一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗及制备方法与流程

1.本发明涉及一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗及制备方法，用于堆型艾美耳球虫病的预防，本发明还提供了该疫苗的制备方法，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.鸡球虫病（coccidiosis）是一种以侵害肠道上皮细胞为特征的寄生原虫病，分布广泛，在雏鸡中发病率最高，是危害养鸡业的主要寄生虫病之一。目前国际公认危害鸡的艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫（eimeria tenella）、堆型艾美耳球虫（eimeria acervulina）、巨型艾美耳球虫（eimeria maxima）、毒害艾美耳球虫（eimeri anecateix）、和缓艾美耳球虫（eimeria mitis）、早熟艾美耳球虫（eimeria praecox）、和布什艾美耳球虫（eimeria brunetti）。其中堆形艾美耳球虫（eimeria acervulina）是引起鸡球虫病的重要病原之一，主要发生于较大日龄肉用仔鸡和后备母鸡，引起鸡只的增重受阻和产蛋量下降等问题，严重危害养鸡业的经济损失。目前主要防治手段是化学药物和活虫苗，但由于长时间使用化学药物使耐药性问题凸显，人们将防治球虫病的重点转为免疫预防。因此研制新型高效的抗球虫疫苗对养鸡业的健康发展至关重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗及制备方法。
4.本发明的另一目的是提供该堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的制备方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现:根据堆型艾美耳球虫保护性抗原csz1基因序列，利用primer5.0设计引物，扩增csz1基因，pcr鉴定正确后回收目的片段，将目的基因与表达载体ppiczαa连接。构建的重组质粒进行pcr和双酶切鉴定及测序，测序正确的重组质粒进行诱导表达，利用 western bloting 进行分析，获得堆型艾美耳球虫重组酵母蛋白疫苗。
5.本发明所述的一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的制备方法，步骤如下：1、重组酵母蛋白疫苗ppiczαa
‑
csz1的制备首先提取堆型艾美耳球虫总rna，并反转录为cdna，通过pcr法扩增csz1基因，连接至 pmd18
‑
t，并在 dh5α 克隆，通过测序及酶切鉴定，目的片段大小为522bp。将重组质粒 pmd18
‑
t
‑
csz1与表达载体ppiczαa同时双酶切并用 t4 dna 连接酶连接，转化至感受态细胞dh5α中，挑取阳性克隆进行pcr检测、质粒双酶切和测序，构建重组表达载体ppiczαa
‑
csz1，将重组质粒ppiczαa
‑
csz1线性化，电转化至酵母细胞gs115中进行诱导表达，并对表达产物进行western blot分析鉴定，制备堆型艾美耳球虫重组酵母蛋白疫苗。
6.2、疫苗免疫效果检测纯化ppiczαa
‑
csz1诱导表达蛋白，以 20μg/只、40μg /只、60μg /只的剂量通过腿部肌肉注射免疫，并同时红、白对照组，二免一周后进行攻虫试验，每只鸡攻 1
×
10
4 堆型艾美耳球虫孢子化卵囊，28日龄剖杀，利用保护率、相对增重率、opg、aci等指标进行综合评价
重组酵母蛋白疫苗的保护效果。二次免疫结束后对鸡血清抗体水平和t淋巴细胞增殖情况进行检测。结果表明重组酵母蛋白疫苗ppiczαa
‑
csz1免疫雏鸡后能诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，与对照组相比，可以产生更高水平的抗体。二次免疫后进行攻虫试验，结果发现免疫组与对照组相比，卵囊数减少，体重增加，十二指肠病变减轻，各项指标均明显优于对照组。经过综合评价红对照组aci值为130.5，重组酵母蛋白疫苗ppiczαa
‑
csz1低剂量免疫组、ppiczαa
‑
csz1中剂量免疫组、ppiczαa
‑
csz1高剂量免疫组的aci分别为171.25、176.42、174.33，显示出较好的保护性效果。
7.本发明的积极效果在于：基于毕赤酵母表达系统制备的重组堆型艾美耳球虫蛋白能高效表达目的基因；本发明csz1基因编码的蛋白具有良好的免疫原性，能减轻堆型艾美耳球虫攻击后的病变程度。通过检测鸡血清抗体水平和t淋巴细胞增殖情况，结果重组酵母蛋白组相比对照组有明显上升。这种利用酵母作为表达载体的蛋白疫苗的研制具有较好的应用前景，可用于堆型艾美耳球虫病的预防。
附图说明
8.图1为本发明扩增克隆出的 csz1 基因；图2为本发明重组质粒 ppiczαa
‑
csz1 双酶切鉴定；图3为本发明重组菌株 gs115
‑
ppiczαa
‑
csz1 pcr鉴定；图4为本发明重组蛋白ppiczαa
‑
csz1的western blotting分析；图5为本发明鸡血清中抗体水平的变化；图6为本发明t淋巴细胞增殖情况。
具体实施方式
9.通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
10.用于重组酵母蛋白ppiczαa
‑
csz1的制备以堆型艾美耳球虫保护性抗原csz1基因为例，进行表达载体的构建。
11.实施例11、csz1基因的克隆根据genbank csz1基因序列和克隆载体pmd18
‑
t、表达载体ppiczαa的多克隆位点序列，应用 primer 5.0 软件设计引物：csz1
‑
f:5
’‑
gaattcatgggtgaagaggctgatactca
‑3’
；csz1
‑
r:5
’‑
gtcgacttagaagccgccctggtaca
‑3’
；用于csz1基因的扩增；将扩增克隆出的目的基因csz1（图1）胶回收目的基因后与pmd18
‑
t载体，将目的基因csz1与酵母载体ppiczαa相连，并进行酶切及测序鉴定（图2），连接产物电转化至gs115感受态细胞，将经sac i酶切线性化的质粒5μg与80 μl酵母感受态，轻柔混匀；冰浴10min后移入冰冷的电转杯中，利用电转仪电击后，加入600 μl冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5 ml的 ep管中，30℃静置培养1 h；将菌体悬液涂布于含100 μg.ml
‑
1 zeocin的 ypd平板
上，取100 μl涂布到平板上；平板在28
‑
30℃条件下培养2
‑
3d至有转化子出现；筛选出阳性单克隆菌落，并提取酵母质粒，双酶切鉴定后1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物；用ecor i、sal i进行双酶切反应，重组质粒命名为ppiczαa
‑
csz1,并通过pcr进行验证（如图3所示）。
12.2、重组质粒 ppiczαa
‑
csz1 的表达将pcr鉴定正确的菌液加入5 ml ypd液体培养基中30 ℃ 200 r/min,培养24 h。取500 μl加入50 ml bmgy培养基中，30 ℃ 220 r/min,培养24 h，直至od值 >5，5000 r/min离心菌液 5 min；1 ml bmmy液体培养基重悬菌体沉淀，加入到 100 ml bmmy液体培养基中30 ℃ 220 r/min继续培养，每隔24 h加入1 ml 100％甲醇进行诱导，直至144 h，加入甲醇前各取1 ml菌液离心，收集上清液，western blot方法检测目的蛋白（图4）。
13.3、重组蛋白的纯化将鉴定为阳性的酵母菌落摇瓶培养与 1l bmgy中，24小时收集菌体转移至1l的bmmy中，培养条件同前，5000 r/min离心收集第5天上清。将上清转移至大的容器中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵(472g
·
l
‑1)，至硫酸铵完全溶解后，将其置于4℃过夜充分沉降蛋白，将硫酸铵沉淀的上清进行8000r，30min离心，获得的沉淀用1
×
pbs重新溶解后装透析袋透析隔4h、8h分别换一次透析液确保透析充分；透析完的蛋白经镍柱纯化得到目的蛋白csz1。测量蛋白浓度后标记，
‑
20 ℃备用。
14.试验例1以下实验表明本发明用于堆型艾美耳球虫的重组酵母蛋白疫苗ppiczαa
‑
csz1保护效果研究在严格消毒无球虫环境下，饲养150只1日龄雏鸡，饲养至6日龄，随机分为5组，每组30只。分别为ppiczαa
‑
csz1低剂量免疫（a）组、ppiczαa
‑
csz1中剂量免疫（b）组、ppiczαa
‑
csz1高剂量免疫（c）组、红对照（d）组、白对照（e）组并标记翅号，免疫组均进行肌肉注射，免疫组分别进行二次免疫，7 day第一次免疫，14 day第二次免疫， 21 day 以 e.acervulina 孢子化卵囊1
×
10
4 个/只进行攻虫，白对照组接种pbs，28日龄剖杀，每次免疫前与攻虫前每组随机选5只鸡进行心脏采血并收集血清，
‑
20 ℃保存备用（分组见表1）。
15.表1 动物分组及免疫程序组别7day14day21day攻虫ppiczαa
‑
csz1低剂量免疫（a）组20μg/只20μg/只1
×
104个/只ppiczαa
‑
csz1中剂量免疫（b）组40μg/只40μg/只1
×
104个/只ppiczαa
‑
csz1高剂量免疫（c）组60μg/只60μg/只1
×
104个/只红对照（d）组pbspbs1
×
104个／只白对照（e）组pbspbspbs1、免疫保护效果观察攻虫后第4天起d组逐步表现出不同程度的食欲下降、腹泻、精神不振、羽毛松立等症状，其余各组精神状态良好，食欲正常，均未见明显的临床症状。其他指标结果见表2。由表2可以看出增重情况：b组相对增重率最高，其次是a、c免疫组，b免疫组大于a、c组，变化不明显（p＜0.05）。从表2可以看出opg情况：a、b、c免疫组卵囊减少率较红对照组变化明显（p＜0.01）。十二指肠病变记分（表2）：每组鸡只口服1
×
10
4 个孢子化卵囊后，a、b、c免疫组十
二指肠病变计分明显小于红对照组（p＜0.05）。a免疫组十二指肠病变记分大于b、c免疫组，变化不明显（p＞0.05）。
16.表2 重组ppiczαa
‑
csz1抗e.acervulina的保护效果aci，由存活率、增重、卵囊值等计算各免疫组和对照组计算aci。从表3可以看出：a、b、c免疫组aci 为171.25、176.42、174.33，保护效果良好。b免疫组相比于a、c免疫组保护效果更好。
17.表3 重组ppiczαa
‑
csz1抗e.acervulina的抗球虫指数2、鸡体的免疫应答
在二次免疫之前和攻虫前每组随机选取5只鸡进行采血，攻虫后7天取脾脏。用于以下血清中的抗体水平和t淋巴细胞增殖情况检测：抗体水平检测：利用间接 elisa 法检测各阶段每组鸡血清抗体水平的变化。以堆型艾美耳球虫全虫蛋白作为抗原包被酶标板，感染鸡球虫鸡只的阳性血清和健康鸡血清分别作阳性、阴性对照。每孔100 μl包被过夜，每孔加入 200μl pbst洗涤三次，每次5 min；随后每孔加入200 μl 封闭液37℃封闭2h，洗涤，将待测血清和对照组血清分别加入，每孔100 μl，进行3组平行试验。37℃孵育1 h，洗涤，滤纸拍干后，每孔加入100 μl tmb显色液37℃避光30min后，每孔加入100 μl终止液10 min，测od 490 nm处吸光值。结果表明，a、b、c免疫组随着免疫次数的增加，抗体水平升高极显著（p＜0.01）（图5所示）。
18.t淋巴细胞增殖试验：攻虫后7天取脾脏淋巴细胞，用ckk
‑
8法检测各组t淋巴细胞增殖情况。结果表明a、b、c免疫组t淋巴细胞增殖水平较白对照组相比差异极显著（p＜0.01）（图6所示）。

技术特征：
1.一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗，其特征在于：根据堆型艾美耳球虫保护性抗原csz1基因序列，利用primer5.0设计引物，扩增csz1基因，pcr鉴定正确后回收目的片段，将目的基因与表达载体ppiczαa连接；构建的重组质粒进行pcr和双酶切鉴定及测序，测序正确的重组质粒进行诱导表达，利用 western bloting 进行分析，获得堆型艾美耳球虫重组酵母蛋白疫苗。2.如权利要求1所述的一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）csz1基因的克隆根据genbank csz1基因序列和克隆载体pmd18
‑
t、表达载体ppiczαa的多克隆位点序列，应用 primer 5.0 软件设计引物：csz1
‑
f:5
’‑
gaattcatgggtgaagaggctgatactca
‑3’
；csz1
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r:5
’‑
gtcgacttagaagccgccctggtaca
‑3’
；用于csz1基因的扩增；将扩增克隆出的目的基因csz1胶回收目的基因后与pmd18
‑
t载体，将目的基因csz1与酵母载体ppiczαa相连，并进行酶切及测序鉴定，连接产物电转化至gs115感受态细胞，将经sac i酶切线性化的质粒5μg与80 μl酵母感受态，轻柔混匀；冰浴10min后移入冰冷的电转杯中，利用电转仪电击后，加入600 μl冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5 ml的 ep管中，30℃静置培养1 h；将菌体悬液涂布于含100 μg.ml
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1 zeocin的 ypd平板上，取100 μl涂布到平板上；平板在28
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30℃条件下培养2
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3d至有转化子出现；筛选出阳性单克隆菌落，并提取酵母质粒，双酶切鉴定后1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物；用ecor i、sal i进行双酶切反应，重组质粒命名为ppiczαa
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csz1,并通过pcr进行验证；2）重组质粒 ppiczαa
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csz1 的表达将pcr鉴定正确的菌液加入5 ml ypd液体培养基中30 ℃ 200 r/min,培养24 h；取500 μl加入50 ml bmgy培养基中，30 ℃ 220 r/min,培养24 h，直至od值 >5，5000 r/min离心菌液 5 min；1 ml bmmy液体培养基重悬菌体沉淀，加入到 100 ml bmmy液体培养基中30 ℃ 220 r/min继续培养，每隔24 h加入1 ml 100％甲醇进行诱导，直至144 h，加入甲醇前各取1 ml菌液离心，收集上清液，western blot方法检测目的蛋白；3）重组蛋白的纯化将鉴定为阳性的酵母菌落摇瓶培养与 1l bmgy中，24小时收集菌体转移至1l的bmmy中，培养条件同前，5000 r/min离心收集第5天上清；将上清转移至大的容器中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵(472g
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l
‑1)，至硫酸铵完全溶解后，将其置于4℃过夜充分沉降蛋白，将硫酸铵沉淀的上清进行8000r，30min离心，获得的沉淀用1
×
pbs重新溶解后装透析袋透析隔4h、8h分别换一次透析液确保透析充分；透析完的蛋白经镍柱纯化得到目的蛋白csz1。
技术总结
本发明涉及一种堆型艾美耳球虫重组亚单位疫苗及制备方法，根据堆型艾美耳球虫保护性抗原cSZ1基因序列，利用primer5.0设计引物，扩增cSZ1基因，PCR鉴定正确后回收目的片段，将目的基因与表达载体pPICZαA连接。构建的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定及测序，测序正确的重组质粒进行诱导表达，利用Western bloting进行分析，获得堆型艾美耳球虫重组酵母蛋白疫苗；利用酵母作为表达载体的蛋白疫苗的研制具有较好的应用前景，可用于堆型艾美耳球虫病的预防。预防。


技术研发人员：宫鹏涛 毕天奇 张西臣 李建华 张楠 王晓岑 李新 马赫然 杨举
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29