本发明属于光学传感技术领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的gpc3检测方法。
背景技术：
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（gpc3）是一种硫酸类肝素蛋白多糖。常用的gpc3检测方法是酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)，利用抗原和抗体间的特异性反应进行分析检测，但是elisa存在价格高、稳定性差、不易储存和运输等问题。适配体(aptamer)，被称为“人工替代抗体”，是一种人工设计的单链寡核苷酸(ssdna或rna)，具有以三级结构(如发卡、口袋、凸环等)特异识别靶分子的作用。发明专利cn106636108a公开了一种特异性结合gpc3的核酸适配体及其应用，利用结合毛细管电泳的selex技术筛选与肝癌标志物gpc3特异性结合的适配体，获得具有特异结合gpc3的适配体序列g625，并利用该gpc3适配体制备肝癌血清诊断试剂、肝癌组织切片染色试剂以及肝癌相关的活体成像造影剂。荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,fret）是在一个荧光基团（供体）的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向另一个荧光基团（受体）转移的过程，fret传感器系统需要两个不同的荧光基团，传统的有机荧光基团价格昂贵，且荧光不稳定，容易发生不可逆的光漂泊，不适合可靠长期检测。开发新型低成本的fret传感体系用于肿瘤标记物检测始发展方向。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于纳米金碳量子点（aucds）和磁性石墨烯（fe3o4/go）的荧光共振能量转移的gpc3检测方法，该方法能达到3.01ng/ml的检测限。
为了解决该技术问题，采用aucds作为荧光物质，将巯基化gpc3适配体（gpc3apt）与aucds通过au-s键进行结合，形成荧光标记的aucds-gpc3apt复合物。在aucds-gpc3apt溶液中加入fe3o4/go分散液，aucds-gpc3apt复合物与fe3o4/go通过范德华力结合在一起，发生荧光共振能量转移，使aucds-gpc3apt的荧光能量转移到了fe3o4/go上，整个系统的荧光强度就会变低；加入gpc3蛋白后，由于gpc3apt的特异性，gpc3会优先与aucds-gpc3apt结合，适配体构象改变，从fe3o4/go底面分离，抑制了荧光共振能量转移，从而使aucds-gpc3apt的荧光得到恢复。根据反应体系中荧光强度恢复程度的变化，建立gpc3浓度和aucds-gpc3apt的荧光强度变化的线性关系，实现了gpc3的快速灵敏、选择性好的定量检测。
本发明按照以下步骤进行：
步骤1：荧光共振供体aucds-gpc3apt的制备
(1)aucds的制备：往葡萄糖溶液添加haucl4溶液，搅拌均匀，滴加脱水柠檬酸三钠（sct）溶液继续搅拌、加热，反应完成后冷却、离心，得到aucds溶液；
(2)aucds-gpc3apt的制备：量取aucds和gpc3apt，在室温且避光的条件下搅拌混合一定时间，得到aucds-gpc3apt溶液。
步骤2：荧光共振能量转移的反应体系的构建
(1)称量fe3o4/go粉末，加入超纯水定容，放入超声波细胞破碎机中破碎，至fe3o4/go粉末完全分散在超纯水中，即得fe3o4/go分散液；
(2)将fe3o4/go溶液和aucds-gpc3apt溶液进行混合，混匀后静置孵育一段时间，使aucds的荧光淬灭，形成aucds-gpc3apt-fe3o4/gofret反应体系。用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，测量其440nm处荧光强度，记作f0。
步骤3：gpc3工作曲线的绘制
(1)将不同浓度的gpc3溶液加入到aucds-gpc3apt-fe3o4/gofret反应体系，在一定温度下孵育反应一段时间，检测350nm处的峰值变化；用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，测量其440nm处荧光强度，记作f1；
(2)用(f1-f0)/f0作为纵坐标，gpc3浓度作为横坐标，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限。
步骤4：实际样品中gpc3的检测
(1)将待测样品加入到步骤2中的aucds-gpc3apt-fe3o4/gofret的反应体系，在一定温度下孵育反应一段时间，采用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，记录440nm处的荧光强度；
(2)根据步骤3所得到的gpc3的工作曲线，计算待测样品中gpc3的浓度。
进一步，所述步骤1中gpc3-apt的dna序列为5’-taacgctgaccttagctgcatggctttacatgttcca-sh-3’；
进一步，所述步骤1中haucl4溶液的浓度为10mmol/l；
进一步，所述步骤1中sct溶液的浓度为0.01mol/l；
进一步，所述步骤1中aucds-gpc3apt浓度为200nmol/l；
进一步，所述步骤1中室温避光混合时间为4h；
进一步，所述步骤2中fe3o4/go溶液浓度为2.0mg/ml；
进一步，所述步骤2中fe3o4/go溶液和aucds-gpc3apt液的体积比为1:1；
进一步，所述步骤2中孵育温度为25°c，孵育时间为50分钟；
进一步，所述步骤2、步骤3和步骤4中荧光分光光度计的激发波长为350nm，发射波长440nm。
进一步，所述步骤3和步骤4中孵育温度为25°c，孵育时间为140分钟。
其中，步骤1提供了一种发出黄色荧光的aucds的纳米荧光材料和aucds-gpc3apt探针，为步骤2提供荧光共振能量转移反应体系的荧光能量供体。步骤2提供了fe3o4/go纳米材料，是荧光能量转移受体；利用aucds-gpc3apt中的核酸适配体碱基与fe3o4/go通过范德华力和π-π共轭作用，使得aucds-gpc3apt和fe3o4/go紧密接近，发生fret现象，呈现出aucds-gpc3apt的荧光猝灭。步骤3当gpc3导入aucds-gpc3apt-fe3o4/go的fret反应体系中，由于gpc3apt优先结合gpc3并伴随其构象变化，极大地削弱了aucds-gpc3apt和fe3o4/go之间的相互作用力。因此，gqds-apt与fe3o4/go分离，fret过程被抑制，从而使aucds-gpc3apt的荧光恢复。步骤3的gpc3的工作曲线为步骤4的实际样本中gpc3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用aucds-gpc3apt和fe3o4/go间的荧光共振能量转移原理建立一种gpc3的检测方法。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、利用fe3o4/go的优良荧光猝灭性质和aucds的荧光强度强且稳定，以保证传感器的稳定性；fe3o4/go对gpc3适配体链的吸附能力强，可以有效吸附更多的适配体链，使得aucds的荧光强度有效淬灭，适配体和目标物之间的亲和力常常比抗原和抗体之间的亲和力强，提高检测灵敏度及检测范围。此外，适配体比抗体更易被化学方法标记和修饰，这些处理有助于纳米粒子和其表面的功能化以荧光共振能量转移原理构建的荧光分析方法，检测过程操作简单，可以实现一步式的反应，检测时间短且成本低。
2、该体系采用以gpc3适配体为识别探针检测gpc3的方法，这种生物探测方法具有背景干扰小的特点，能够有效提高检测的精确度。
附图说明
图1基于aucds-fe3o4/go的荧光共振能量转移结合适配体检测gpc3的原理图；
图2aucds和aucds-gpc3apt的荧光光谱图；
图3a是aucds的透射电镜图；b是fe3o4/go的扫描电镜图；
图4不同gpc3浓度下aucds-gpc3apt-fe3o4/gofert系统的荧光恢复强度图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于aucds-fe3o4/go的荧光共振能量转移结合适配体检测gpc3的方法，检测原理见图1。首先是将aucds作为荧光基团，将巯基化的gpc3apt与aucds通过au-s键进行结合，形成荧光标记的aucds-gpc3apt；再加入fe3o4/go，由于fe3o4/go和aucds之间存在很强的共轭作用，这使得fe3o4/go和aucds-gpc3apt紧密接近，呈现出了aucds-gpc3apt的荧光猝灭；加入目标物gpc3蛋白后，gpc3apt与gpc3蛋白特异性结合，从而使aucds-gpc3apt远离fe3o4/go，aucds-gpc3apt的荧光得到恢复，建立了一种gpc3蛋白的检测方法。通过荧光分光光度计测量荧光强度的变化，可以有效的对gpc3蛋白实现定量分析。实施步骤如下：
（1）aucds-gpc3apt的制备
①将30mg葡萄糖与蒸馏水定容至50ml，得到0.6mg/ml的葡萄糖溶液。
②添加0.01mol/l的haucl4溶液到葡萄糖溶液中并搅拌30分钟。
③将0.01mol/l的sct逐滴加入到葡萄糖和haucl4的混合溶液中再继续搅拌5分钟，使其混合更加完全。
④将反应混合物倒入衬有特氟隆的水热反应器中，并在鼓风干燥箱中于200℃加热6小时。反应完成后，将容器冷却至室温后，用13000r/min的转速离心20分钟得到aucds。
⑤量取5ml的aucds和40μl浓度为80nmol/l的gpc3apt，并将它们混合，为了让au-s键能更好的连接要在室温且避光的条件下搅拌4h，后得到aucds-gpc3apt溶液。图2是aucds和aucds-gpc3apt的荧光光谱图，二者的荧光光谱基本一致，aucds-gpc3apt的荧光强度较aucds的荧光强度小，说明了aucds与gpc3apt已成功连接。图3a是aucds的透射电镜图，所制备的aucds的大小均匀，分散性良好，粒径在5nm左右。
（2）荧光共振能量转移的反应体系的构建
①称量0.04g的fe3o4/go粉末，加入超纯水定容于20ml，然后放入超声波细胞破碎机中破碎4h，等到fe3o4/go粉末完全分散在超纯水中，即得到2.0mg/ml的fe3o4/go分散液。图3b是fe3o4/go的扫描电镜图，图中呈球状的是fe3o4/go，粒径在50nm左右。
②吸取400μl2.0mg/mlfe3o4/go和400μl200nmol/laucds-gpc3apt混合，加入到320μlph为7.0的hepes缓冲溶液中，震荡混和均匀后在25℃下孵育50分钟，得到aucds-gpc3apt-fe3o4/gofert系统。用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，测量其在440nm处的荧光强度，记作f0。
（3）gpc3工作曲线的绘制
将步骤2中测定了荧光强度后的aucds-gpc3apt-fe3o4/gofert系统均匀分成10组，然后按浓度梯度加入40μlgpc3蛋白溶液（5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，60ng/ml，80ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，600ng/ml），震荡混和均匀后在25℃下反应140分钟，用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，测定其在440nm处的荧光强度，记作f1。不同gpc3浓度下aucds-gpc3apt-fe3o4/gofert系统的荧光光谱图见图4，可看出aucds-gpc3apt-fe3o4/go荧光适配体传感器的荧光恢复强度((f1-f0)/f0)与gpc3浓度的呈正相关。当gpc3蛋白浓度范围为5.0ng/ml~100ng/ml时，aucds-gpc3apt-fe3o4/go荧光适配体传感器的荧光恢复值与gpc3浓度之间的关系是呈线性的，工作曲线为y=2.30743 0.0197x（其中y是荧光恢复强度值，x为gpc3浓度），其相关系数r2=0.99352，aucds-gpc3apt-fe3o4/go荧光适配体传感器的最低检测限为3.01ng/ml。
（4）实际血清样本中gpc3的检测
将浓度为20ng/ml、60ng/ml、120ng/ml的gpc3标准溶液与正常人血清样本以1:1的比例充分混合，制成混合液。然后用制备好的aucds-gpc3apt-fe3o4/go荧光适配体传感器检测混合液的荧光恢复强度值。根据步骤3所得到的工作曲线y=2.30743 0.0197x，计算可得到对应的实际血清样本中gpc3的浓度，检测结果见表1。可以得出，aucds-gpc3apt-fe3o4/go荧光适配体传感器回收率为98.76%-101.29%，而相对标准偏差在0.53%-2.04%之间，在肝癌的临床诊断领域有潜在应用。
表1实际血清样本中gpc3的检测结果
1.一种基于荧光共振能量转移的gpc3检测方法，按以下步骤进行：
步骤1：荧光共振供体aucds-gpc3apt的制备
aucds的制备：往葡萄糖溶液添加haucl4溶液，搅拌均匀，滴加脱水柠檬酸三钠（sct）溶液继续搅拌、加热，反应完成后冷却、离心，得到aucds溶液；
aucds-gpc3apt的制备：量取aucds和gpc3apt，在室温且避光的条件下搅拌混合一定时间，得到aucds-gpc3apt溶液；
步骤2：荧光共振能量转移的反应体系的构建
称量fe3o4/go粉末，加入超纯水定容，破碎，分散，即得fe3o4/go分散液；
将fe3o4/go溶液和aucds-gpc3apt溶液混合，孵育，使aucds的荧光淬灭，形成aucds-gpc3apt-fe3o4/gofret反应体系；用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，测量其440nm处荧光强度，记作f0；
步骤3：gpc3工作曲线的绘制
将不同浓度的gpc3溶液加入到aucds-gpc3apt-fe3o4/gofret反应体系，孵育，用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，测量其440nm处荧光强度，记作f1；
用(f1-f0)/f0作为纵坐标，gpc3浓度作为横坐标，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤4：实际样品中gpc3的检测
将待测样品加入到步骤2中的aucds-gpc3apt-fe3o4/gofret的反应体系，孵育，采用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为350nm，记录440nm处的荧光强度变化；
根据步骤3所得到的gpc3的工作曲线，计算待测样品中gpc3的浓度。
2.按照权利要求1所述的gpc3检测方法，其特征在于：步骤1中所述破碎时间为4h；fe3o4/go分散液浓度为2.0mg/ml。
3.按照权利要求1所述的gpc3检测方法，其特征在于：步骤2中所述孵育温度为25°c，孵育时间为50分钟；缓冲液ph为6.5-7.5。
4.按照权利要求1所述的gpc3检测方法，其特征在于：步骤2中所述aucds-gpc3apt浓度为200nmol/l。
5.按照权利要求1所述的gpc3检测方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述孵育温度为25°c，孵育时间为140分钟。
技术总结