一种用于指导人高血压用药的试剂盒的制作方法

1.本发明涉及试剂盒领域，更具体地涉及一种用于指导人高血压用药的试剂盒。


背景技术：

2.慢性非传染性疾病的种类繁多，患者需长期乃至终身用药。随着社会经济发展和人们生活方式的改变，以高血压、高血糖、高血脂为代表的“三高”在我国中老年人群中的发病率呈逐年上升趋势。长期处于高血压状态的人体容易产生各种并发症，包括脑卒中、心肌梗死、动脉粥样硬化等，这些严重的并发症对患者造成了极大的生理和心理负担。
3.目前治疗高血压多采用药物控制手段。市面上可供选择的高血压药物种类较多，同时这些药物控制血压的原理有较大差别。一般来说，在传统的诊治过程中，医生选择药物会考虑因素包括：患者的病情、生理状态、年龄、性别、生活规律、饮食作息等。但随着科技的发展，现在人们逐渐意识到基因对药物的治疗效果可能会产生较大的影响。尤其是在可供选择药物较多、药物作用原理存在较大差异的情况下，患者特定的基因型可能决定了某一类药物的治疗效果。因此开展基因检测辅助临床用药选择是目前提高治疗效果、降低不良反应的推荐手段，这一点在国际上已达成共识。
4.国内外科学期刊上不时有关于高血压药物相关基因的研究报道，其中有些报道了新的药物基因，有些对已有的药物基因的重要性表达质疑。而对于东西方人群的人种差异导致的基因频率差异和显著性差异，近年来也有相关报道。鉴于此，挑选在亚洲人群，尤其是中国人群中能够显著影响高血压药物治疗效果的基因，排除证据等级较低或者中国人群中变异频率极低的基因位点，才能更有效地通过基因检测预测高血压治疗药物的疗效和不良反应，提高临床治疗效果。
5.目前市场上提供药物基因组学检测的产品主要基于基因芯片、二代测序、荧光定量pcr等技术。基因芯片和二代测序虽然具有高通量的特点，能同时检测上百万个基因位点的结果，但是由于缺乏临床证据，其绝大部分检测结果属于冗余数据，没有临床价值，增加了检测成本，性价比低，并且其产生的大量数据后续需要复杂的生物信息分析流程，消耗大量数据分析时间，效率也不高；荧光定量pcr技术能快速检测目标位点，相应的数据分析也相对简单，但是受到技术限制，一个反应只能检测单个样本的单个位点，因此不具备同时处理大批量样本的能力，不适合推广到临床应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于指导人高血压用药的试剂盒，从而解决现有技术中缺乏检测高血压用药相关基因的试剂盒的问题。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
8.根据本发明的一个优选方案，提供一种用于指导人高血压用药的试剂盒，该试剂盒可同时对21个基因位点进行snp分型，所述试剂盒包括用于检测21个基因位点的21对扩增引物，该21对扩增引物的序列如seq id no.1～42所示。
9.根据本发明，除了rs4646994所代表的基因位点之外，所述试剂盒还包括用于检测其余20个基因位点的20条延伸引物，所述20条延伸引物的序列如seq id no.43～62所示。
10.根据本发明，基因位点rs4646994通过电泳检测，除了rs4646994之外的20基因位点通过飞行时间质谱进行检测。
11.根据本发明的一个特别优选方案，提供一种用于指导人高血压用药的试剂盒，其中，检测的基因位点、突变类型、所用引物序列、引物浓度信息如下所示：
12.1)ace rs4291(a
‑‑‑
＞t，野生型为a，突变型为t，下同)
13.pcr扩增引物/终浓度：
14.seq id no.1：acgttggatgcagaggaagctggagaaagg(上游引物，下同)(1
‑
1.2μm)
15.seq id no.2：acgttggatgtcgggtgttccggcaaactg(下游引物，下同)(1
‑
1.2μm)
16.核酸质谱延伸引物/终浓度：
17.seq id no.43：agggcctcctctcttt(6.18
‑
6.48μm)
18.2)adrb1rs1801253(c
‑‑‑
＞g)
19.pcr扩增引物/终浓度：
20.seq id no.3：acgttggatgggtctccgtgggtcgcgtg(1
‑
1.2μm)
21.seq id no.4：acgttggatgaaccccatcatctactgccg(1
‑
1.2μm)
22.核酸质谱延伸引物/终浓度：
23.seq id no.44：cgcagcagagcagtc(5.55
‑
5.85μm)
24.3)agtr1rs5186(a
‑‑‑
＞c)
25.pcr扩增引物/终浓度：
26.seq id no.5：acgttggatgagaacattcctctgcagcac(1
‑
1.2μm)
27.seq id no.6：acgttggatgtcagagctttagaaaagtcg(1
‑
1.2μm)
28.核酸质谱延伸引物/终浓度：
29.seq id no.45：cctgcactaccaaatgagc(7.99
‑
8.01μm)
30.4)bcrp rs2231142(g
‑‑‑
＞t)
31.pcr扩增引物/终浓度：
32.seq id no.7：acgttggatggtcatagttgttgcaagccg(1
‑
1.2μm)
33.seq id no.8：acgttggatgtgatgttgtgatgggcactc(1
‑
1.2μm)
34.核酸质谱延伸引物/终浓度：
35.seq id no.46：agagctgctgagaact(6.20
‑
6.54μm)
36.5)cyp2c19rs4244285(g
‑‑‑
＞a)
37.pcr扩增引物/终浓度：
38.seq id no.9：acgttggatgtccatcgattcttggtgttc(1
‑
1.2μm)
39.seq id no.10：acgttggatggcaataattttcccactatc(1
‑
1.2μm)
40.核酸质谱延伸引物/终浓度：
41.seq id no.47：taagtaatttgttatgggttcc(9.38
‑
9.58μm)
42.6)cyp2c9rs1057910(a
‑‑‑
＞c)
43.pcr扩增引物/终浓度：
44.seq id no.11：acgttggatgatgcaagacaggagccacat(1
‑
1.2μm)
45.seq id no.12：acgttggatgtgtcacaggtcactgcatgg(1
‑
1.2μm)
46.核酸质谱延伸引物/终浓度：
47.seq id no.48：gtgttgcacgaggtccagagatac(10.35
‑
10.55μm)
48.7)cyp2c9rs4918758(t
‑‑‑
＞c)
49.pcr扩增引物/终浓度：
50.seq id no.13：acgttggatgtaatgcacagaaagcaaagg(1
‑
3μm)
51.seq id no.14：acgttggatggggtccatttagtgatttcc(1
‑
3μm)
52.核酸质谱延伸引物/终浓度：
53.seq id no.49：gggaacagttgtggatgcaata(9.31
‑
9.71μm)
54.8)cyp2d6 rs1058164(g
‑‑‑
＞c)
55.pcr扩增引物/终浓度：
56.seq id no.15：acgttggatgttcttgcccaggcccaagtt(1
‑
1.2μm)
57.seq id no.16：acgttggatgctaatgccttcatggccacg(1
‑
1.2μm)
58.核酸质谱延伸引物/终浓度：
59.seq id no.50：ggacgttgcgcaaggtgga(8.21
‑
8.35μm)
60.9)cyp2d6 rs1065852(g
‑‑‑
＞a)
61.pcr扩增引物/终浓度：
62.seq id no.17：acgttggatgtggtggacctgatgcaccg(1
‑
1.2μm)
63.seq id no.18：acgttggatgacatgcagcaggttgcccag(1
‑
1.2μm)
64.核酸质谱延伸引物/终浓度：
65.seq id no.51：ggatgggctgcacgctac(7.40
‑
7.66μm)
66.10)cyp2d6 rs1135840(g
‑‑‑
＞c)
67.pcr扩增引物/终浓度：
68.seq id no.19：acgttggatggcacagcacaaagctcgtag(1
‑
1.5μm)
69.seq id no.20：acgttggatgtgctgcagcacttcagcttc(1
‑
1.5μm)
70.核酸质谱延伸引物/终浓度：
71.seq id no.52：tcgtagggggatggg(6.04
‑
6.34μm)
72.11)cyp2d6 rs28371725(c
‑‑‑
＞t)
73.pcr扩增引物/终浓度：
74.seq id no.21：acgttggatgtcccagcaaagttcatgggc(1
‑
1.2μm)
75.seq id no.22：acgttggatgtgatcctacatccggatgtg(1
‑
1.2μm)
76.核酸质谱延伸引物/终浓度：
77.seq id no.53：cccgcctgtaccctt(5.24
‑
5.54μm)
78.12)cyp3a4 rs2740574(t
‑‑‑
＞c)
79.pcr扩增引物/终浓度：
80.seq id no.23：acgttggatgatgaggacagccatagagac(1
‑
1.2μm)
81.seq id no.24：acgttggatgatcagaaactcaagtggagc(1
‑
1.2μm)
82.核酸质谱延伸引物/终浓度：
83.seq id no.54：ccctccatagagacaagggca(8.75
‑
9.05μm)
84.13)cyp3a5 rs776746(t
‑‑‑
＞c)
85.pcr扩增引物/终浓度：
86.seq id no.25：acgttggatggtaatgtggtccaaacaggg(1
‑
1.2μm)
87.seq id no.26：acgttggatgatgtaccacccagcttaacg(1
‑
1.2μm)
88.核酸质谱延伸引物/终浓度：
89.seq id no.55：ccaaacagggaagagata(7.62
‑
7.82μm)
90.14)gnb3 rs5443(c
‑‑‑
＞t)
91.pcr扩增引物/终浓度：
92.seq id no.27：acgttggatgtcgtagccagcgaatagtag(1
‑
1.2μm)
93.seq id no.28：acgttggatgtctcccacgagagcatcatc(1
‑
1.2μm)
94.核酸质谱延伸引物/终浓度：
95.seq id no.56：ggacggagggagaaggccac(8.74
‑
8.94μm)
96.15)ldlr rs688(c
‑‑‑
＞t)
97.pcr扩增引物/终浓度：
98.seq id no.29：acgttggatgctgggttgactccaaacttc(1
‑
1.2μm)
99.seq id no.30：acgttggatgatcctccaagatggtcttcc(1
‑
1.2μm)
100.核酸质谱延伸引物/终浓度：
101.seq id no.57：tcaagcatcgatgtcaa(6.98
‑
7.02μm)
102.16)nedd4l rs4149601(g
‑‑‑
＞a)
103.pcr扩增引物/终浓度：
104.seq id no.31：acgttggatgaggaaggtaaaacctcctcc(1.5
‑
2.5μm)
105.seq id no.32：acgttggatgctcctaaatgagacgtctcg(1.5
‑
2.5μm)
106.核酸质谱延伸引物/终浓度：
107.seq id no.58：aaagtcttaccgagtgttac(8.30
‑
8.60μm)
108.17)orm1 rs17650(a
‑‑‑
＞g)
109.pcr扩增引物/终浓度：
110.seq id no.33：acgttggatgatgtgctcaggacagggcta(1
‑
1.2μm)
111.seq id no.34：acgttggatgttgtgtgccaacctagtacc(1
‑
1.2μm)
112.核酸质谱延伸引物/终浓度：
113.seq id no.59：ctcgcccaggcactcacc(7.25
‑
7.35μm)
114.18)slco1b1 rs2306283(a
‑‑‑
＞g)
115.pcr扩增引物/终浓度：
116.seq id no.35：acgttggatggatgttcttacagttacagg(2
‑
2.5μm)
117.seq id no.36：acgttggatgattaaacaagtggataagg(2
‑
2.5μm)
118.核酸质谱延伸引物/终浓度：
119.seq id no.60：acaggtattctaaagaaactaatatc(11.00
‑
11.14μm)
120.19)slco1b1 rs4149056(t
‑‑‑
＞c)
121.pcr扩增引物/终浓度：
122.seq id no.37：acgttggatgtatgggagtctcccctattc(1
‑
1.2μm)
123.seq id no.38：acgttggatgaatctgggtcatacatgtgg(1
‑
1.2μm)
124.核酸质谱延伸引物/终浓度：
125.seq id no.61：cctaagcatattacccatgaac(9.00
‑
9.40μm)
126.20)yeats4 rs7297610(c
‑‑‑
＞t)
127.pcr扩增引物/终浓度：
128.seq id no.39：acgttggatgaggtataaccccgttttccc(1
‑
1.2μm)
129.seq id no.40：acgttggatgtcaaatcactcctcctttgc(1
‑
1.2μm)
130.核酸质谱延伸引物/终浓度：
131.seq id no.62：accagaattcatagaaggaaa(8.86
‑
9.16μm)
132.21)ace rs4646994(电泳法检测)
133.pcr扩增引物/终浓度：
134.seq id no.41：ttctcccatttctctagacctgct(0.5
‑
0.6μm)
135.seq id no.42：tgtaaggggagctcagagaatttc(0.5
‑
0.6μm)。
136.根据本发明的一个优选方案，所述试剂盒的多重pcr扩增的反应体系如下：
137.优选地，所述试剂盒的电泳pcr扩增的反应体系如下：优选地，所述试剂盒的电泳pcr扩增的反应体系如下：
138.优选地，所述试剂盒还包括iplex延伸反应体系，所述iplex延伸反应体系如下：
139.根据本发明提供的试剂盒，一共涉及21个snp位点，除ace的rs4646994通过电泳检测片段大小进行分型，其它20个位点均通过飞行时间质谱进行snp检测。rs4646994突变的
特殊性在于，ace基因的第16个内含子中存在一段长度为287bp的alu序列插入/缺失(i/d)。所以，存在插入序列的片段比缺失的片段多近300bp的大小。我们首先通过普通pcr对这段序列进行扩增，扩增后可能获得两个片段的大小差异，然后再通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分辨。通过片段大小差异进行电泳区分基因型是目前市面上已有检测ace多态性的试剂盒的常用方法，该方法简单、快捷、节省、准确。我们基于这一检测方法设计了特异性引物序列，调整引物终浓度，实现准确、灵敏的检测该位点的插入缺失片段。
140.其余的20个snp位点的检测实验，大体可分为三个步骤，首先是多重pcr扩增snp所在基因片段，其次是单碱基延伸，最后采用飞行时间质谱检测snp分型。飞行时间质谱采用美国agena公司的massarray仪器和配套试剂盒。本发明所使用的系统整合了pcr的高灵敏度、基因芯片的高通量和飞行质谱的高精确度，有广阔的市场前景。
141.因现有的大部分药物基因组学数据来源于西方，研究对象也普遍是高加索人种，因此选择位点时，需要额外考虑研究对象的差异。本发明选取位点的原则包括：1)重要性，即该snp对药物治疗有显著影响；2)相关性，即在亚洲人群中也存在关于该snp的相关报道；3)必要性，即该snp的突变频率有检测的意义。在确定位点后进行多重pcr引物设计，然后扩增效果验证，以确定最终的引物组合。
142.根据本发明提供的试剂盒，选取了15个高血压相关基因上的共21个snp位点，这些位点是发明人通过大量文献阅读，搜集证据，对证据进行评级，然后结合自建中国人群基因突变型数据库中基因型频率数据才最终确定的。虽然根据现有的资料记载，可以用于指导高血压疾病用药指导的基因位点很多，但是我们选取的21个snp位点是既具有丰富的临床试验证据支持，又适合中国人群遗传特征的位点。因此，本发明的关键发明点即在于此，通过查阅最新中外文献，并结合自建数据库，挑选适合中国人群的位点，在保证检测结果准确性的前提下，提高临床指导意义。
143.在21个基因位点组合确定后，发明人进一步针对每个基因位点设计专用引物，然后通过多次尝试不同的引物组合，最终选择出对绝大部分样本都可以达到21个snp位点精准分型，同时空白对照又没有出现异常延伸的引物组合，最终才得到具有非常显著的应用效果的试剂盒。而既可以同时对21个snp位点进行精准分型，同时又不会出现异常延伸对于获得一个合格的试剂盒来说是非常重要，是必须同时满足的两个要求。
144.本发明可用于cyp2d6(包括rs28371725，rs1135840，rs1065852，rs1058164四个snp位点)，cyp2c9(包括rs1057910，rs4918758两个snp位点)；ace(包括rs4291，rs4646994两个snp位点)；slco1b1(包括rs4149056，rs2306283两个snp位点)；adrb1 rs1801253；agtr1 rs5186；bcrp rs2231142；cyp2c19 rs4244285；cyp3a4 rs2740574；cyp3a5 rs776746；gnb3 rs5443；ldlr rs688；neddl4 rs4149601；orm1 rs17650；yeats4 rs7297610的基因分型检测。
145.其中，cyp2d6是cyp代谢酶家族中重要一员，参与美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛的代谢；cyp2c9参与厄贝沙坦、氯沙坦、缬沙坦、吲达帕胺的代谢；ace基因编码血管紧张素转换酶，其多态性对ace转换酶抑制剂类药物(包括福辛普利、卡托普利、赖诺普利、培哚普利、依那普利、贝那普利)的影响较为显著。slco1b1是一类转运蛋白，研究表明slco1b1的多态性能够显著影响奥美沙坦的代谢，进而影响药物的治疗效果；adrb1的多态性与β阻滞剂治疗效果相关；agtr1基因在肾素
‑
血管紧张素
‑
醛固酮系统中发挥作用；bcrp基因多态性显著
影响中国人群使用非洛地平时的治疗效果；cyp2c19、cyp3a4、cyp3a5也是三种cyp代谢酶，这些基因上的snp能够对吲达帕胺以及“地平”类药物的治疗效果产生影响；gnb3基因编码一种膜蛋白，该基因的突变能够影响替米沙坦的药效；ldlr编码低密度脂蛋白受体，其基因多态性常与高血脂药联系，目前也发现该多态性能够影响阿替洛尔的降压效果。nedd4l编码泛素连接酶，有证据表明该基因的多态性与常用高血压药物氢氯噻嗪的降压效果相关；orm1编码d 1
‑
酸性糖蛋白的亚基，其基因突变后可导致替米沙坦在人体内代谢速率下降；yeats4基因多态性对氢氯噻嗪的药效有影响。
146.应当理解的是，本试剂盒的检测结果为基因位点对的分型结果，在用于临床用药指导前需对分型结果进行综合分析和判读，按照已有共识进行药物划分。本检测结果仅供参考，最终给药方案仍需结合各方面情况综合确定。
147.根据本发明提供的一种指导高血压患者用药的体外辅助诊断试剂盒，可以对目前市面上常见的几乎所有高血压药物的治疗效果、不良反应等给出基因层面的预测。现有高血压用药检测试剂盒的检测位点大都限于代谢基因，对药效和不良反应的预测能力较差；同时检测通量较低、成本较高。采用核酸质谱技术的本产品，允许一个反应同时检测单个样本的数十个基因位点，采用384孔pcr板可以同时完成300余个样本的检测分析，在保证高通量的同时，又降低了成本。每份样品检测15个基因的21个snp位点，涵盖5类(血管紧张素ii受体抑制剂、ace转换酶抑制剂类药物、β肾上腺素受体抑制剂类药物、钙离子通道阻断药、利尿剂)，共计28种常见高血压药物(奥美沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦、福辛普利、卡托普利、赖诺普利、培哚普利、依那普利、贝那普利、阿替洛尔、布新洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、卡维地洛、阿罗洛尔、比索洛尔、拉贝洛尔、氨氯地平、硝苯地平、拉西地平、非洛地平、呋塞米、氢氯噻嗪、托拉塞米、吲达帕胺)。与其它指导高血压用药的基因检测手段相比，本发明所使用的方法在保证检测准确度的前提下，成本更低、检测周期更短。
148.综上所述，根据本发明提供的一种指导高血压患者用药的体外辅助诊断试剂盒，可用于帮助高血压患者从基因层面筛选高血压药物，采用本发明进行药物基因检测，可以在确保检测准确性、及时性的基础上，为患者提供有一定临床意义的指导意见。同时，根据本发明提供的试剂盒，允许一个反应同时检测单个样本的21个基因位点，采用384孔pcr板可以同时完成300余个样本的检测分析，在保证高通量的同时，又降低了成本。
附图说明
149.图1是ace rs4646994位点的电泳检测图(杂合)；
150.图2为cyp2c9基因rs1057910分型质谱图(该样本为aa纯合基因型)；
151.图3是飞行时间质谱单碱基延伸和检测原理图。
具体实施方式
152.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
153.实施例1有关试剂盒的详情说明
154.1.1检验原理
155.本试剂盒检测snp采用电泳和飞行时间质谱结合的方法。
156.1.1.1电泳方法：
157.1)pcr扩增：pcr体系组成参见下表1，通过pcr对ace rs4646994位点所在dna片段进行扩增。
158.2)琼脂糖凝胶电泳：对上一步骤中的pcr产物进行电泳，通过对比dnamarker，分析产物片段大小。可能出现以下三种情况：1、只有400bp左右大小的电泳结果，则该样本基因型为ii；2、只有100bp左右大小的电泳结果，则该样本基因型为dd；3、同时出现400bp和100bp左右大小的电泳结果，则该样本基因型为i/d(杂合子)。电泳结果如图1所示。
159.电泳方法使用单独的扩增引物，其它试剂同多重pcr试剂。
160.1.1.2飞行时间质谱方法：
161.1)多重pcr：在同一个体系内添加多条引物对，经过一个反应扩增snp附近序列。
162.2)单碱基延伸：将纯化过后的模板中加入snp序列特异延伸引物，并用ddntp作为原料进行延伸，因此该步骤可在snp位点延伸1个碱基，该突变位点的碱基在不同样本中有所不同。
163.3)飞行时间质谱：将上述单碱基延伸产物与基质溶液按一定比例混合，滴加于样品台，干燥共结晶。随后样品进入离子源，经过质谱仪的真空管激光的激发，核酸分子成为带正电荷的离子(通常为带一个正电荷)。在飞行距离、电荷一致的情况下，飞行时间和离子质量成反比，通过飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出snp位点信息。
164.以cyp2c9基因rs1057910分型质谱图(该样本为aa纯合基因型)为例进行说明，如图2所示。该图显示横坐标为核酸片段飞行时间，纵坐标显示对应时间点检测到的核酸信号。由于延伸反应只延长一个碱基，所以飞行时间的差异反映了检测位点的碱基差异。结合延伸引物本身的质量，预测不同碱基类型所处的飞行时间，即图中a和c虚线处的位置。该样本在a碱基处检测到信号峰，c碱基处没有，因此该位点为aa纯合基因型。
165.本发明试剂盒的检测流程包括特异性引物扩增、sap反应、单碱基延伸、质谱检测等环节，检测原理如图3所示。
166.1.2主要组成成分
167.该试剂盒的主要组成成分包括：pcr反应混合液，taq酶，(普通)pcr扩增引物，(多重pcr)扩增引物混合液，sap buffer，sap enzyme，单碱基延伸反应混合液，iplex enzyme，延伸引物混合液，ddh2o，阳性对照品，脱盐树脂，质谱芯片。
168.1.3储存条件及有效期
169.本试剂盒保存于
‑
20℃，保质期9个月。
170.1.4配套仪器
171.通用pcr仪；dr massarray。
172.1.5样本要求
173.本品适用于从口腔黏膜细胞、口腔脱落细胞、血液、组织和干血片中提取的基因组dna，要求dna a260/a280比值应介于1.8到2.0之间。冷冻dna样本应保存在
‑
20℃以下，并且避免反复冻融。
174.1.6检验方法
175.1.6.1pcr反应
176.1)在pcr i区，从
‑
20℃冰箱中将各试剂(盒)取出，置于冰上(4℃)融解，再从4℃冰
箱取出扩增引物，均涡旋震荡10s后简短离心，备用。
177.2)按表2依次加入相关试剂组分配置pcr反应混合液，并做好标记、分装至96孔板中，3μl/孔；分装完后从pcr i区通过传递窗传至ii区。表1：pcr体系组成(电泳用)pcr反应混合液(由缓冲液、mg
2
溶液和dntps混合)2μl扩增引物混合液(寡聚核苷酸)0.5μltaq酶1udna模板2μl水补齐至5μl表2：多重pcr混合液pcr反应混合液(由缓冲液、mg
2
溶液和dntps混合)2μl扩增引物混合液(寡聚核苷酸)0.5μltaq酶1udna模板2μl水补齐至5μl
178.3)在pcrii区，从
‑
20℃冰箱取出dna模板，冰上(4℃)熔解，涡旋震荡10s后简短离心，吸出一定量dna稀释至5ng/μl，备用。
179.4)向96孔板中每孔加入2μl 5ng/μldna模板，盖上管盖，涡旋震荡10s后简短离心，从pcrii区通过传递窗传至iii区，再从pcriii区通过传递窗传至iv区，每次实验时必须设定空白对照(2μlddh2o)、阴性对照(2μldna提取洗脱液)和阳性对照。
180.5)将96孔板放入扩增仪，运行程序：pcr具体程序如下：95℃ 2分钟，
181.6)ace多态性普通pcr流程
182.1.6.2sap反应
183.1)pcr反应结束后，根据表3在1.5ml ep管中配制sap混液。表3的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。该配置过程在pcr i区完成。表3：sap反应混合液sap缓冲液0.17μl cutsmart buffer(生产商neb)sap酶0.5u(生产商neb)水补齐至2μl
184.2)将配制好的sap混液由pcr i区传递至iv区，加2μl sap混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μl)。
185.3)把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm，5秒)。
186.4)将板放上pcr仪进行以下程序：37℃ 40分钟，85℃ 5分钟，4℃保温。
187.1.6.3延伸反应
188.1)取出sap反应板2000rpm离心1min。
189.2)根据表4在1.5ml管中配制iplex延伸混液。表4的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。请根据实际反应的数量调整数字。该配置过程在pcr i区完成。表4：iplex延伸反应液单碱基延伸反应混合液(由缓冲液 acyntps混合)0.4μl(产自neb)iplex enzyme1u(产自neb)延伸引物混合液0.94μl水补齐至2μl
190.3)将iplex延伸混液由pcr i区传递至iv区，每一个孔加入2μl iplex延伸混液并混匀(加混液后总体积：9μl)。
191.4)把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm 5秒)。
192.5)将96孔板放上pcr仪进行以下热循环：
193.1.6.4调节(样本脱盐)
194.以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节程序。戴上手套和护眼镜。
195.1)把洁净树脂(resin)铺平在96/15mg凹坑板(dimple plate)上，风干最少10分钟。
196.注意：先用勺子将树脂铺放在板上，然后用刮板刮从左至右或从右至左刮树脂，使96个孔都被树脂填满，当96个孔都被填满后再用刮板轻轻地刮一遍并将表面残留的树脂刮下去，防止干扰下步贴膜。当树脂由深黄变为淡黄色，即表明树脂已经干的差不多了。
197.2)在样本板的每一个有样本的孔里加入41μl水，封膜(用普通的膜即可)，然后离心。
198.3)加入15mg洁净树脂(resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的凹坑板上，一定要孔对孔！然后将凹坑板连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。
199.4)用膜(用普通的膜即可)把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。
200.5)以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。
201.1.6.6质谱检测
202.1)打开“板管理系统”软件，编辑实验计划文件，包括样本的位置，样本名称和所用的引物，连接质谱仪与所建立的实验计划文件。
203.2)点startall图标，启动软件，并检查各项指示灯是否正常。
204.3)点击“芯片托盘进入/退出”按钮，把芯片放在托盘上，再放到芯片甲板上，记录芯片的位置(左边记为1，右边记为2)。手不要触及芯片表面；将96板放到标有mtp1/2的位置，按a1在左下角的方向放，固定好；芯片第一次使用时，在校准品加样槽内加入75μl的校正标准品，芯片非第一次使用时不需添加校正标准品。然后再点击“芯片托盘进入/退出”按钮，关闭夹板。
205.4)点击“添加/维持树脂”按钮，打开树脂槽，添加树脂或者补充高压灭菌纯化水(a.仪器第一次开机时需加28g树脂进入树脂槽内并加16ml灭菌纯化水混匀。b.第一次使用时把9g树脂全部倒入树脂槽内，并加入5.2ml高压灭菌纯化水，用枪头混匀。c.非第一次使用时，需观察液面，若水的液面低于树脂面，则应补充适量的高压灭菌纯化水，使得水的液面高于树脂面。c.树脂溶液加入树脂槽后，需尽快使用，且不能放置超过30天。)
206.5)程序设置参数如下：
207.6)打完质谱后，点击“从分析仪上移走旧芯片”按钮，把芯片退回芯片甲板上，然后点击“芯片托盘进入/退出”按钮，取出96孔板，封膜后于
‑
20
±
5℃保存；将芯片装回包装盒内并置于除湿器内保存(芯片开启后需尽快使用，保存时间不要超过30天)，回收校正标准样品于
‑
20
±
5℃保存，然后点击“芯片托盘进入/退出”按钮，关闭夹板。
208.1.6.7检验结果的解释
209.1)试剂盒有效性判定：标准品可以检测对应基因型，空白对照品(ddh2o)无信号检出，弱阳性对照可以检出对应阳性信号时，此次检测结果有效，否则此次检测结果无效。
210.1.6.8检验方法的局限性
211.1)本方法可能受到检测样本dna质量的影响，如果检测样本dna质量较差，可能出现假阴性结果。
212.2)本检测结果仅供临床用药参考，用于指导个体化用药，不能作为临床用药的唯一依据。
213.3)当本品检出对应位点的基因型为野生型时，不能排除该基因还有其它位点的突变。
214.1.6.9产品性能指标
215.本产品最低可以检出a260/a280纯度在1.70
‑
1.90之间的1ng人类基因组dna。
216.案例一：
217.赵先生，现年47岁，2年前体检时被诊断患有高血压伴有轻微高血脂疾病。但因工作繁忙没有重视血压控制。半年前感觉心慌气短并伴有心绞痛，前去当地医院就医。经连续几日检测，患者血压白天维持在190/100mmhg附近。主治医师建议使用苯磺酸氨氯地平片和卡托普利进行血压控制。用药2个月后，患者血压有所下降，但患者出现了踝部水肿等典型的钙离子拮抗剂不良反应。医生建议患者做高血压用药基因检测来确定换药方案。
218.试剂盒检测得到如下结果：基因位点基因型ace rs4291ttace rs4646994ddadrb1 rs1801253ccagtr1 rs5186aabcrp rs2231142gtcyp2c19 rs4244285ggcyp2c9 rs1057910aacyp2c9 rs4918758ctcyp2d6 rs28371725cccyp2d6 rs1135840ggcyp2d6 rs1065852agcyp2d6 rs1058164cgcyp3a4 rs2740574ttcyp3a5 rs776746ctgnb3 rs5443ctldlr rs688ccnedd4l rs4149601ggorm1 rs17650agslco1b1 rs4149056ctslco1b1 rs2306283ggyeats4 rs7297610tt
219.根据上面的结果，我们做出如下判读：
220.因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：
221.经过对患者的基因型进行检测，发现患者cyp3a5 rs776746位点为杂合突变，氨氯地平代谢速率下降，可能导致血药浓度升高继而出现药物不良反应。检测发现患者对血管紧张素受体抑制剂(沙坦类)药物较为敏感。结合报告，医生让患者暂时停用苯磺酸氨氯地平片，维持卡托普利药物的同时新加50mg/qd氯沙坦钾片进行降压治疗。
222.一个月后复诊患者自述踝部水肿已全部消失，心悸情况有所好转，身体无其它不适，经检测血压保持也在130/70mmhg。
223.案例二：
224.郭女士，现年63岁，其父母均有高血压史。10年前郭女士因头晕住院被诊断出患有高血压。最严重时血压210/110mmhg。郭女士尝试更换过多种降压药，其中以硝苯地平缓释片和贝那普利为主。去年年初郭女士因心脏不适入院治疗，经检测血压依然超标。鉴于郭女士曾自行使用过多种降压药，但自述没有特别有效的药物，医生建议患者进行药物基因检测以确定不同药物的反应情况。
225.试剂盒检测得到如下结果：
226.根据上面的结果，我们做出如下判读：
227.因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：
228.检测结果表明，郭女士ace为dd基因型，使用贝那普利治疗效果较好，同时dd基因型患者对利尿剂如氢氯噻嗪比较敏感；cyp3a5为突变纯合型，药物代谢速率下降，针对这一情况，医生建议将硝苯地平改换成利尿剂氢氯噻嗪25mg/qd。
229.更换主要使用药物3周后，郭女士复查发现血压控制较好120/70mmhg，也没有再发生心脏不适的情况。
230.以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

技术特征：
1.一种用于指导人高血压用药的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可同时对21个基因位点进行snp分型，所述试剂盒包括用于检测21个基因位点的21对扩增引物，所述21对扩增引物的序列具体如下：基因位点上游扩增引物5
’‑3’
下游扩增引物5
’‑3’
rs4291seq id no.1seq id no.2rs1801253seq id no.3seq id no.4rs5186seq id no.5seq id no.6rs2231142seq id no.7seq id no.8rs4244285seq id no.9seq id no.10rs1057910seq id no.11seq id no.12rs4918758seq id no.13seq id no.14rs1058164seq id no.15seq id no.16rs1065852seq id no.17seq id no.18rs1135840seq id no.19seq id no.20rs28371725seq id no.21seq id no.22rs2740574seq id no.23seq id no.24rs776746seq id no.25seq id no.26rs5443seq id no.27seq id no.28rs688seq id no.29seq id no.30rs4149601seq id no.31seq id no.32rs17650seq id no.33seq id no.34rs2306283seq id no.35seq id no.36rs4149056seq id no.37seq id no.38rs7297610seq id no.39seq id no.40rs4646994seq id no.41seq id no.42。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测除了rs4646994之外的20基因位点的20条延伸引物，所述20条延伸引物的序列具体如下：
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，基因位点rs4646994通过电泳检测，除了rs4646994之外的20基因位点通过飞行时间质谱进行检测。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测时所述21对扩增引物的摩尔浓度如下表所示：扩增5
’‑3’
终浓度seq id no.1，seq id no.2各1
‑
1.2μmseq id no.3，seq id no.4各1
‑
1.2μmseq id no.5，seq id no.6各1
‑
1.2μmseq id no.7，seq id no.8各1
‑
1.2μmseq id no.9，seq id no.10各1
‑
1.2μmseq id no.11，seq id no.12各1
‑
1.2μmseq id no.13，seq id no.14各1
‑
3μmseq id no.15，seq id no.16各1
‑
1.2μmseq id no.17，seq id no.18各1
‑
1.2μmseq id no.19，seq id no.20各1
‑
1.5μmseq id no.21，seq id no.22各1
‑
1.2μmseq id no.23，seq id no.24各1
‑
1.2μmseq id no.25，seq id no.26各1
‑
1.2μmseq id no.27，seq id no.28各1
‑
1.2μm
seq id no.29，seq id no.30各1
‑
1.2μmseq id no.31，seq id no.32各1.5
‑
2.5μmseq id no.33，seq id no.34各1
‑
1.2μmseq id no.35，seq id no.36各2
–
2.5μmseq id no.37，seq id no.38各1
‑
1.2μmseq id no.39，seq id no.40各1
‑
1.2μmseq id no.41，seq id no.42各0.5
‑
0.6μm。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，检测时所述20条延伸引物的摩尔浓度如下表所示：下表所示：6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的多重pcr扩增的反应体系如下：
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的电泳pcr扩增的反应体系如下：8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括iplex延伸反应体系，所述iplex延伸反应体系如下：
技术总结
本发明提供一种用于指导人高血压用药的试剂盒，该试剂盒可同时对21个基因位点进行SNP分型，所述试剂盒包括用于检测21个基因位点的21对扩增引物，所述21对扩增引物的序列如SEQ ID NO.1～42所示。本发明在对大样本进行研究的基础上，提出一种全新的位点组合，实现从基因和遗传的角度对高血压的治疗提供准确的指导和及时的反馈；并且结合飞行时间质谱技术和电泳技术进行基因分型，对精心挑选的和高血压用药最为相关的一些基因和变异位点进行中通量测序，因此可以大大降低检测时间与成本，而且仍然得到高度可靠的检测结果，因此具有非常重要的临床应用价值。有非常重要的临床应用价值。有非常重要的临床应用价值。


技术研发人员：何熲 石忆湘 魏宁 顾孝平 杨军 王保曼 张辉
受保护的技术使用者：上海康黎诊断技术有限公司
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021/6/29