
3 葛根汤颗粒样品1(乙酸乙酯提取)
[0149]
4 葛根汤颗粒样品2(乙酸乙酯提取)
[0150]
5 葛根汤颗粒样品3(乙酸乙酯提取)
[0151]
6 葛根素对照品(t：25℃ rh：58％)
[0152]
分析表明：
[0153]
①
所有葛根药材和样品与阳性对照均有清晰对应的主带，且拖尾不明显。
[0154]
②
阴性对照呈现与测试样品相似的拖尾，但没有清晰对应的主带，说明阴性对照在此展开剂下，无干扰。
[0155]
图7各条带示意如下：
[0156]
1：赤芍阴性对照；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2：赤芍药材；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3：葛根汤颗粒样品1；
[0157]
4：葛根汤颗粒样品2；
ꢀꢀꢀꢀ
5：葛根汤颗粒样品3；
ꢀꢀꢀꢀ
6：芍药苷对照品；
[0158]
7：麻黄阴性对照；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8：麻黄药材；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
9：葛根汤颗粒样品1；
[0159]
10：葛根汤颗粒样品2；
ꢀꢀꢀ
11：葛根汤颗粒样品3；
ꢀꢀꢀ
12：甘草阴性对照；
[0160]
13：甘草药材；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14：葛根汤颗粒样品1；
ꢀꢀꢀ
15：葛根汤颗粒样品2；
[0161]
16：葛根汤颗粒样品1；
ꢀꢀ
17甘草苷对照品(t：25℃ rh：58％)
[0162]
分析表明：
[0163]
①
所有葛根汤颗粒样品均包含单一的赤芍、甘草、麻黄的主带，且无拖尾，说明该
样品除了含有图6中的葛根素外，还含有赤芍、甘草、麻黄成分；
[0164]
②
所有阴性对照在此展开剂下，无干扰。
[0165]
图8各条带示意：1 桂枝阴性对照(乙酸乙酯提取)；
[0166]2ꢀꢀ
桂枝药材(乙酸乙酯提取)；
[0167]3ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品1(乙酸乙酯提取)；
[0168]4ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品2(乙酸乙酯提取)；
[0169]5ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品3(乙酸乙酯提取)；
[0170]6ꢀꢀ
生姜阴性对照(乙酸乙酯提取)；
[0171]7ꢀꢀ5‑
姜辣素对照品；
[0172]8ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品1(乙酸乙酯提取)；
[0173]9ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品2(乙酸乙酯提取)；
[0174]
10 葛根汤颗粒样品3(乙酸乙酯提取)；
[0175]
(t：25℃ rh：58％)；
[0176]
分析表明：
[0177]
①
所有葛根汤颗粒样品均包含单一的桂枝、姜辣素，且在5％香草醛硫酸显色下无拖尾，说明该样品除了含有图6中的葛根素外，还含有桂枝、姜辣素成分；
[0178]
②
所有阴性对照在此展开剂下，无干扰。
[0179]1ꢀꢀ
桂枝阴性对照(乙酸乙酯提取)
[0180]2ꢀꢀ
桂枝药材(乙酸乙酯提取)
[0181]3ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品1(乙酸乙酯提取)
[0182]4ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品2(乙酸乙酯提取)
[0183]5ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品3(乙酸乙酯提取)
[0184]6ꢀꢀ
生姜阴性对照(乙酸乙酯提取)
[0185]7ꢀꢀ5‑
姜辣素对照品
[0186]8ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品1(乙酸乙酯提取)
[0187]9ꢀꢀ
葛根汤颗粒样品2(乙酸乙酯提取)
[0188]
10 葛根汤颗粒样品3(乙酸乙酯提取)
[0189]
(t：25℃ rh：58％)
[0190]
实施例4、确定葛根汤生产工艺的最适参数：
[0191]
准备饮片，其中，葛根gg
‑
yc
‑
1904
‑
01；麻黄mh
‑
yc
‑
1910
‑
01；桂枝gz
‑
yc
‑
1909
‑
06；炙甘草gc
‑
yp
‑
1909
‑
12；赤芍cs
‑
yp
‑
1911
‑
17；大枣dz
‑
yc
‑
1909
‑
07；生姜市售。
[0192]
分组实施例4.1中试煎煮时间研究
[0193]
分别取葛根6kg、麻黄4.5kg、桂枝3kg、生姜4.5kg、炙甘草3kg、赤芍3kg、大枣4.5kg，先将葛根和麻黄加水8倍，浸泡30分钟，加热煮沸，煎煮15分钟，然后加入其它饮片，加热煮沸，煎煮1.5小时，分别于0.5小时、1小时和1.5小时取样，分别检测，结果如表4：
[0194]
表4 中试提取时间考察
[0195][0196]
如表4所示，煎煮1.5小时的含固物略低于煎煮1.0小时的效果，但葛根素含量和芍药苷含量明显超过后者，因此中试煎煮时间确定为1.5小时。
[0197]
分组实施例4.2中试离心进料速率考察：
[0198]
将煎煮1.5小时的煎煮液放冷至室温，10000rpm/min离心，考察进料速度分别为100l/h、200l/h、300l/h时得到的离心液，分别检测，结果如表5：
[0199]
表5 中试离心进料速率考察
[0200][0201]
如表5所示，中试离心进料速率300l/h的葛根素含量略低于200l/h的效果，但含固物含量明显超过后者，因此中试离心进料速率确定为300l/h。
[0202]
分组实施例4.3离心液进行浓缩生产成品：
[0203]
在温度：60
‑
85℃，真空度
‑
0.04
‑
0.08mpa、喷雾干燥(进风温度170
±
5℃，出风温度80
‑
100℃，进料速度20
‑
22hz(5.4
‑
9.0kg/h)，最终确认最佳进料速度为20
‑
22hz，进风温度满足干燥情况下尽量以节省能耗为主)，取浓缩液和干燥粉进行检测，结果如表6：
[0204]
表6 中试提取液、离心液、浓缩液和喷干粉检测
[0205][0206]
如表6所示，以中试煎煮1.5h、离心进料速率300l/h、温度：60
‑
85℃，真空度
‑
0.04
‑
0.08mp、喷雾干燥(参数进风温度170
±
5℃，出风温度80
‑
100℃，进料速度20
‑
22hz)的生产
条件下，所制备的各批次产品的含固物、葛根素含量、芍药苷含量更好、且质量稳定。
[0207]
实施例五、利用指纹图谱质谱模型和薄层鉴别法，生产葛根汤
[0208]
根据实施例1
‑
4的结果，确定葛根汤的制备工艺的步骤如下，具体流程参见图9：
[0209]
(1)分别以重量比为6：4.5：3：4.5：3：3：4.5，称取葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣的饮片；
[0210]
(2)先将葛根和麻黄加水8倍，浸泡30分钟，武火加热煮沸，煎煮15分钟，祛除白沫，然后加入其它饮片，加热煮沸，煎煮1.5小时；
[0211]
(3)将微沸后的提取液通过高速离心除去杂质和大分子物质，得到澄清的提取液，然后通过减压低温浓缩，浓缩到相对密度为1.01～1.20，备用；
[0212]
(4)将浓缩液加入辅料或不加辅料，混匀，通过喷雾干燥快速干燥成粉末；
[0213]
(5)将获得的粉末，通过湿法制粒、干法制粒或沸腾制粒制备成颗粒剂；
[0214]
(6)按照实施例1
‑
2的确定的指纹质谱模型，对产品进行色谱分析，如果分析结果证明含有预期的黄岑峰和另一特征指纹峰，则判断产品初步合格，并进行下一工序的全成分检测。如果未见预期的指纹峰，则判定不合格，则停止生产，检查所有原料和生产工序；
[0215]
(7)按照实施例3
‑
4的确定的2种展开剂组合，对葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣进行薄层层析鉴别；
[0216]
根据鉴别结果，确定产品是否符合中国药典的质量标准。如果根据薄层层析结果判定质量合格，则进行总混等后续工序。如果根据薄层层析结果判定不合格，则停止生产。检查所有原料和生产工序；
[0217]
(8)将通过质量检测的产品，进行总混、并将颗粒分装成10g/袋，复合膜包装。
[0218]
本发明的质量检测方法中，涉及大量具体的检测数据点值，虽然导致保护范围较为狭窄，但是通过各种具体检测数据点值，排除了效果较差或不足的不合格产品，这非常适合于建立稳定的质量控制标准，符合中药生产的需要；同时，本发明通过使用指纹图谱质谱模型、薄层色谱和改进的含量测定等检测方法对产品质量进行全面监控，检验方法较药典方法更加严格，以保证成药的市场化。

技术特征：
1.一种基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法，其特征在于：步骤包括：(1)建立简化的定性指纹图谱质谱模型，包括：
①
称取10批葛根汤颗粒的适量样品，各加水50ml溶解并定容后，作为待测品溶液；
②
将各待测品溶液进样分析；
③
分析待测品溶液的指纹参数，选择葛根素指纹峰的出峰时间约20min，另在出峰时间约24min出现杂峰的色谱条件，建立简化的标准指纹图谱模型；(2)取供试品颗粒约0.2g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液；(3)将供试品溶液进样检测，得到色谱图；(4)比较供试品溶液和上述定性指纹图谱模型在出峰时间约20min和约24min的流出的质谱峰以及mau值是否一致，如果一致则进行下一步检测，如果不一致直接判定待测样品不合格。(5)对通过质量初筛的待测样品，取待测样品滤液，加入萃取剂进行萃取，合并萃取液；(6)将萃取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液；另用相同方法平行制备阳性对照和阴性对照溶液；(7)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液，分别置于同一硅胶g薄层板上，在薄层鉴别展开剂上展开，取出；(8)加入显色溶液，用热风加热至斑点显色清晰，并置于阳光或紫外光下检视；(9)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点，如果供试品和阳性对照在相应位置上出现相同颜色斑点，且阴性无干扰斑点，则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相近的药物成分；其中，对于葛根、麻黄、甘草、赤芍，以氯仿
‑
甲醇
‑
水(30:10:0.8)为展开剂；对于桂枝和生姜，以石油醚(60
‑
90℃)
‑
氯仿
‑
乙酸乙酯(2:1:1)为展开剂。2.根据权利要求1所述的基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法，其特征在于：步骤
②
按照以下参数进样检测：仪器：agilent1100，色谱柱：agela venusil mp c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：250nm；流动相：乙腈
‑
水；
3.根据权利要求1所述的基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法，其特征在于：步骤(4)中的判定一致的过程包括：将葛根素参照物峰相应的峰为s峰，计算各主要峰与s峰的相对保留时间和相对峰面积；其中供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不得低于0.90，且相对保留时间及相对峰面积在规定值的
±
10％之内，表明待测样品符合初级质量标准，如果未达到上述标准直接判定待测样品不合格。4.根据权利要求1
‑
3所述的基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法，其特征在于：步骤(6)中，分别将葛根、麻黄、甘草、赤芍、桂枝和生姜，加适量水，煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至20ml，置分液漏斗中，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次15ml，收集乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为阳性对照。5.根据权利要求1所述的基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法，其特征在于：其中步骤(7)中，分别吸取供试品溶液和麻黄、甘草、赤芍对照药材溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇
‑
水(30:10:0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm波长下分析亮蓝色荧光斑点；或，喷以香草醛硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，分析图谱中可见斑点。6.根据权利要求1所述的基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法，其特征在于：步骤(7)中，分别吸取6
‑
姜辣素对照品溶液、桂枝对照药材溶液和供试品溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60
‑
90℃)
‑
氯仿
‑
乙酸乙酯(2:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm波长下分析亮蓝色荧光斑点；或，喷以香草醛硫酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，分析图谱中可见斑点。7.一种葛根汤制剂的制备方法，其特征在于：包括将葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣7味药加水煎煮，滤过，合并煎液，滤液减压浓缩至清膏，加入麦芽糊精适量，干燥或粉碎，制成葛根汤颗粒，对所制备的颗粒进行质量检测，并根据质量检测结果指导产品规范化生产，其中该质量监控或检测步骤的特征包括：上述权利要求1
‑
6所述的步骤(1)
‑
(9)。8.根据权利要求7所述的葛根汤制剂的制备方法，其特征在于：所述葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣重量比为6：4.5：3：4.5：3：3：4.5，并先将葛根和麻黄加水煎煮，然
后加入桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣饮片，加热煮沸，煎煮1.5小时；将微沸后的提取液过滤后，然后通过减压低温浓缩，浓缩到相对密度为1.01～1.20；其中浓缩液加入辅料或不加辅料，混匀，通过喷雾干燥快速干燥成粉末；将获得的粉末，通过湿法制粒、干法制粒或沸腾制粒制备成颗粒剂；其中将颗粒分装成5g/袋，复合膜包装。9.根据权利要求7所述的葛根汤制剂的制备方法，其特征在于：按照步骤(1)
‑
(4)所建立的指纹质谱模型，对产品进行色谱分析：如果分析结果证明含有预期的黄岑峰和另一特征指纹峰，则判断产品初步合格，并进行下一工序的全成分检测；如果未见预期的指纹峰，则判定不合格，则停止生产，检查所有原料和生产工序。10.根据权利要求7所述的葛根汤制剂的制备方法，其特征在于：按照步骤(5)
‑
(9)的确定的2种展开剂组合，对葛根、麻黄、桂枝、生姜、炙甘草、赤芍、大枣进行薄层层析鉴别，根据鉴别结果，确定产品是否符合质量要求：如果根据薄层层析结果判定质量合格，则进行总混等后续工序；如果根据薄层层析结果判定不合格，则停止生产，检查所有原料和生产工序。
技术总结
本发明提供一种基于简化的指纹图谱建立的葛根汤的生产方法，包括预先使用供试品摸索具有最佳色谱参数的指纹色谱系统，然后用该色谱系统测试单味药的标准对照样品，一次性摸索和确定少量特定组分的指纹峰，从而建立简化的定性和定量指纹图谱模型。该简化的指纹图谱模型能初步定性筛选不合格质量的葛根汤产品，并能对合格产品进行定量分析。随后联合更全面的薄层层析鉴别法对合格质量产品进行全面分析。本发明具有简化质量检测工艺、保留精确定量分析的效果、提高检测效率的技术效果。提高检测效率的技术效果。提高检测效率的技术效果。


技术研发人员：龙飞 方铁铮 杨亮 姚振弘 罗莉妮 陈文记 丁远杰 杨凯
受保护的技术使用者：广东志道医药科技有限公司
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29