一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖纳米粒及制备方法与流程

1.本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/(rsfv
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etgam59)纳米粒的制备方法，该疫苗可用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，并且同时公开了纳米粒的制备方法以及抗柔嫩艾美耳球虫效果，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.柔嫩艾美耳球虫（eimeria tenella）相比较于其他几种鸡球虫，是致病性最强的虫种。鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，可以导致体重下降，被毛凌乱等，严重时可以导致大批鸡只死亡。药物预防是目前生产实践环节控制球虫病最有效的措施，但是长期使用药物带来了球虫耐药性的出现，耐药性的出现迫使公司投入大量成本研发新药，长期以往陷入恶性循环当中。用疫苗免疫球虫病将成为球虫病防治的发展趋势，早期的球虫苗主要是活苗，分强毒苗和弱毒苗两种。它们在一定程度上解决了药物治疗的弊端，但不可否认，活苗也存在诸多缺陷，例如成本高、免疫途径受限、强毒苗致病、弱毒苗毒力返祖等缺点。研究人员期望能研制一种安全、简便、高效且成本低廉的疫苗来取代活苗。亚单位疫苗的出现给了鸡球虫病的预防提供了一种手段。亚单位疫苗是利用单抗和dna重组技术生产出可产生保护作用的球虫蛋白质抗原，并制成疫苗进行免疫控制。但是亚单位疫苗的不足之处是免疫原性较低。
3.核酸疫苗不仅安全，高效，廉价和使用方便，而且还可以以其独特的诱发机体产生高水平的细胞免疫的能力，是控制鸡球虫病的一种重要手段。近年来，在dna疫苗的基础上，更加发展出病毒颗粒疫苗。病毒颗粒这种疫苗形式，除了具备dna疫苗的安全，高效，廉价和使用方便的优点外，还可以使其包装的dna免受核酸酶的降解，增强抗原进入细胞的效率，充分发挥病毒样颗粒本身的免疫学特性。随着学者对免疫机制的不断研究,各种新型佐剂层出不穷,纳米佐剂的使用提高了生物利用度，使制剂的均匀性、分散性和吸收性也大大提高，是目前研究的热点。壳聚糖因为材料易得，来源丰富、在体内可生物降解、无毒副作用而研究最为深入，并且可以实现抗原的可控制释放，产生相当于常规疫苗多次接种激发的免疫效果，从而延长疫苗免疫期，减少免疫次数。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒疫苗的制备方法，用于预防鸡柔嫩艾美耳球虫病。
5.本发明所述的一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒制备，技术解决方案如下：制备壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒，首先包装出重组病毒颗粒rsfv
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etgam59。第一步首先构建出能正确传递和表达该基因的重组质粒psmart2b
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etgam59，然后将重组质粒psmart2b
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etgam59与辅助质粒pshcar共转染293t细胞，收取病毒原液并激活，在bhk
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21细胞成功验证表达后，将激活的病毒颗粒用离子交联法制备壳聚糖纳米粒，包裹重组病毒颗
粒。
6.本发明所述的一种壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）重组质粒psmart2b
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etgam59的构建设计引物pcr扩增柔嫩艾美耳球虫etgam59基因，序列如下：f：cgcggatccgatgactcgtctcgccgcctg；r：cccatcgatttactcaaatccaaaagaaggaatgccca；对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1*104个孢子化卵囊，感染后约132h杀取盲肠，用pbs清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的sac溶液冲洗肠道，浸入sac溶液中于37℃恒温摇床100rpm消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液。将收集的滤液3500rpm/min,离心5min.用pbs冲洗两次；配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入灭菌 pbs 液涡旋震荡，使其充分混匀；在含配子体的 pbs 液中加入30% percoll，同时制备 pbs液与 percoll 为 1∶1的分离液；在 10 ml灭菌离心管中，分别加入2ml分离液，5 m l含配子体和30% percoll 的pbs液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用pbs液重悬、3200r/min、5min离心 ，用pbs洗涤4次，收集沉淀液氮保存；提取配子体时期rna并反转录为cdna， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cdna为模板，pcr扩增etgam59，纯化后连接pmd18
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t载体并保菌；测序正确后用无缝克隆的方法连接至psmart2b的bamh1跟cla1两个酶切位点，构建重组质粒psmart2b
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etgam59；提取无内毒素质粒psmart2b
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etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，opti
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mem 500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%
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80%的293t细胞中，6h后换液，继续培养24
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48h；裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行western blot表达鉴定；2）重组鸡球虫甲病毒颗粒制备提取无内毒素质粒psmart2b
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etgam59跟辅助质粒pshcar，二者按照1:1的量各1.5μg与lip2000 7μl共转染至293t细胞，6h后换液继续培养24
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48h，之后收集病毒原液，可用于后续的透射电镜拍摄以及western blot鉴定；将收集的病毒原液激活：加入1/20体积α
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糜蛋白酶10g/l以活化病毒，将p62糖蛋白裂解成e2和e3蛋白，室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶10g/l，室温孵育5min；紧接着将激活后的病毒感染bhk
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21细胞2h，然后换液继续培养24
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48h；3）壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒的制备制备1%的壳聚糖醋酸溶液（cs，0.5mg/ml），ph值调节至4.8；三聚磷酸钠溶液（tpp，0.75mg/ml）；将cs溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min；然后滴加tpp溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，纳米粒的生成，然后继续搅拌20min。
7.本发明积极效果在于：提供了一种携带鸡球虫抗原基因etgam59的壳聚糖纳米粒。选用的重组病毒颗粒rsfv
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etgam59，并予以壳聚糖包裹，制备成的壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒，具有预防鸡柔嫩艾美耳球虫病，减轻盲肠病变，降低卵囊排出量，减少免疫次数，安全性高的优势。
附图说明
8.图1 为etgam59基因电泳图；图2为重组质粒psmart2b
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etgam59基因电泳图；图3为 western blot鉴定重组质粒在293t表达情况；图4为重组鸡球虫甲病毒颗粒图；图5 为western blot鉴定甲病毒颗粒表达图；图6为壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒制备及电镜图；图7为鸡脾脏淋巴细胞增殖；图8 为壳聚糖缓释对于抗体水平的影响。
具体实施方式
9.通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
10.实施例1重组质粒psmart2b
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etgam59的构建，鉴定及表达：首先 oligo7软件设计引物pcr扩增柔嫩艾美耳球虫etgam59基因，序列如下：f：cgcggatccgatgactcgtctcgccgcctg（bamh1)；r：cccatcgatttactcaaatccaaaagaaggaatgccca (cla1）；然后对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1*104个孢子化卵囊，感染后约132h杀取盲肠，用pbs清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的sac溶液冲洗肠道，浸入sac溶液中（含0.5mg/ml透明质酸酶），于37℃恒温摇床（100rpm）消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液。将收集的滤液3500rpm/min,离心5min.用pbs冲洗两次。
11.配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入适当体积的灭菌 pbs 液，涡旋震荡，使其充分混匀。随后，在含配子体的 pbs 液中加入30% percoll，同时制备 pbs液与 percoll 为 1∶1的分离液。在 10 ml灭菌离心管中，分别加入2ml分离液( pbs 液与 percoll 为 1∶1) ，5 m l 含配子体和 30% percoll 的pbs液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用pbs液重悬、离心(3200r/min、5min) ，用pbs洗涤4次，收集沉淀液氮保存。
12.提取配子体时期rna并反转录为cdna， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cdna为模板，pcr扩增etgam59，纯化后连接pmd18
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t载体并保菌。送去生物公司测序正确后用无缝克隆的方法连接至psmart2b的bamh1跟cla1两个酶切位点，构建重组质粒psmart2b
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etgam59（参见图1
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2）。
13.提取无内毒素质粒psmart2b
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etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，opti
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mem 500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%
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80%的293t细胞中，6h后换液，继续培养24
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48h。裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行western blot表达鉴定（参见图3）。
14.实施例2重组鸡球虫甲病毒颗粒制备及表达鉴定
提取无内毒素质粒psmart2b
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etgam59跟辅助质粒pshcar，二者按照1:1的量（各1.5μg）与lip2000 7μl共转染至293t细胞，6h后换液继续培养24
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48h，之后收集病毒原液，可用于后续的透射电镜拍摄以及western blot鉴定（参见图4）。
15.收集的病毒原液需要激活才具有感染力。激活步骤：首先需要加入1/20体积α
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糜蛋白酶（10g/l）以活化病毒（将p62糖蛋白裂解成e2和e3蛋白），室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶（10g/l），室温孵育5min。紧接着将激活后的病毒感染bhk
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21细胞2h，然后换液继续培养24
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48h，用western blot法鉴定表达情况（参见图5）。
16.实施例3壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒的制备制备1%的壳聚糖醋酸溶液（cs，0.5mg/ml），ph值调节至4.8。三聚磷酸钠溶液（tpp，0.75mg/ml）。首先将cs溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min。然后以一定的速率滴加tpp溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，这时候就有纳米粒的生成，然后继续搅拌20min。将制备的纳米粒拿去做透射电镜观察以及后续的免疫试验（参见图6）。
17.试验例1壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒抗柔嫩艾美耳球虫保护效果将240只6日龄健康雏鸡随机分成6组，每组40只。免疫组按照7日龄首免，14日龄二免的免疫程序分别按照每只鸡160μl的壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒（对重组病毒颗粒包封率为64.7%
±
2.8）和100μl的重组甲病毒颗粒rsfv
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etgam59进行肌肉注射：壳聚糖纳米粒组肌肉注射100μl。同时设立阴性对照组（白对照）和阳性对照组（红对照）：白对照组作不免疫不攻虫处理，红对照组作不免疫攻虫处理。在免疫之前到宰杀之前每组随机采血5只，并进行脾脏淋巴细胞的分离，测定抗体水平变化以及脾脏淋巴细胞增殖情况。二免7天后口服接种孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊1
×
104个/只进行攻虫试验，并对存活率，相对增重率，盲肠病变计分，opg，aci等进行统计，最终以aci（综合抗球虫指数）来评价壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒对鸡的免疫保护效果。并且每组留10只鸡分别在35日龄以及42日龄继续采血。检测每组7日龄，14日龄，21日龄，28日龄，35日龄，42日龄的抗体水平的变化。各组实验鸡的aci测评见表1：表1.壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒抗e.tenella的抗球虫指数组别存活率（%）相对增重率（%）病变值opgacics/rsfv
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etgam591008671178rsfv
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etgam591008291172cs（壳聚糖纳米粒）100422210110阳性对照100362510101阴性对照10010000200药物组1009420192结论：从表1中可以看出：综合免疫成本跟时间因素，我们选择两次免疫程序。在剖检时我们统计各免疫组指标，除药物组外，cs/rsfv
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etgam59组的相对增重率最高，病变值跟opg扣分最低，综合分析得出cs/rsfv
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etgam59纳米粒组的aci最高为178，明显高于阳性对照组，显示出了良好的保护效果。
18.用壳聚糖包裹病毒颗粒制备成的纳米粒免疫组，因为壳聚糖纳米粒的缓释效果，所以在28日龄左右之前的抗体水平不如病毒颗粒免疫组。但在28日龄之后壳聚糖/rsfv
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etgam59免疫组的抗体水平依然呈现上升趋势，病毒颗粒免疫组的抗体水平基本不变甚至略有下降趋势（参见图7）。

技术特征：
1.一种壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒疫苗的制备方法，其特征在于；包装出重组病毒颗粒rsfv
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etgam59；构建出能正确传递和表达该基因的重组质粒psmart2b
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etgam59，然后将重组质粒psmart2b
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etgam59与辅助质粒pshcar共转染293t细胞，收取病毒原液并激活，在bhk
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21细胞成功验证表达后，将激活的病毒颗粒用离子交联法制备壳聚糖纳米粒，包裹重组病毒颗粒。2. 如权利要求1所述的一种壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）重组质粒psmart2b
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etgam59的构建设计引物pcr扩增柔嫩艾美耳球虫etgam59基因，序列如下：f：cgcggatccgatgactcgtctcgccgcctg；r：cccatcgatttactcaaatccaaaagaaggaatgccca；对鸡柔嫩艾美耳球虫配子体的提取：21日龄雏鸡经口感染1*104个孢子化卵囊，感染后约132h杀取盲肠，用pbs清洗盲肠浆膜面后剖开肠腹用4℃预冷的sac溶液冲洗肠道，浸入sac溶液中于37℃恒温摇床100rpm消化1.5h，刮取肠粘膜并用60目铜筛，260目网筛，17μm孔径的滤膜过滤，分别收集滤液；将收集的滤液3500rpm/min,离心5min.用pbs冲洗两次；配子体的纯化：用红细胞裂解液重悬沉淀，并加入灭菌 pbs 液涡旋震荡，使其充分混匀；在含配子体的 pbs 液中加入30% percoll，同时制备 pbs液与 percoll 为 1∶1的分离液；在 10 ml灭菌离心管中，分别加入2ml分离液，5 m l含配子体和30% percoll 的pbs液，3200 r /min 离心15 min，取最下层沉淀物于另一灭菌离心管，用pbs液重悬、3200r/min、5min离心 ，用pbs洗涤4次，收集沉淀液氮保存；提取配子体时期rna并反转录为cdna， 以鸡柔嫩艾美耳球虫配子体时期cdna为模板，pcr扩增etgam59，纯化后连接pmd18
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t载体并保菌；测序正确后用无缝克隆的方法连接至psmart2b的bamh1跟cla1两个酶切位点，构建重组质粒psmart2b
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etgam59；提取无内毒素质粒psmart2b
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etgam59，按照重组质粒2μg，lip2000 7μl，opti
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mem 500μl的量制备转染复合物，转入细胞培养汇合度60%
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80%的293t细胞中，6h后换液，继续培养24
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48h；裂解细胞并获取细胞蛋白，一抗为鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清，二抗为兔抗鸡，进行western blot表达鉴定；2）重组鸡球虫甲病毒颗粒制备提取无内毒素质粒psmart2b
‑
etgam59跟辅助质粒pshcar，二者按照1:1的量各1.5μg与lip2000 7μl共转染至293t细胞，6h后换液继续培养24
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48h，之后收集病毒原液，可用于后续的透射电镜拍摄以及western blot鉴定；将收集的病毒原液激活：加入1/20体积α
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糜蛋白酶10g/l以活化病毒，将p62糖蛋白裂解成e2和e3蛋白，室温孵育30min，然后加入1/15体积的aprotinin抑肽酶10g/l，室温孵育5min；紧接着将激活后的病毒感染bhk
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21细胞2h，然后换液继续培养24
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48h；3）壳聚糖/rsfv
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etgam59纳米粒的制备制备1%的壳聚糖醋酸溶液（cs，0.5mg/ml），ph值调节至4.8；三聚磷酸钠溶液（tpp，0.75mg/ml）；将cs溶液在磁悬浮搅拌器中搅拌10min，然后缓慢加入制备好的病毒颗粒，继续搅拌10min；然后滴加tpp溶液，待溶液由澄清色变为有乳光色沉淀的时候停止滴加，纳米粒的生成，然后继续搅拌20min。
技术总结
本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫的壳聚糖/纳米粒的制备方法，选用的重组病毒颗粒rSFV


技术研发人员：李建华 王京森 张西臣 宫鹏涛 张楠 王晓岑 李新 马赫然 杨举
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29