乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法与流程

1.本发明涉及一种微生物限度检查方法，具体地说是一种乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法。


背景技术：

2.乙二胺四乙酸二钠是常用的无菌药品所用原料之一，需对其微生物限度进行检查。根据2020版中国药典<1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法>的要求，供试品检查方法主要有平皿法和薄膜过滤法，其中薄膜过滤法需要供试品能完全溶解于稀释液中，乙二胺四乙酸二钠溶解度较低(约为110g/l)且在室温时溶解较慢，无法满足薄膜过滤法的要求，因此常规检验时一般采用平皿法，平皿法的具体步骤如下：
3.供试液的制备：准确称取10g供试品，加入100ml、ph7.0的无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液，混匀制成稀释度为1:10的供试液；
4.平皿法检查：准确量取1ml供试液转移至直径9cm的无菌平皿中，再加入15～20ml温度不超过45℃融化的tsa或sda培养基，混匀后，在室温下冷却，待培养基凝固后倒置培养。
5.由于乙二胺四乙酸二钠有一定的抑菌活性，在较低的稀释倍数下，平皿法不能有效去除抑菌性，因此无法准确检出微生物的污染。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种能够有效地去除供试品抑菌性、能够有效地检出乙二胺四乙酸二钠的微生物污染、确保检验结果准确的一种乙二胺四乙酸二钠微生物限度检查方法。
7.按照本发明提供的技术方案，所述乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法包括以下步骤：
8.步骤一、准确称取乙二胺四乙酸二钠，加入0.1％(g/g)～1％(g/g)无菌氯化钙溶液中，在35～45℃下加热10～60分钟，充分混匀至完全溶解，制成所需稀释级的供试液；
9.步骤二、准确量取适宜稀释级的供试液至无菌过滤器内，过滤器的数量取决于期望获得用于需氧菌总数计数以及霉菌和酵母菌总数计数的样品数量，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，用无抑菌性的淋洗液淋洗滤膜；过滤完毕，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于tsa培养基与sda培养基表面，一个培养基平皿内只放入一张滤膜，tsa培养基用于需氧菌总数计数，sda培养基用于霉菌和酵母菌总数计数；
10.步骤三、将tsa培养基置于30～35℃、sda培养基置于20～25℃，均倒置培养3～7天，定时观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
11.作为优选，步骤一中，无菌氯化钙的浓度为0.3％(g/g)。
12.作为优选，步骤一中，加热温度控制在40～44℃，加热时间控制在45分钟。
13.作为优选，步骤一中，稀释度控制在1:10。
14.作为优选，步骤二中，所述淋洗液为ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液、0.1％(g/g)无菌蛋白胨水溶液或者ph7.2磷酸盐缓冲液。
15.作为优选，步骤三中，将tsa培养基置于30～35℃下培养5天，将sda培养基置于20～25℃下培养5天。
16.本发明在供试液制备中使用了0.1％(g/g)～1％(g/g)的无菌氯化钙溶液，其中的二价钙离子能够与乙二胺四乙酸二钠进行螯合，作为中和剂可去除乙二胺四乙酸二钠的抑菌性。
17.本发明在供试液制备中增加了35～45℃下加热10～60分钟的步骤是由于乙二胺四乙酸二钠溶解度较低(约为110g/l)且在室温时溶解较慢，通过提高溶解温度(35～45℃)，加速了乙二胺四乙酸二钠的溶解，且冷却后也不会再次析出，从而解决了样品的难以过滤的问题。加热温度未超过45℃，符合2020版中国药典<1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法>中供试液制备的要求，不会产生假阴性结果。
18.本发明采用薄膜过滤法和加入中和剂来(无菌氯化钙溶液)去除乙二胺四乙酸二钠的抑菌性，本发明的方法能够有效检出乙二胺四乙酸二钠中的微生物污染，为该原料的质量控制提供了保障。
具体实施方式
19.下面结合具体验证例对本发明的有效性进行确认。
20.以下验证过程所使用的乙二胺四乙酸二钠由merck/上海广牧贸易有限公司提供。
21.验证例1
22.准确称取10g乙二胺四乙酸二钠，加入100ml、0.3％(g/g)无菌氯化钙溶液中，40～44℃加热45分钟，充分混匀至完全溶解，制成稀释度为1:10的供试液。
23.(1.1)试验组
24.取制备好的上述供试液，无菌分装于试管中，每管9.9ml，分别加入0.1ml的atcc(美国菌种保藏中心)菌种制备的挑战菌液，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面，每种试验微生物平行制备2个培养基。
25.将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
26.(1.2)供试品对照组
27.供试品对照组用于测定乙二胺四乙酸二钠本底中的含菌量。
28.取制备好的上述供试液，无菌分装于试管中，每管9.9ml。分别加入0.1ml的ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，
关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面。
29.将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
30.(1.3)菌液对照组
31.菌液对照组用于测定加入的挑战微生物的含菌量。
32.取ph7.0的无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液无菌分装于试管中，每管9.9ml，分别加入0.1ml的atcc(美国菌种保藏中心)菌种制备的挑战菌液，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面，每种试验微生物平行制备2个培养基。
33.将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
34.(1.4)稀释剂对照组
35.稀释剂对照组用于确认加入的稀释液是否对微生物无毒性。
36.取0.3％(g/g)无菌氯化钙溶液，无菌分装于试管中，每管9.9ml，分别加入0.1ml的atcc(美国菌种保藏中心)菌种制备的挑战菌液，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
‑
蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面，每种试验微生物平行制备2个培养基。
37.将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
38.合格标准
39.实验结果应标明，细菌培养不超过3天、真菌培养不超过5天时，试验组的挑战微生物的回收率在50％～200％范围内。稀释剂对照组的菌回收率在50％～200％范围内。
[0040][0041][0042]
表1.atcc挑战微生物的回收率
[0043]
[0044][0045]
验证例2
[0046]
准确称取10g乙二胺四乙酸二钠，加入100ml、0.3％(g/g)无菌氯化钙溶液中，40～44℃加热45分钟，充分混匀至完全溶解，制成稀释度为1:10的供试液。
[0047]
(2.1)试验组
[0048]
取制备好的供试液，无菌分装于试管中，每管9.9ml。分别加入0.1ml的cmcc(中国医学微生物菌种保藏中心)菌种制备的挑战菌液，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
‑
蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面，每种试验微生物平行制备2个培养基。
[0049]
将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
[0050]
(2.2)供试品对照组
[0051]
供试品对照组用于测定乙二胺四乙酸二钠本底中的含菌量。
[0052]
取制备好的上述供试液，无菌分装于试管中，每管9.9ml。分别加入0.1ml的ph7.0的无菌nacl
‑
蛋白胨缓冲液。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
‑
蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面。
[0053]
将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培
养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
[0054]
(2.3)菌液对照组
[0055]
菌液对照组用于测定加入的挑战微生物的含菌量。
[0056]
取ph7.0的无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液无菌分装于试管中，每管9.9ml，分别加入0.1ml的cmcc(中国医学微生物菌种保藏中心)菌种制备的挑战菌液，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
‑
蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面，每种试验微生物平行制备2个培养基。
[0057]
将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
[0058]
(2.4)稀释剂对照组
[0059]
稀释剂对照组用于确认加入的稀释液是否对微生物无毒性。
[0060]
取0.3％(g/g)无菌氯化钙溶液，无菌分装于试管中，每管9.9ml，分别加入0.1ml的cmcc(中国医学微生物菌种保藏中心)菌种制备的挑战菌液，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取上述混合液全部转移至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，分别用ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液淋洗滤膜2次，每次100ml；滤完，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂(tsa)培养基与沙氏葡萄糖琼脂(sda)培养基表面，每种试验微生物平行制备2个培养基。
[0061]
将tsa培养基置于30～35℃下倒置培养5天，将sda培养基置于20～25℃下倒置培养5天。逐日读数读数观察并点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。
[0062]
合格标准
[0063]
实验结果应标明，细菌培养不超过3天、真菌培养不超过5天时，试验组的挑战微生物的回收率在50％～200％范围内。稀释剂对照组的菌回收率在50％～200％范围内。
[0064][0065][0066]
表2.cmcc挑战微生物的回收率
[0067][0068][0069]
以上验证例1和验证例2的结果显示：稀释剂对照组的菌回收率在83％～126％，在50％～200％范围内，说明无菌氯化钙溶液作为稀释剂对微生物无毒性。试验组的菌回收率在77％～135％，在50％～200％范围内，说明本方法可以有效检出乙二胺四乙酸二钠中的微生物。
[0070]
本发明方法的微生物限度检查方法适用性验证结果合格，可以用该方法进行乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查。

技术特征：
1.一种乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，其特征是该检查方法包括以下步骤：步骤一、准确称取乙二胺四乙酸二钠，加入0.1%(g/g)~1%(g/g)无菌氯化钙溶液中，在35~45℃下加热10~60分钟，充分混匀至完全溶解，制成所需稀释级的供试液；步骤二、准确量取适宜稀释级的供试液至无菌过滤器内，过滤器的数量取决于期望获得用于需氧菌总数计数以及霉菌和酵母菌总数计数的样品数量，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，用无抑菌性的淋洗液淋洗滤膜；过滤完毕，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于tsa培养基与sda培养基表面，一个培养基平皿内只放入一张滤膜，tsa培养基用于需氧菌总数计数，sda培养基用于霉菌和酵母菌总数计数；步骤三、将tsa培养基置于30~35℃、sda培养基置于20~25℃，均倒置培养3~7天，定时观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。2.如权利要求1所述的乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，其特征是：步骤一中，无菌氯化钙的浓度为0.3%(g/g)。3.如权利要求1所述的乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，其特征是：步骤一中，加热温度控制在40~44℃，加热时间控制在45分钟。4.如权利要求1所述的乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，其特征是：步骤一中，稀释度控制在1:10。5.如权利要求1所述的乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，其特征是：步骤二中，所述淋洗液为ph7.0的无菌nacl
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蛋白胨缓冲液、0.1%（g/g）无菌蛋白胨水溶液或者ph7.2磷酸盐缓冲液。6.如权利要求1所述的乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，其特征是：步骤三中，将tsa培养基置于30~35℃下培养5天，将sda培养基置于20~25℃下培养5天。
技术总结
本发明涉及一种乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，包括以下步骤：称取乙二胺四乙酸二钠加入无菌氯化钙溶液中制成供试液；准确量取适宜稀释级的供试液至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤，再用无抑菌性的淋洗液淋洗滤膜；过滤完毕，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于TSA培养基、SDA培养基表面倒置培养，定时观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。本发明采用薄膜过滤法和中和剂来去除乙二胺四乙酸二钠的抑菌性，本发明方法能够有效检出乙二胺四乙酸二钠中的微生物污染，为该原料的质量控制提供了保障。原料的质量控制提供了保障。


技术研发人员：刘佳 孙覃
受保护的技术使用者：费森尤斯卡比华瑞制药有限公司
技术研发日：2021.04.07
技术公布日：2021/6/29