一种锦鲤疱疹病毒RPA引物组、探针和检测试剂盒及其应用的制作方法

一种锦鲤疱疹病毒rpa引物组、探针和检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒rpa引物组、探针和检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.锦鲤疱疹病毒隶属于疱疹病毒目(herpesvirales)，异疱疹病毒科(alloherpesviridae)，鲤疱疹病毒属(cyprinivirus)，是具有囊膜的双链dna病毒，病毒颗粒直径为167～200nm，基因组全长295kbp，共编码156个开放阅读框(open reading frame,orf)，是已知基因组最大的疱疹病毒。锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus，khv)，又称为鲤疱疹病毒ⅲ型(cyprinid herpesvirus 3,cyhv
‑
3)，是引起鲤鱼(cyprinus carpio)、锦鲤(cyprinus carpio koi)及其变种感染锦鲤疱疹病毒病(koi herpesvirus disease,khvd)的病原。锦鲤疱疹病毒病已广泛分布于全世界，世界动物卫生组织将锦鲤疱疹病毒列为必须申报的鱼类传染病，我国则将其列为二类疫病。在中国进出口贸易活动中，锦鲤疱疹病毒病为必检项目。
3.锦鲤疱疹病毒主要宿主为鲤和锦鲤。鲤鱼是一种广泛养殖的鱼品种，其饲养历史悠久，养殖面积占整体鱼类养殖面积的比重较大，主要是供人食用，为人们提供了大量的优质蛋白质。锦鲤是一种观赏鱼的主要品种，是一种昂贵的美丽多彩的宠物鱼。但锦鲤疱疹病毒严重影响鲤鱼以及锦鲤正常养殖，其传染性强、致死率高，鱼发病且出现症状24～48小时后就会出现死亡，对于观赏鱼养殖业和鲤鱼养殖业都具有较大的危害。
4.相关技术中，尚未有一种针对锦鲤疱疹病毒的快速灵敏精准定量的检测方法，也没有针对锦鲤疱疹病毒病的特效兽药和疫苗。因此，开发一种快速、高效、灵敏其适用于现场检测的检测试剂及检测试剂盒对于锦鲤疱疹病毒的防控具有极高的意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种锦鲤疱疹病毒rpa引物组、探针和检测试剂盒。本发明中的锦鲤疱疹病毒rpa引物组、探针和检测试剂盒准确度高、特异性强，能够实现高效、灵敏的锦鲤疱疹病毒现场快速检测，从而筛选出锦鲤疱疹病毒病感染鱼体，对于锦鲤疱疹病毒的防控以及药物筛选具有极为重要的意义。
6.本发明的第一个方面，提供实时rpa引物组，该实时rpa引物组用于检测锦鲤疱疹病毒。
7.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物组的核苷酸序列为：
8.上游引物的核苷酸序列选自：
9.1f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:4)；
10.2f：5
’‑
gtgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:5)；
11.3f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:6)；
12.4f：5
’‑
gtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:7)；
13.5f：5
’‑
tgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:8)；
14.6f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaact
‑3’
(seq id no:9)中的至少一个；
15.下游引物的核苷酸序列选自：
16.1r：5
’‑
gttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:10)；
17.2r：5
’‑
ataaaataatgtgcgacttgaatatggttg
‑3’
(seq id no:11)；
18.3r：5
’‑
caataaaataatgtgcgacttgaatatggt
‑3’
(seq id no:12)；
19.4r：5
’‑
accaataaaataatgtgcgacttgaatatg
‑3’
(seq id no:13)；
20.5r：5
’‑
gaaccaataaaataatgtgcgacttgaata
‑3’
(seq id no:14)；
21.6r：5
’‑
ccaataaaataatgtgcgacttgaatatgg
‑3’
(seq id no:15)；
22.7r：5
’‑
aaaataatgtgcgacttgaatatggttgta
‑3’
(seq id no:16)；
23.8r：5
’‑
ctcgttcttgtaacatctatcctgtgatg
‑3’
(seq id no:17)；
24.9r：5
’‑
ctcgttcttgtaacatctatcctgtgat
‑3’
(seq id no:18)；
25.10r：5
’‑
ttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:19)中的至少一个。
26.上述引物是基于锦鲤疱疹病毒保守序列tk基因(thymidine kinase gene)设计得到，扩增片段大小为200bp左右，在设计要求上，需满足：(1)包含本发明中的探针序列，从病毒保守序列单链选择25～35个碱基作为上游或下游引物；(2)控制上下游引物的碱基长度在200bp左右；(3)5’端的dntp避免鸟嘌呤；(4)控制gc含量在30％到70％之间；(5)引物与引物之间不超过三个以上连续互补配对碱基；(6)避免上游引物和下游引物形成发卡结构或其他二级结构。
27.在本发明的一些优选实施方式中，所述实时rpa引物组的核苷酸序列为：
28.上游引物1f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:4)；
29.下游引物1r：5
’‑
gttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:10)。
30.本发明的第二个方面，提供一种实时rpa探针，该实时rpa探针的核苷酸序列为：5'
‑
gacgcaaagtcgctcagagcaagtgtttcg(seq id no:2)
‑
[fam
‑
dt]
‑
thf
‑
[bhq
‑
dt]
‑
ttcggtagtttagtt(seq id no:3)
‑
[c3
‑
spacer]
‑
3'。
[0031]
其中，fam
‑
dt表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，thf表示四氢呋喃连接子，bhq
‑
dt表示携带有荧光淬灭基团bhq1的胸腺嘧啶核苷酸。
[0032]
上述探针是基于锦鲤疱疹病毒保守序列tk基因(thymidine kinase gene)设计得到，在设计要求上，需满足：(1)探针长度为46bp～52bp，将靠近的2个t碱基分别以荧光基团和猝灭基团代替，荧光基团和猝灭基团必须是替换目的基因中相应碱基t，而不是插入；(2)荧光基团和猝灭基团间隔1～4个碱基，选择一个用thf代替；(3)thf之前不能少于30个碱基，thf之后不少于15个碱基；(4)3'末端标记一个修饰基团；(5)尽量选择无发卡结构的探针序列。
[0033]
本发明中的探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基，尤其是引物的3'端与探针不能有超过10个连续的互补碱基。
[0034]
本发明的第三个方面，提供一种检测制剂，该检测制剂含有本发明第一个方面的实时rpa引物组和本发明第二个方面所述的实时rpa探针。
[0035]
本发明的第四个方面，提供本发明的第三个方面所述的检测制剂在制备锦鲤疱疹病毒检测试剂盒中的应用。
[0036]
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒中还包括阳性标准品、酶干粉混合物、再水化缓冲液和醋酸镁溶液。
[0037]
在本发明的一些优选实施方式中，所述酶干粉混合物中含有反转录酶、重组酶、单链结合蛋白和链置换dna聚合酶。
[0038]
在本发明的一些优选实施方式中，所述酶干粉混合物为冻干粉末形式，当然，可以根据实际需要，选择本领域任何可替代制剂形式。
[0039]
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
[0040]
(1)提取待测样品的dna；
[0041]
(2)使用本发明第一个方面所述的实时rpa引物组和本发明第二个方面所述的实时rpa探针进行实时rpa扩增，得到扩增产物；
[0042]
(3)根据扩增产物的荧光强度定性和定量待测样品中的锦鲤疱疹病毒；
[0043]
其中，若未检测到荧光，则不含有锦鲤疱疹病毒；
[0044]
若检测到荧光，则待测样品中含有锦鲤疱疹病毒；
[0045]
根据待测样品的荧光强度，对比标准曲线，定量锦鲤疱疹病毒含量。
[0046]
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒检测对象选自锦鲤(cyprinus carpio koi)。
[0047]
本发明的第五个方面，提供本发明的第三个方面所述的检测制剂在锦鲤疱疹病毒治疗药物或制剂的筛查中的应用。
[0048]
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述锦鲤疱疹病毒治疗药物或制剂用于抑制锦鲤疱疹病毒在锦鲤体内的复制或表达。
[0049]
本发明的有益效果是：
[0050]
1.本发明中提供的探针和引物，均通过锦鲤疱疹病毒特定的保守区域设计筛选得到，并通过对不同引物探针组合进行比较，确定得到最佳组合。该探针和引物组合灵敏度高，检测效果稳定，而且与cev(鲤浮肿病毒)、svc(鲤春病毒)在内的9种病毒以及锦鲤(鲤)易感染细菌嗜水气单胞菌，无交叉反应，表现出良好的特异性。
[0051]
2.基于本发明中的探针和引物，设计得到的检测试剂及检测试剂盒，具有很高的检测灵敏度，最低检测限为100copy/μl，即每反应检测灵敏度约为1fg/μl。其检测灵敏度比khv检测金标准pcr方法高1000倍，比khv real
‑
time pcr高10倍，检测时间仅需4～18min，大大缩短了检测时间，可用于现场快速检测。
附图说明
[0052]
图1为本发明实施例中部分引物组合的荧光信号曲线图，其中，1f1r代表上游引物1f和下游引物1r的组合，2f1r代表上游引物2f和下游引物1r的组合，3f1r代表上游引物3f和下游引物1r的组合，1f2r代表上游引物1f和下游引物2r的组合，2r2f代表上游引物2f和下游引物2r的组合，3f2r代表上游引物3f和下游引物2r的组合，1f3r代表上游引物1f和下游引物3r的组合，2f3r代表上游引物2f和下游引物3r的组合，3f3r代表上游引物3f和下游
引物3r的组合；
[0053]
图2为本发明实施例中得到的标准曲线图；
[0054]
图3为本发明实施例中的real
‑
time rpa试剂盒的灵敏度检测结果；
[0055]
图4为本发明实施例中的real
‑
time rpa试剂盒的特异性检测结果，其中，1为锦鲤疱疹病毒(khv)，2
‑
12为分别为鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv
‑
2)、蛙病毒3型(fv3)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(isknv)、传染性造血器官坏死病毒(ihnv)、罗非鱼湖病毒(tilv)、基因ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(gcrv
‑ⅰ
)、基因ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(gcrv
‑ⅱ
)、基因ⅲ型草鱼呼肠孤病毒(gcrv
‑ⅲ
)以及嗜水气单胞菌。
具体实施方式
[0056]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0057]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0058]
引物设计和筛选
[0059]
1.病毒株dna的获取：
[0060]
本实施例使用的病毒株为khv
‑
gz1301毒株(保存于中国水产科学研究院珠江水产研究所)。
[0061]
将khv
‑
gz1301毒株接种于ccb敏感细胞系，待细胞出现明显细胞病变时，根据细胞总dna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)说明书中的操作，提取病毒株dna，
‑
20℃保存备用。
[0062]
2.real
‑
time rpa探针与引物的设计：
[0063]
发明人发现，khv毒株具有高度保守性。因此，发明人选取保守序列tk基因(thymidine kinase gene)设计探针及多对real
‑
time rpa特异性引物，扩增片段大小为200bp左右。
[0064]
tk基因序列如seq id no.1所示。
[0065]5’‑
agcaggtgacggcgttggtgcccatggcggacaagctggacaagctgacggcggtgtgcatgaagtgcaagatgcgcgacgcacccttcaccgtcagaatctctcagggcacggacctggtccaggttggaggcgccgagtcttaccaggcggtgtgtcgtccctgtctcacggggttcaggatggcccagtacgagctgtacggtccgccgcctcctcctcctgcgcataatctactgggtgcgcccatcgtgtcagccgctccacctcgttcttgtaacatctatcctgtgatggtgtgtgtggaaccaataaaataatgtgcgacttgaatatggttgtacgggtttttttaacaaaaactaaactaccgaaacacgaaacacttgctctgagcgactttgcgtccaatactttaaaaaaaaggagatattaaatatagttcaaacgtttattgggatacacacatcatacacaaaatcatgtgctcaacagttcgacggggatggagcccgtgtgtccgtactttgtcaaccagtcctccagggtcggtttggcgctggcctccttgcccttggtcacggcgatggcagacgccacaatcctcgcgacgggttccgtcagagcagagttcttaaacatttcgacgcctcctccgacggtgaaccactctgaccaattcaggtcggagggccacgtctgcctgtgcatcatcgtctgcacagcgtccctcgacagccccagcccgcacagcagtcgccactcttccctgttgagcggcacgaacgccaacgcgtcgcaccccaccgtcgaggccagcatctccgagtacattagcgacgtctggtcctcctgggtaaagaggcgggtgggcacgttctcggcgaagcacctcatcagc
acggtccccacggcgtgcctaaagttttggtagggctgcttcatgtacatcttgaaaac
‑3’
(seq id no:1)。
[0066]
本实施例中的探针的设计要求为：(1)探针长度为46bp～52bp，将靠近的2个t碱基分别以荧光基团和猝灭基团代替，荧光基团和猝灭基团必须是替换目的基因中相应碱基t，而不是插入；(2)荧光基团和猝灭基团间隔1～4个碱基，选择一个用thf代替；(3)thf之前不能少于30个碱基，thf之后不少于15个碱基；(4)3'末端标记一个修饰基团；(5)尽量选择无发卡结构的探针序列。
[0067]
由于目前尚未有专门的rpa探针和引物设计软件，且rpa探针和引物的设计难度大，发明人根据探针的设计要求，通过分析保守序列中所有可以设计探针的位点，寻找最佳的探针序列，选择自由能绝对值最低且发卡结构最少的探针序列。
[0068]
获得的探针序列如下：
[0069]
5'
‑
gacgcaaagtcgctcagagcaagtgtttcg(seq id no:2)
‑
[fam
‑
dt]
‑
thf
‑
[bhq
‑
dt]
‑
ttcggtagtttagtt(seq id no:3)
‑
[c3
‑
spacer]
‑
3'。
[0070]
其中，fam
‑
dt表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，thf表示四氢呋喃连接子，bhq
‑
dt表示携带有荧光淬灭基团bhq1的胸腺嘧啶核苷酸。
[0071]
本实施例中的rpa引物组设计要求为：(1)包含上述探针序列，从病毒保守序列单链选择25～35个碱基作为上游或下游引物；(2)控制上下游引物的碱基长度在200bp左右；(3)5’端的dntp避免鸟嘌呤；(4)控制gc含量在30％到70％之间；(5)引物与引物之间不超过三个以上连续互补配对碱基；(6)避免上游引物和下游引物形成发卡结构或其他二级结构。
[0072]
本实施例中的探针序列和引物识别位点不能重叠，避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基，尤其是引物的3'端与探针不能有超过10个连续的互补碱基。
[0073]
获得的引物组核苷酸序列为：
[0074]
上游引物的核苷酸序列选自：
[0075]
1f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:4)；
[0076]
2f：5
’‑
gtgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:5)；
[0077]
3f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:6)；
[0078]
4f：5
’‑
gtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:7)；
[0079]
5f：5
’‑
tgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:8)；
[0080]
6f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaact
‑3’
(seq id no:9)；
[0081]
下游引物的核苷酸序列选自：
[0082]
1r：5
’‑
gttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:10)；
[0083]
2r：5
’‑
ataaaataatgtgcgacttgaatatggttg
‑3’
(seq id no:11)；
[0084]
3r：5
’‑
caataaaataatgtgcgacttgaatatggt
‑3’
(seq id no:12)；
[0085]
4r：5
’‑
accaataaaataatgtgcgacttgaatatg
‑3’
(seq id no:13)；
[0086]
5r：5
’‑
gaaccaataaaataatgtgcgacttgaata
‑3’
(seq id no:14)；
[0087]
6r：5
’‑
ccaataaaataatgtgcgacttgaatatgg
‑3’
(seq id no:15)；
[0088]
7r：5
’‑
aaaataatgtgcgacttgaatatggttgta
‑3’
(seq id no:16)；
[0089]
8r：5
’‑
ctcgttcttgtaacatctatcctgtgatg
‑3’
(seq id no:17)；
[0090]
9r：5
’‑
ctcgttcttgtaacatctatcctgtgat
‑3’
(seq id no:18)；
[0091]
10r：5
’‑
ttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:19)。
[0092]
3.引物筛选：
[0093]
对上述实施例获得的引物进行优化筛选。
[0094]
按照下述real
‑
time rpa扩增体系(表1)进行扩增检测，dna模板选择上述实施例提取的病毒株dna，再水化缓冲液、酶干粉混合物、醋酸镁溶液均购自杭州众测生物科技有限公司、再水化缓冲液为杭州众测生物科技有限公司的产品
‑
a buffer、醋酸镁溶液为杭州众测生物科技有限公司的产品
‑
b buffer、酶干粉混合物为杭州众测生物科技有限公司的产品
‑
干粉管。上游引物f和下游引物r均随机选自上述实施例中的引物组，并组合出所有配对方式进行检测(其中，本实施例中仅展示上游引物1f、2f和3f中的任一条和下游引物1r、2r和3r的任一条进行配对测试作为示例，其他上游引物和下游引物均采用同样的筛选方式)。
[0095]
表1 real
‑
time rpa扩增体系
[0096]
组分剂量酶干粉混合物粉剂(1管)再水化缓冲液40.9μl10μmol/l上游引物f2μl10μmol/l下游引物r2μldna模板2μl10μmol/l探针0.6μl醋酸镁溶液(280mm)2.5μl
[0097]
real
‑
time rpa扩增的条件为：37℃扩增20min。
[0098]
检测结果如图1所示。通过观察各引物组合得到的荧光信号起峰时间及曲线强弱，可以发现，最优组合为1f1r，该引物对的起峰时间最早，强度最佳。因此，最终确定和上述本实施例中的探针最合适的引物组合为1f1r。
[0099]
引物组和探针的效果验证实验
[0100]
随机选取10个经过验证的锦鲤疱疹病毒阳性组织，采用上述实施例中的试剂盒提取总dna并用1f1r引物组合进行real
‑
time rpa扩增，观测到荧光信号的时间如表2所示。
[0101]
表2 real
‑
time rpa检测临床样品起峰时间
[0102]
样品编号12345678910起峰时间(min)64118.54.51213.589.511
[0103]
起峰时间即为超过real
‑
time rpa反应设定的阈值，表明该样品为阳性。从表2中可知，本实施例中的1f1r引物组合可在4min内检测出该样品含锦鲤疱疹病毒，说明本实施例中的1f1r引物组合对锦鲤疱疹病毒具有良好的检测效果。
[0104]
构建锦鲤疱疹病毒检测的试剂盒
[0105]
基于上述实施例中的1f1r引物组合构建锦鲤疱疹病毒检测试剂盒。
[0106]
本实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒中包括：1f1r引物组、上述实施例中的探针、检测试剂。检测试剂包括购自杭州众测的酶干粉混合物、再水化缓冲液和醋酸镁溶液。
[0107]
本实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒的使用方法为：
[0108]
(1)在酶干粉混合物中加入再水化缓冲液a buffer 40.9μl。
[0109]
(2)加入real
‑
time rpa扩增的上游引物1f、下游引物1r、样品dna各2μl。
[0110]
(3)加入real
‑
time rpa扩增的探针0.6μl。
[0111]
(4)在干粉管的盖子上加入醋酸镁溶液b buffer 2.5μl，混匀并短暂离心。
[0112]
(5)将离心后的溶液体系置于恒温荧光检测仪(dhelix
‑
q5)中，37～39℃下反应20min。
[0113]
(6)记录荧光数据并分析结果。
[0114]
real
‑
time rpa反应体系如表1所示。
[0115]
锦鲤疱疹病毒检测试剂盒的检测效果
[0116]
1.构建标准质粒(阳性对照)：
[0117]
构建包含上述real
‑
time rpa扩增片段的标准质粒，用于建立标准曲线，精准定量待测样品中锦鲤疱疹病毒含量，且标准质粒可作为试剂盒的阳性对照。
[0118]
根据上述real
‑
time rpa扩增片段，设计得到的构建标准质粒的引物序列为：
[0119]
khv
‑
zlf：5'
‑
tcagaatctctcagggcacg
‑
3'(seq id no:20)；
[0120]
khv
‑
zlr：5'
‑
gtcagagtggttcaccgtcg
‑
3'(seq id no:21)
[0121]
病毒基因组提取按血液/细胞/组织dna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)中的说明书进行。
[0122]
以khv
‑
zlf和khv
‑
zlr为引物，以鲤疱疹病毒3型gz
‑
1301株为模板进行pcr扩增，pcr反应体系为：12.5μl pcr taq mix、khv
‑
zlf和khv
‑
zlr引物各1μl(10μmol/l)和2μl dna模板，ddh2o补至25μl。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min。
[0123]
扩增产物使用1.5％的琼脂糖电泳进行分析。
[0124]
凝胶电泳结果显示，扩增产物片段大小为583bp，与预期大小相符。使用pcr产物纯化试剂盒纯化pcr扩增产物。
[0125]
将9μl纯化后的pcr扩增产物、1.5μl t4连接酶、1.5μl10
×
t4连接酶缓冲液、3μlpmd
‑
19t载体在6℃过夜连接。将连接产物转化至dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液pcr，筛选具有目的条带的阳性克隆，并提取质粒进行测序验证。
[0126]
测序结果表明标准质粒成功。
[0127]
2.建立标准曲线：
[0128]
分别配制上述标准质粒终浓度为100copy/μl、101copy/μl、102copy/μl、103copy/μl、104copy/μl、105copy/μl、106copy/μl标准溶液，利用上述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒检测各浓度标准质粒起峰时间。
[0129]
终浓度为100copy/μl、101copy/μl、102copy/μl、103copy/μl、104copy/μl、105copy/μl、106copy/μl标准溶液的起峰时间分别为：14min、13min、11.5min、10min、8min、6min、4min。将标准品浓度取log值，建立标准曲线(图2)，建立的标准曲线方程式为：
[0130]
y＝
‑
0.1012x2‑
1.0893x 14.083
[0131]
r2＝0.9993。
[0132]
3.灵敏度检测：
[0133]
对上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒进行灵敏度检测，包括以下步骤：
[0134]
(1)将上述标准质粒按10倍梯度从105copy/μl进行梯度稀释，终浓度分别为100copy/μl、101copy/μl、102copy/μl、103copy/μl、104copy/μl、105copy/μl。
[0135]
(2)将步骤(1)中各浓度标准质粒使用上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒进行扩增，扩增时需混匀离心，将离心后的溶液体系加入恒温荧光检测仪中，设置温度为37℃，反应时长为30min。
[0136]
上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒对不同浓度的标准质粒的起峰时间及检出情况的检测结果如图3所示。
[0137]
从图3可以看出，上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒建立的real
‑
time rpa方法检测最低限为100copy/μl锦鲤疱疹病毒dna。
[0138]
4.特异性检测：
[0139]
对上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒进行特异性检测，包括以下步骤：
[0140]
(1)选取锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤鱼浮肿病毒(cev)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv
‑
2)、蛙病毒3型(fv3)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(isknv)、传染性造血器官坏死病毒(ihnv)、罗非鱼湖病毒(tilv)、基因ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(gcrv
‑ⅰ
)、基因ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(gcrv
‑ⅱ
)、基因ⅲ型草鱼呼肠孤病毒(gcrv
‑ⅲ
)共11种病毒以及锦鲤(鲤)易感染细菌嗜水气单胞菌，用dna提取试剂盒提取dna(rna病毒则先提取rna，利用反转录试剂盒转录为dna)；
[0141]
(2)使用上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒进行real
‑
time rpa扩增，加样试剂和用量如表1所示，加入上述不同样品的dna，混匀离心，将离心后的溶液体系加入恒温荧光检测仪中，设置温度为37℃，反应时长为30min。
[0142]
荧光数据结果如图4所示。从结果中可以看出，上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒仅对锦鲤疱疹病毒有扩增曲线，对鲤鱼浮肿病毒(cev)和鲤春病毒血症病毒(svcv)在内的其他10种病毒、以及锦鲤(鲤)易感染细菌嗜水气单胞菌，均无交叉反应，表现出良好的特异性。
[0143]
5.重复性检测：
[0144]
对上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒进行重复性检测，包括以下步骤：
[0145]
(1)将上述标准质粒按10倍梯度从105copy/μl进行梯度稀释，终浓度分别为100copy/μl、101copy/μl、102copy/μl、103copy/μl、104copy/μl、105copy/μl、106copy/μl。每个浓度梯度每次检测时重复检测3次，每3天检测1次，连续检测3次，根据起峰时间计算组内变异系数。
[0146]
结果如表3所示。
[0147]
表3锦鲤疱疹病毒real
‑
time rpa试剂盒重复性试验
[0148][0149][0150]
从表3可以看出，上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒具有良好的稳定性，可以很好的应用于锦鲤疱疹病毒的检测中。而且，从表3中还可以发现，随着样品中锦鲤疱疹病毒浓度的递增(100copy/μl～106copy/μl)，检测到荧光信号的时间越来越短(14min～4min)。
[0151]
6.与常规检测方法的对比：
[0152]
将上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒与pcr、real
‑
time pcr检测方法进行对比，使用终浓度分别为100copy/μl、101copy/μl、102copy/μl、103copy/μl、104copy/μl、105copy/μl的标准质粒最为样品进行检测。
[0153]
其中，khv检测金标准pcr方法中的pcr引物序列为：
[0154]
khv
‑
tkf：5'
‑
gggttacctgtacgag
‑
3'(seq id no:22)；
[0155]
khv
‑
tkr：5'
‑
cacccagtagattatgc
‑
3'(seq id no:23)。
[0156]
针对khv的real
‑
time pcr的引物序列为：
[0157]
khv
‑
86f：5'
‑
gacgccggagaccttgtg
‑
3'(seq id no:24)；
[0158]
khv
‑
163r：5'
‑
cgggttcttatttttgtccttgtt
‑
3'(seq id no:25)；
[0159]
探针序列：5'
‑
cttcctctgctcggcgagcacg
‑
3'(seq id no:26)。
[0160]
上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒与pcr、real
‑
time pcr检测方法均采用最适反应体系和反应条件进行检测，结果如表4所示。
[0161]
表4不同检测方法的灵敏度试验结果
[0162]
copy/μl实时荧光rpapcrreal
‑
time pcr105阳性阳性阳性104阳性阳性阳性103阳性阳性阳性102阳性阴性阳性101阳性阴性阳性100阳性阴性阴性
[0163]
从表4可以看出，针对锦鲤疱疹病毒的检测金标准——pcr方法的最低检测限为103copy/μl，real
‑
time pcr的最低检测限为101copy/μl，而上述实施例中的锦鲤疱疹病毒
检测试剂盒的最低限为100copy/μl，上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒的检测灵敏度是pcr方法的1000倍、real
‑
time pcr方法的10倍，表明上述实施例中的锦鲤疱疹病毒检测试剂盒的检测灵敏度显著优于pcr和real
‑
time pcr，检测结果更加可靠。
[0164]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.实时rpa引物组，其特征在于，所述实时rpa引物组用于检测锦鲤疱疹病毒，所述引物组的核苷酸序列为：上游引物的核苷酸序列选自：1f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:4)；2f：5
’‑
gtgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:5)；3f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:6)；4f：5
’‑
gtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:7)；5f：5
’‑
tgtgtatcccaataaacgtttgaactat
‑3’
(seq id no:8)；6f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaact
‑3’
(seq id no:9)中的至少一个；下游引物的核苷酸序列选自：1r：5
’‑
gttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:10)；2r：5
’‑
ataaaataatgtgcgacttgaatatggttg
‑3’
(seq id no:11)；3r：5
’‑
caataaaataatgtgcgacttgaatatggt
‑3’
(seq id no:12)；4r：5
’‑
accaataaaataatgtgcgacttgaatatg
‑3’
(seq id no:13)；5r：5
’‑
gaaccaataaaataatgtgcgacttgaata
‑3’
(seq id no:14)；6r：5
’‑
ccaataaaataatgtgcgacttgaatatgg
‑3’
(seq id no:15)；7r：5
’‑
aaaataatgtgcgacttgaatatggttgta
‑3’
(seq id no:16)；8r：5
’‑
ctcgttcttgtaacatctatcctgtgatg
‑3’
(seq id no:17)；9r：5
’‑
ctcgttcttgtaacatctatcctgtgat
‑3’
(seq id no:18)；10r：5
’‑
ttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:19)中的至少一个。2.根据权利要求1所述的实时rpa引物组，其特征在于，所述实时rpa引物组的核苷酸序列为：上游引物1f：5
’‑
tgtgtgtatcccaataaacgtttgaacta
‑3’
(seq id no:4)；下游引物1r：5
’‑
gttcttgtaacatctatcctgtgatggtg
‑3’
(seq id no:10)。3.一种实时rpa探针，其特征在于，所述实时rpa探针的核苷酸序列为：5'
‑
gacgcaaagtcgctcagagcaagtgtttcg(seq id no:2)
‑
[fam
‑
dt]
‑
thf
‑
[bhq
‑
dt]
‑
ttcggtagtttagtt(seq id no:3)
‑
[c3
‑
spacer]
‑
3'。4.一种检测制剂，其特征在于，所述检测制剂含有权利要求1或2所述的实时rpa引物组和权利要求3所述的实时rpa探针。5.权利要求4所述的检测制剂在制备锦鲤疱疹病毒检测试剂盒中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒中还包括阳性标准品、酶干粉混合物、再水化缓冲液和醋酸镁溶液。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：(1)提取待测样品的dna；(2)使用权利要求1或2所述的实时rpa引物组和权利要求3所述的实时rpa探针进行实时rpa扩增，得到扩增产物；(3)根据扩增产物的荧光强度定性和定量待测样品中的锦鲤疱疹病毒；其中，若未检测到荧光，则不含有锦鲤疱疹病毒；
若检测到荧光，则待测样品中含有锦鲤疱疹病毒；根据待测样品的荧光强度，对比标准曲线，定量锦鲤疱疹病毒含量。8.根据权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于，所述锦鲤疱疹病毒检测试剂盒检测对象选自锦鲤。9.权利要求4所述的检测制剂在锦鲤疱疹病毒治疗药物或制剂的筛查中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述锦鲤疱疹病毒治疗药物或制剂用于抑制锦鲤疱疹病毒在锦鲤体内的复制或表达。
技术总结
本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒RPA引物组、探针和检测试剂盒及其应用，所述RPA引物组序列如SEQ ID NO.4～19所示，所述探针序列如SEQ ID NO.2～3所示。本发明中提供的探针和引物灵敏度高，检测效果稳定，特异性强。基于此构建的检测试剂及检测试剂盒均具有很高的检测灵敏度，最低检测限为100copy/μL，检测时间仅需4～18min，相比KHV检测金标准PCR及real


技术研发人员：李莹莹 王庆 尹纪元 王英英 吴斯宇 曾伟伟 常藕琴 任燕 石存斌
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院珠江水产研究所
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29