一种索马鲁肽的制备方法与流程

1.本发明涉及多肽合成技术领域，具体地，本发明涉及一种索马鲁肽的制备方法。


背景技术：

2.由于生活水平的提高，饮食结构和生活方式的改变等诸多因素，全球糖尿病发病率逐年增高，糖尿病已成为继肿瘤和心血管疾病之后的第三大严重危害人类健康的疾病。尽管i型和ⅱ型糖尿病的发病机理不同，但是，他们都以持续的高血糖作为基本的生化特征。ⅱ型糖尿病人虽然自身能够产生胰岛素，但是由于胰岛素的抵抗使得自身对胰岛素的利用效率大打折扣，导致血糖升高。针对ⅱ型糖尿病的降糖药物包括二甲双胍类药物、磺酰脲类药物以及胰高血糖样肽
‑
1(glp
‑
1)的受体激动素类药物等，其中glp
‑
1相关药物是近年来的研究热点。
3.索马鲁肽(semaglutide)是由诺和诺德公司研发的一种新的长效glp
‑
1类似物，被用于改善ⅱ型糖尿病患者的血糖控制。通过每周皮下注射一次，可以实现患者血糖水平的大幅改善。除了在降血糖方面的有益功效，索马鲁肽在诱导减肥和减少患者重大心血管事件风险方面也有较好的临床效果。
4.索马鲁肽的氨基酸序列为：h
‑
his
‑
aib
‑
glu
‑
gly
‑
thr
‑
phe
‑
thr
‑
ser
‑
asp
‑
val
‑
ser
‑
ser
‑
tyr
‑
leu
‑
glu
‑
gly
‑
gln
‑
ala
‑
ala
‑
lys(aeea
‑
aeea
‑
γ
‑
glu
‑
otc)
‑
glu
‑
phe
‑
ile
‑
ala
‑
trp
‑
leu
‑
val
‑
arg
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
oh，分子式为c
187
h
291
n
45
o
59
，相对分子质量为4113.58，cas号为910463
‑
68
‑
2。
5.目前索马鲁肽的合成主要存在三种常规策略。
6.策略一：通过基因重组技术，表达获得索马鲁肽主链第3
‑
31或5
‑
31片段，然后再分步连接上n端1
‑
2或1
‑
4片段和lys20位侧链长效修饰基团。原研厂家诺和诺德早期即采用该策略获得目标索马鲁肽产品。在该策略下，由于存在多个活性位点，使得此工艺会产生较多的杂质，并且工艺操作过于复杂，不利于低成本的大规模化生产。
7.策略二：采用全固相多肽合成技术。固相多肽合成存在的巨大优势便是操作简便，可机械化流程化，更利于规模化生产。例如专利us8129343、us8536122、cn108059666、cn103848910、cn108203462、cn108359006、cn108676087、cn109021092、cn109311961、cn108059666、cn109180801、cn111217901、cn101133082、cn106478806、cn106928343、cn104356224所涉及的内容。由于固相合成的特有优势，原研厂家也在该领域进行了专利布局(cn101133082)。尽管固相合成优势巨大，然而仍存在一些固有问题，包括：树脂替代值的限制、物料及溶剂的浪费和大量废液的产生。所有的这些问题，在工业化生产中都归结为成本较为高昂。
8.为了有效降低成本以及发挥固相合成优势，固液相结合的方式成为可供选择的第三种策略。专利wo2016046753报道了多片段的固相合成及肽片段液相缩合来获取索马鲁肽主链的方法；专利cn106749613报道了三片段固液相结合策略来获取索马鲁肽的方法；专利cn109456401报道了液相合成六个主链片段，然后在固相上依次将6片段缩合上去获得索马
鲁肽的方法；专利cn109627317和cn106749613分别报道了三片段[(1
‑
12) (13
‑
24) (25
‑
31)]和[(1
‑
16) (17
‑
22) (23
‑
31)]固液相结合获取索马鲁肽的方法。然而，三片段或更多片段的合成方法，需要消耗过多的固相载体，过多的固相载体的使用使得成本高昂以及过多的肽片段也使得操作更为繁琐。
[0009]
因此，亟需开发一种成本更低、产率高的索马鲁肽的制备方法。


技术实现要素：

[0010]
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种索马鲁肽的制备方法，该方法将索马鲁肽分成大小相近的两个片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内。这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。
[0011]
为此，本发明一方面提供了一种索马鲁肽的制备方法。根据本发明的实施例，所述制备方法包括步骤：
[0012]
(1)固相合成获得全保护的第一肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为r
‑
his(r1)
‑
aib
‑
glu(r2)
‑
gly
‑
thr(r3)
‑
phe
‑
thr(r3)
‑
ser(r3)
‑
asp(r2)
‑
val
‑
ser(r3)
‑
ser(r3)
‑
tyr(r3)
‑
leu
‑
glu(r2)
‑
gly
‑
gln(r1)
‑
ala
‑
cooh；
[0013]
(2)固相合成获得全保护的第二肽段，所述第二肽段的氨基酸序列为nh2‑
ala
‑
lys[aeea
‑
aeea
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
otc(r2)]
‑
glu(r2)
‑
phe
‑
ile
‑
ala
‑
trp(r4)
‑
leu
‑
val
‑
arg(r5)
‑
gly
‑
arg(r5)
‑
gly
‑
r6；
[0014]
(3)将所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得全保护的索马鲁肽中间体；
[0015]
(4)利用切割试剂切割所述全保护的索马鲁肽中间体，获得切割液，以便获取索马鲁肽粗品；
[0016]
其中，r选自boc、fmoc、alloc、cbz中的任意一种；
[0017]
r1选自trt、boc、dmbz、tos中的任意一种；
[0018]
r2、r3各自独立地选自otbu、bn、pnb、mpe中的任意一种；
[0019]
r4选自boc、alloc、cbz中的任意一种；
[0020]
r5选自pbf、pmc、mts中的任意一种；
[0021]
r6选自4
‑
(hydroxymethyl)phenol、2
‑
cl
‑
trt
‑
cl中的任意一种。
[0022]
固相多肽合成具有操作简便，可机械化流程化的优势，而液相合成具有成本低，可规模化的优势。将固相合成和液相合成结合，发挥其各自的优势，在工业化生产中具有重要的意义。目前已报道的使用固液相策略的专利中，多采用三片段或更多片段的方法。虽然片段越小，每一片段的合成纯度会越高，但是过多的固相载体的使用使得成本高昂以及过多的肽片段也使得操作更为繁琐。并且，三片段或者更多片段的合成方法，由于涉及先进行两片段缩合，再与其他片段缩合，对氨基和羧基端是否需要保留保护基有要求，且会提升自连的几率，从而影响索马鲁肽的产率和纯度。
[0023]
本发明提供一种索马鲁肽的制备方法，该方法将索马鲁肽分成大小相近的两个片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内，对两个肽片段进行缩合反应，以制备索马鲁肽，这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。其中一条片段
利用特殊的羧基端保护基，既保证了产物的纯度、产率，又节省操作步骤，降低了成本。
[0024]
根据本发明的实施例，保护基r6预先构建于固相合成所述全保护的第二肽段时所用的树脂中，所述树脂为2
‑
cl
‑
trityl resin或sasrin resin。
[0025]
本发明在全保护的第二肽段用特殊的羧基端保护基r6(4
‑
(hydroxymethyl)phenol、2
‑
cl
‑
trt
‑
cl中的任意一种)，该羧基端保护基既可以直接构建于多肽树脂上，并能够在全保护切割过程中，伴随多肽片段一起在树脂上切割下来，实现了羧基端保护的直接构建。该策略省却了以往间接构建所需的两步反应(多肽片段全保护切割后，在液相中，先构建羧基端保护，再将氨基端保护脱除)，既保证了产物的纯度、产率，又节省操作步骤，降低了成本。
[0026]
根据本发明的实施例，在所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段混合之前，利用缩合试剂对所述第一肽段的c端活化，所述活化的时间为0.1
‑
2h。
[0027]
在所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段混合之前，利用缩合试剂对所述第一肽段的c端活化，进一步提升了缩合效率。
[0028]
根据本发明的实施例，所述缩合试剂选自dic、edci、hatu、hctu、pyaop、pybop中的至少之一。
[0029]
根据本发明的实施例，步骤(3)中进行缩合反应时，所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段等比例混合；
[0030]
任选地，所述缩合反应的时间为2
‑
12h。
[0031]
根据本发明的实施例，所述切割试剂为tips、edt、苯酚、茴香硫醚、水中的至少之一和tfa的混合液。
[0032]
根据本发明的实施例，所述切割试剂中tfa的浓度为85％
‑
97.5％v/v。
[0033]
所述切割试剂中tfa浓度过低会导致切割失败，浓度过高导致切割效果不好。
[0034]
根据本发明的实施例，所述切割试剂切割所述全保护的索马鲁肽中间体的时间为2
‑
3h。
[0035]
根据本发明的实施例，步骤(4)进一步包括将所述切割液进行浓缩、沉淀、过滤，以便获取所述索马鲁肽粗品。
[0036]
根据本发明的实施例，沉淀时所用的沉淀剂选自冰乙醚、冰甲基叔丁基醚中的至少之一。
[0037]
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括利用高效液相色谱法对所述索马鲁肽粗品进行纯化，以及转盐和脱盐的步骤。最终经冷冻干燥获得索马鲁肽纯品。
[0038]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0039]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0040]
图1显示了实施例4中索马鲁肽粗品的色谱结果；
[0041]
图2显示了实施例5中索马鲁肽纯品的色谱结果；
[0042]
图3显示了实施例5中索马鲁肽纯品的质谱结果。
具体实施方式
[0043]
根据本发明的具体实施例，本发明提供的索马鲁肽的制备方法，包括步骤：
[0044]
(1)固相合成获得全保护的第一肽段：
[0045]
r
‑
his(r1)
‑
aib
‑
glu(r2)
‑
gly
‑
thr(r3)
‑
phe
‑
thr(r3)
‑
ser(r3)
‑
asp(r2)
‑
val
‑
ser(r3)
‑
ser(r3)
‑
tyr(r3)
‑
leu
‑
glu(r2)
‑
gly
‑
gln(r1)
‑
ala
‑
cooh；
[0046]
(2)固相合成全保护的第二肽段：
[0047]
nh2‑
ala
‑
lys[aeea
‑
aeea
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
otc(r2)]
‑
glu(r2)
‑
phe
‑
ile
‑
ala
‑
trp(r4)
‑
leu
‑
val
‑
arg(r5)
‑
gly
‑
arg(r5)
‑
gly
‑
r6；
[0048]
(3)将全保护的第一肽段与全保护的第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得全保护的索马鲁肽中间体；
[0049]
(4)利用切割试剂切割所述全保护的索马鲁肽中间体，获得切割液，以便获取索马鲁肽粗品；
[0050]
其中，r选自boc、fmoc、alloc、cbz中的任意一种；
[0051]
r1选自trt、boc、dmbz、tos中的任意一种；
[0052]
r2、r3各自独立地选自otbu、bn、pnb、mpe中的任意一种；
[0053]
r4选自boc、alloc、cbz中的任意一种；
[0054]
r5选自pbf、pmc、mts中的任意一种；
[0055]
r6选自4
‑
(hydroxymethyl)phenol、2
‑
cl
‑
trt
‑
cl中的任意一种。
[0056]
其中，全保护的第一肽段和第二肽段的合成方法为本领域常规方法，并不限于本申请中所用的合成方法。
[0057]
根据本发明的具体实施例，固相合成全保护的第一肽段步骤如下：
[0058]
1)使用dmf/dcm溶胀树脂，树脂是2
‑
cl
‑
trityl resin或sasrin resin；
[0059]
2)将fmoc
‑
ala
‑
cooh及diea加入到上述溶胀好的树脂中，反应2
‑
12小时，投料比为树脂：fmoc
‑
ala
‑
cooh:diea＝1:1
‑
6:2
‑
12；
[0060]
3)按照固相多肽合成的方法，根据第一肽段的序列，依次将：fmoc
‑
gln(r1)
‑
cooh、fmoc
‑
gly
‑
cooh、fmoc
‑
glu(r2)
‑
cooh、fmoc
‑
leu
‑
cooh、fmoc
‑
tyr(r3)
‑
cooh、fmoc
‑
ser(r3)
‑
cooh、fmoc
‑
ser(r3)
‑
cooh、fmoc
‑
val
‑
cooh、fmoc
‑
asp(r2)
‑
cooh、fmoc
‑
ser(r3)
‑
cooh、fmoc
‑
thr(r3)
‑
cooh、fmoc
‑
phe
‑
cooh、fmoc
‑
thr(r3)
‑
cooh、fmoc
‑
gly
‑
cooh、fmoc
‑
glu(r2)
‑
cooh、fmoc
‑
aib
‑
cooh、r
‑
his(r1)
‑
cooh逐个偶连到上述树脂上，得到全保护的索马鲁肽第一肽片段。氨基酸偶连过程中使用的缩合剂包括dic/edci/hatu/hctu/pyaop/pybop；
[0061]
4)向全保护的索马鲁肽第一肽段树脂中，加入全保护切割试剂，室温切割2
‑
3小时，收集切割液，旋蒸去除液体，得到全保护的索马鲁肽第一肽段。全保护切割试剂为25％三氟乙醇/dcm或25％hfip/dcm。
[0062]
根据本发明的具体实施例，固相合成全保护的第二肽段步骤如下：
[0063]
(ⅰ)r2
‑
otc
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
aeea
‑
aeea
‑
cooh的合成：在树脂上依次偶连，fmoc
‑
aeea
‑
cooh、fmoc
‑
aeea
‑
cooh、fmoc
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
cooh和r2
‑
otc
‑
cooh，操作同上述1)
‑
4)步骤；
[0064]
(ⅱ)使用dmf/dcm溶胀树脂，树脂为2
‑
cl
‑
trityl resin或sasrin resin；
[0065]
(ⅲ)将r6及diea加入到上述溶胀好的树脂中，反应2
‑
12小时，投料比为树脂：r6:diea＝1:(1
‑
6):(2
‑
12)；
[0066]
(ⅳ)反应结束后，将fmoc
‑
gly
‑
cooh及缩合试剂加入到上述r6树脂中，反应2
‑
12小时，投料比为树脂：fmoc
‑
gly
‑
cooh:缩合试剂＝1:(2
‑
6):(2
‑
6)。所述缩合试剂选自dic/edci/hatu/hctu/pyaop/pybop中任一种；
[0067]
(
ⅴ
)按照固相多肽合成的方法，根据第二肽段的序列，依次将：fmoc
‑
arg(r5)
‑
cooh、fmoc
‑
gly
‑
cooh、fmoc
‑
arg(r5)
‑
cooh、fmoc
‑
val
‑
cooh、fmoc
‑
leu
‑
cooh、fmoc
‑
trp(r4)
‑
cooh、fmoc
‑
ala
‑
cooh、fmoc
‑
ile
‑
cooh、fmoc
‑
phe
‑
cooh、fmoc
‑
glu(r2)
‑
cooh、fmoc
‑
lys(r7)
‑
cooh、fmoc
‑
ala
‑
cooh逐个偶连到上述树脂上。氨基酸偶连过程中使用的缩合剂包括dic/edci/hatu/hctu/pyaop/pybop。其中r7选自alloc、ivdde、dde、mtt、mmt中任一种；
[0068]
(
ⅵ
)脱除掉r7保护基，将r2
‑
otc
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
aeea
‑
aeea
‑
cooh缩合到lys侧链上，投料比为树脂：r2
‑
otc
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
aeea
‑
aeea
‑
cooh:缩合试剂＝1:(2
‑
6):(2
‑
6)。所述缩合试剂选自dic/edci/hatu/hctu/pyaop/pybop中任一种；
[0069]
(
ⅶ
)向全保护的索马鲁肽第二肽片段树脂中，加入全保护切割试剂，室温切割2
‑
3小时，收集切割液，旋蒸去除液体，得到全保护的索马鲁肽第一肽段。全保护切割试剂为25％三氟乙醇/dcm或25％hfip/dcm。
[0070]
根据本发明的具体实施例，索马鲁肽的合成过程如下：
[0071]
ⅰ
)将固相合成的第一肽段溶于dcm中，加入缩合试剂进行c端活化，活化时间为0.1
‑
2小时；
[0072]
ⅱ
)待活化完成后，将第二肽段加入到上述溶液中，反应时间2
‑
12小时；
[0073]
ⅲ
)待反应完全后，旋干反应液后，加入切割试剂，进行全保护肽的切割。室温切割2
‑
3小时。反应结束后，浓缩切割液，加入沉淀剂，过滤得到索马鲁肽粗品。切割试剂为tfa/h2o/tips/edt/苯酚/茴香硫醚的混合液。沉淀剂为冰乙醚或冰甲基叔丁基醚。
[0074]
根据本发明的实施例，本发明提供的索马鲁肽的制备方法进一步包括利用高效液相色谱法对索马鲁肽粗品进行纯化，以及转盐和脱盐的步骤。最终经冷冻干燥获得索马鲁肽纯品。
[0075]
高效液相色谱法的条件可根据实验需要进行设定，只需要将索马鲁肽与其他杂质之间分离开即可。转盐和脱盐的方法根据本领域常规的转盐、脱盐方法进行。
[0076]
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0077]
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0078]
实施例1索马鲁肽第一肽段的制备
[0079]
采用以下方法合成第一肽段：boc
‑
his(trt)
‑
aib
‑
glu(otbu)
‑
gly
‑
thr(tbu)
‑
phe
‑
thr(tbu)
‑
ser(tbu)
‑
asp(otbu)
‑
val
‑
ser(tbu)
‑
ser(tbu)
‑
tyr(tbu)
‑
leu
‑
glu(otbu)
‑
gly
‑
gln(trt)
‑
ala
‑
cooh。
[0080]
1)称取2
‑
cl
‑
trityl resin(1.2mmol/g,16.6g,20mmol)置于反应管中，加入200ml dmf/dcm，溶胀树脂1小时。称取fmoc
‑
ala
‑
oh(12.4g,40mmol)溶于200ml dmf中并加入diea(13.2ml,80mmol)，混匀后加入上述溶胀好的树脂中，室温反应12小时。反应结束后，加入10ml甲醇。继续反应30min后，抽干树脂，使用dmf和dcm洗涤树脂，最后使用甲醇收缩树脂，
获得干燥的fmoc
‑
ala
‑2‑
cl
‑
trityl resin，测得树脂替代值为0.50mmol/g；
[0081]
2)称取fmoc
‑
ala
‑2‑
cl
‑
trityl resin(0.50mmol/g,20g,10mmol)置于反应管中，加入200ml dmf/dcm，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入200ml 20％哌啶/dmf进行fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用dmf和dcm洗涤脱除反应后的树脂。称量fmoc
‑
gln(trt)
‑
oh(24.4g,40mmol)，dic(7.7ml,50mmol)和oxyma(7.1g,50mmol)溶于200ml dmf中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。根据索马鲁肽第一肽段的氨基酸序列，依次偶连fmoc
‑
gly
‑
cooh、fmoc
‑
glu(otbu)
‑
cooh、fmoc
‑
leu
‑
cooh、fmoc
‑
tyr(tbu)
‑
cooh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
cooh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
cooh、fmoc
‑
val
‑
cooh、fmoc
‑
asp(otbu)
‑
cooh、fmoc
‑
ser(tbu)
‑
cooh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
cooh、fmoc
‑
phe
‑
cooh、fmoc
‑
thr(tbu)
‑
cooh、fmoc
‑
gly
‑
cooh、fmoc
‑
glu(otbu)
‑
cooh、fmoc
‑
aib
‑
cooh、boc
‑
his(trt)
‑
cooh。每一次偶连过程均包括fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护索马鲁肽第一肽段树脂；
[0082]
3)称取20g全保护索马鲁肽第一肽段树脂置于反应管中，向其加入200ml 25％三氟乙醇/dcm溶液，室温反应2小时。抽滤，收集全保护切割液。旋蒸去除切割液后，乙醚沉淀，沉淀干燥后获得全保护索马鲁肽第一肽段。
[0083]
实施例2支链r2
‑
otc
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
aeea
‑
aeea
‑
cooh的合成
[0084]
1)称取2
‑
cl
‑
trityl resin(1.2mmol/g,8.3g,10mmol)置于反应管中，加入100ml dmf/dcm，溶胀树脂1小时。称取fmoc
‑
aeea
‑
oh(7.7g,20mmol)溶于100ml dmf中并加入diea(6.6ml,40mmol)，混匀后加入上述溶胀好的树脂中，室温反应12小时。反应结束后，加入5ml甲醇。继续反应30min后，抽干树脂，使用dmf和dcm洗涤树脂，最后使用甲醇收缩树脂，获得干燥的fmoc
‑
aeea
‑2‑
cl
‑
trityl resin，测得树脂替代值为0.58mmol/g；
[0085]
2)称取fmoc
‑
aeea
‑2‑
cl
‑
trityl resin(0.58mmol/g,8.6g,5mmol)置于反应管中，加入200ml dmf/dcm，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入100ml 20％哌啶/dmf进行fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用dmf和dcm洗涤脱除反应后的树脂。称量fmoc
‑
aeea
‑
oh(7.7g,20mmol)，dic(3.85ml,25mmol)和oxyma(3.55g,25mmol)溶于100ml dmf中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。依次偶连fmoc
‑
γ
‑
glu(otbu)
‑
cooh和tbu
‑
otc
‑
cooh。每一次偶连过程均包括fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护r2
‑
otc
‑
γ
‑
glu(otbu)
‑
aeea
‑
aeea肽树脂；
[0086]
3)称取10g全保护r2
‑
otc
‑
γ
‑
glu(otbu)
‑
aeea
‑
aeea肽树脂置于反应管中，向其加入100ml 25％三氟乙醇/dcm溶液，室温反应2小时。抽滤，收集全保护切割液。旋蒸去除切割液后，乙醚沉淀，沉淀干燥后获得全保护tbu
‑
otc
‑
γ
‑
glu(otbu)
‑
aeea
‑
aeea
‑
cooh。
[0087]
实施例3索马鲁肽第二肽段的制备
[0088]
采用以下方法合成第一肽段：nh2‑
ala
‑
lys[aeea
‑
aeea
‑
γ
‑
glu(otbu)
‑
otc(tbu)]
‑
glu(otbu)
‑
phe
‑
ile
‑
ala
‑
trp(boc)
‑
leu
‑
val
‑
arg(pbf)
‑
gly
‑
arg(pbf)
‑
gly
‑
hydroxymethyl
‑
phenol。
[0089]
1)称取2
‑
cl
‑
trityl resin(1.2mmol/g,16.6g,20mmol)置于反应管中，加入200ml dmf/dcm，溶胀树脂1小时。称取4
‑
(hydroxymethyl)phenol(4.5ml,40mmol)溶于200ml dmf中并加入diea(13.2ml,80mmol)，混匀后加入上述溶胀好的树脂中，室温反应12小时。反应
结束后，抽干树脂，使用dmf洗涤树脂三次。称取fmoc
‑
gly
‑
oh(11.8g,40mmol)，dic(7.7ml,50mmol)，dmap(0.25g,2mmol)和oxyma(7.1g,50mmol)溶于200ml dmf中，混匀后加入上述抽干的树脂中，室温反应2小时。反应结束后，加入10ml乙酸酐混合溶液(乙酸酐：diea:dmf＝1:1:8)。继续反应15min后，抽干树脂，使用dmf和dcm洗涤树脂，最后使用甲醇收缩树脂，获得干燥的fmoc
‑
gly
‑
hydroxymethyl
‑
phenol
‑2‑
cl
‑
trityl resin，测得树脂替代值为0.45mmol/g；
[0090]
2)称取fmoc
‑
gly
‑
hydroxymethyl
‑
phenol
‑2‑
cl
‑
trityl resin(0.45mmol/g,22.2g,10mmol)置于反应管中，加入200ml dmf/dcm，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入200ml 20％哌啶/dmf进行fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用dmf和dcm洗涤脱除反应后的树脂。称量fmoc
‑
arg(pbf)
‑
oh(25.9g,40mmol)，dic(7.7ml,50mmol)和oxyma(7.1g,50mmol)溶于200ml dmf中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。根据索马鲁肽第二肽段的氨基酸序列，依次偶连fmoc
‑
gly
‑
cooh、fmoc
‑
arg(pbf)
‑
cooh、fmoc
‑
val
‑
cooh、fmoc
‑
leu
‑
cooh、fmoc
‑
trp(boc)
‑
cooh、fmoc
‑
ala
‑
cooh、fmoc
‑
ile
‑
cooh、fmoc
‑
phe
‑
cooh、fmoc
‑
glu(otbu)
‑
cooh、fmoc
‑
lys(alloc)
‑
cooh、fmoc
‑
ala
‑
cooh。除最后fmoc
‑
ala
‑
cooh氨基酸外，每一次偶连过程均包括fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合；
[0091]
3)待fmoc
‑
ala
‑
cooh氨基酸缩合完毕后，抽干树脂，使用dmf洗涤树脂四次后使用dcm洗涤树脂2次。称量四三苯基膦钯(2.3g,2mmol)和苯硅烷(12.4ml,100mmol)加入到上述dcm洗后的树脂中，补加dcm至没过树脂，进行2次脱alloc保护基，每次反应时间为2小时。待反应结束后，使用dmf和dcm进行树脂的洗涤。称量实施例2中制备的tbu
‑
otc
‑
γ
‑
glu(otbu)
‑
aeea
‑
aeea
‑
cooh(33.8g,40mmol)，dic(7.7ml,50mmol)和oxyma(7.1g,50mmol)溶于200ml dmf中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应12小时，进行氨基酸的缩合。待反应结束后，利用dmf和dcm洗涤脱除反应后的树脂，然后使用200ml 20％哌啶/dmf进行fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用dmf和dcm洗涤脱除反应后的树脂。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护索马鲁肽第二肽段树脂；
[0092]
4)称取20g全保护索马鲁肽第二肽段树脂置于反应管中，向其加入200ml 25％三氟乙醇/dcm溶液，室温反应2小时。抽滤，收集全保护切割液。旋蒸去除切割液后，乙醚沉淀，沉淀干燥后获得全保护索马鲁肽第二肽段。
[0093]
实施例4索马鲁肽粗品的制备
[0094]
1)称取实施例1中方法制备的第一肽段(3g，1mmol)溶于dcm中，加入dic(0.2ml，1.2mmol)和oxyma(0.17g,1.2mmol)进行c端活化30min；
[0095]
2)待活化完成后，将第二肽段(3g,1mmol)的dcm溶液逐滴加入到上述活化后溶液中，室温反应12小时；
[0096]
3)待反应完全后，将反应液旋干，加入60ml切割试剂(tfa/h2o/tips/edt＝90:5:2.5:2.5)，进行全保护肽的切割。室温切割2
‑
3小时。反应结束后，浓缩切割液，加入冰乙醚，沉淀切割液，过滤即得到索马鲁肽粗品。图1展示了本实施例获得的索马鲁肽粗品的色谱图结果，通过图中所示可以得出，通过本方法所获得的索马鲁肽粗品具有较高的色谱纯度和色谱产率。
[0097]
实施例5索马鲁肽粗肽的纯化
[0098]
称取1g实施例4获得的索马鲁肽粗品，用乙腈水溶液溶解，使用高效液相色谱对索马鲁肽粗肽进行两步纯化：第一步纯化采用0.1％tfa
‑
水/乙腈体系作为流动相；第二步纯化采用0.1％乙酸水/乙腈体系作为流动相。色谱柱使用尺寸为50x250mm，10μm c18填料的制备柱。收集目的峰纯度在99％以上的馏分，冷冻干燥获得索马鲁肽纯品。图2和图3分别展示了索马鲁肽纯化后的色谱图和质谱图。图2可以看出，通过本发明的制备方法，最终获得的纯品索马鲁肽具有99.5％以上的纯度，图3中的质谱结果也表明了合成索马鲁肽的正确性。
[0099]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0100]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：
1.一种索马鲁肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：(1)固相合成获得全保护的第一肽段，所述第一肽段的氨基酸序列为r
‑
his(r1)
‑
aib
‑
glu(r2)
‑
gly
‑
thr(r3)
‑
phe
‑
thr(r3)
‑
ser(r3)
‑
asp(r2)
‑
val
‑
ser(r3)
‑
ser(r3)
‑
tyr(r3)
‑
leu
‑
glu(r2)
‑
gly
‑
gln(r1)
‑
ala
‑
cooh；(2)固相合成获得全保护的第二肽段，所述第二肽段的氨基酸序列为nh2‑
ala
‑
lys[aeea
‑
aeea
‑
γ
‑
glu(r2)
‑
otc(r2)]
‑
glu(r2)
‑
phe
‑
ile
‑
ala
‑
trp(r4)
‑
leu
‑
val
‑
arg(r5)
‑
gly
‑
arg(r5)
‑
gly
‑
r6；(3)将所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得全保护的索马鲁肽中间体；(4)利用切割试剂切割所述全保护的索马鲁肽中间体，获得切割液，以便获取索马鲁肽粗品；其中，r选自boc、fmoc、alloc、cbz中的任意一种；r1选自trt、boc、dmbz、tos中的任意一种；r2、r3各自独立地选自otbu、bn、pnb、mpe中的任意一种；r4选自boc、alloc、cbz中的任意一种；r5选自pbf、pmc、mts中的任意一种；r6选自4
‑
(hydroxymethyl)phenol、2
‑
cl
‑
trt
‑
cl中的任意一种。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，保护基r6预先构建于固相合成所述全保护的第二肽段时所用的树脂中，所述树脂为2
‑
cl
‑
trityl resin或sasrin resin。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段混合之前，利用缩合试剂对所述第一肽段的c端活化，所述活化的时间为0.1
‑
2h。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缩合试剂选自dic、edci、hatu、hctu、pyaop、pybop中的至少之一。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中进行缩合反应时，所述全保护的第一肽段与所述全保护的第二肽段等比例混合；任选地，所述缩合反应的时间为2
‑
12h。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述切割试剂为tips、edt、苯酚、茴香硫醚、水中的至少之一和tfa的混合液。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述切割试剂中tfa的浓度为85％
‑
97.5％v/v；任选地，所述切割试剂切割所述全保护的索马鲁肽中间体的时间为2
‑
3h。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)进一步包括将所述切割液进行浓缩、沉淀、过滤，以便获取所述索马鲁肽粗品；任选地，沉淀时所用的沉淀剂选自冰乙醚、冰甲基叔丁基醚中的至少之一。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法进一步包括利用高效液相色谱法对所述索马鲁肽粗品进行纯化，以及转盐和脱盐的步骤。
技术总结
本发明涉及多肽合成技术领域，具体地，本发明涉及一种索马鲁肽的制备方法。本发明提供一种索马鲁肽的制备方法，该方法将索马鲁肽分成大小相近的两个片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内，对两个肽片段进行缩合反应，以制备索马鲁肽，这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。其中一条片段利用特殊的羧基端保护基，既保证了产物的纯度、产率，又节省操作步骤，降低了成本。降低了成本。


技术研发人员：陈晨晨 吴壮生 周莉
受保护的技术使用者：合肥科生景肽生物科技有限公司
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29