鉴定水稻粒长QTLqGL5-27.3上长粒等位基因的特异性DNA标记及其应用的制作方法

鉴定水稻粒长qtl qgl5
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27.3上长粒等位基因的特异性dna标记及其应用
技术领域
1.本发明属于水稻粒形改良的遗传育种领域，涉及控制水稻谷粒长度qtl的定位、长粒等位基因的鉴定和粒形改良的育种应用。


背景技术：

2.水稻粒形由粒长、粒宽及长宽比共同决定，其中粒长和粒宽还直接影响粒重，对水稻产量形成具有重要作用。我国是全球最大的稻米生产和消费国之一，60％以上的人口以米饭为主食，不同地区的居民对大米的喜好也因地而异。一般而言，南方人习惯吃细长形的籼米，北方人习惯吃短圆形的粳米，因此，粒形也是一个重要的商业指标。
3.粒重和粒形是典型的数量性状座位(qtl)，由少数主效位点和大量微效位点共同控制。分离和克隆控制粒重和粒形的qtl对水稻粒形的遗传改良具有重要意义。目前已有21个控制水稻粒重和粒形的qtl被克隆，且大部分qtl已在现代栽培稻品种中广泛应用，在水稻粒形改良育种中发挥了重要作用。进一步挖掘新的控制粒形的qtl，将为水稻粒形改良提供新的基因。
4.应用分子标记辅助选择技术能将目标有利等位基因转育至待改良的水稻品种中，开发与目标qtl共分离的特异性dna标记是分子标记辅助选择育种技术的核心。专利权人从特青和 irbb52衍生群体中鉴定到一个新的控制粒长的qtl qgl5
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27.3，在该座位上，irbb52等位基因可以增加谷粒长度。基于此，专利权人针对该qtl开发了一个用于检测qgl5
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27.3上irbb52 长粒等位基因的特异性dna标记，可用于水稻品种的粒形改良。


技术实现要素：

5.本发明解决的技术问题：提供1个用于检测水稻粒长qtl qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的特异性dna标记，及其在分子标记辅助选择育种中的应用。
6.本发明采用以下技术方案：
7.针对粒长qtl qgl5
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27.3所在区间，比对特青和irbb52的序列，开发1个用于检测 qgl5
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27.3座位上irbb52长粒等位基因的dna标记，命名为fiv274385，特征在于其引物：
8.fiv274385
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f：5'
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cgcgacggaaatgatcaagc
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3'，如序列表seq id no:1所示；
9.fiv274385
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r：5'
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ggaggagagagcaaccaacc
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3'，如序列表seq id no.2所示。
10.该标记鉴定qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的方法如下：
11.(1)以待测水稻材料和对照irbb52的基因组dna为模板，应用fiv274385进行pcr扩增，pcr反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环，72℃终延伸2分钟，4℃保存；
12.(2)扩增产物采用6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后银染显色；
13.(3)当待测样品的扩增产物片段大小与irbb52的片段大小一致时，表明待测样品携带 qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因。
附图说明
14.图1特异性dna标记fiv274385的电泳检测结果
15.m：dna分子量标准；p1：irbb52(长粒等位基因)；p2：特青(短粒等位基因)；1
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36: 待鉴定株系
具体实施方式
16.实施例：应用特异性dna标记检测qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因
17.根据qgl5
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27.3在特青和irbb52基因组中的位置，测定了特青和irbb52的基因组序列，根据两者序列差异开发了可用于检测qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的特异性dna标记 fiv274385。应用该标记对待测水稻品种是否携带qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因进行检测。
18.将36份衍生于特青/irbb52组合且在qgl5
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27.3座位上呈分离的近等基因系，于2019 年种植于中国水稻研究所杭州试验基地，每份材料种植两重复，每重复8株。每个株系取中间6个单株的叶片，参照zheng等(1995)的方法提取dna。
19.参考chen等(1997)的方法，应用特异性dna标记fiv274385对待测株系以及对照irbb52 和特青的dna进行pcr扩增，pcr反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环，72℃终延伸2分钟，4℃保存。扩增产物采用6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，结束后采用银染显示。
20.所有株系成熟后，除去两个边株，混收中间5个单株，晒干后脱粒，通过盐水浸泡漂洗筛选饱粒，具体操作简要如下：将约30g实粒浸入3.5mol/l的nacl溶液，搅拌后待饱粒沉至底部，去除漂浮瘪粒后收集饱粒，用清水洗净沥干后置于37℃的烘箱，约16h后取出冷却至室温，称取约15g饱粒，平均分成2份，应用万深sc
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g自动种子考种分析仪考查粒长。
21.检测的36个株系中，有18个株系的扩增产物片段大小与irbb52一致，代表这些株系在 qgl5
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27.3上携带irbb52长粒型等位基因，18个株系的扩增产物片段大小与irbb52不同，代表这些株系不携带irbb52等位基因(图1)。通过方差分析，两种等位基因型株系间的粒长存在极显著差异(p＝0.0002)，在qgl5
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27.3上携带irbb52长粒型等位基因的株系增加粒长约0.050mm。该结果表明，专利权人提供的分子标记fiv274385能够准确鉴定qgl5
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27.3 上irbb52长粒等位基因，可应用于qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的分子标记辅助选择育种。
22.参考文献
23.1.zheng kl,et al.pcr
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based marker
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assisted selection in rice breeding:irri discussion paper series no.12.los banos:international rice research institute,1995.
24.2.chen x,et al.development of a microsatellite framework map providing genome
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wide coverage in rice(oryza sativa l.).theor appl genet,1997,95:553
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567。

技术特征：
1.鉴定水稻粒长qtl qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的特异性dna标记fiv274385，其特征在于引物序列：fiv274385
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f：5'
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cgcgacggaaatgatcaagc
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3'，所述核苷酸序列为seq id no:1所示的核苷酸序列；fiv274385
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r：5'
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ggaggagagagcaaccaacc
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3'，所述核苷酸序列为seq id no:2所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述dna标记在鉴定粒长qtl qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的应用。3.应用权利要求1所述dna标记鉴定粒长qtl qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因的方法，其特征在于以下步骤：(1)以待测水稻材料和对照irbb52的基因组dna为模板，应用权利要求1所述dna标记fiv274385进行pcr扩增，pcr反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环，72℃终延伸2分钟，4℃保存；(2)扩增产物采用6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后银染显色；(3)当待测样品的扩增产物片段大小与irbb52的片段大小一致时，表明待测样品携带qgl5
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27.3上irbb52长粒等位基因。
技术总结
本发明提供了一个用于鉴定水稻粒长QTL qGL5


技术研发人员：朱玉君 牛小军 庄杰云 樊叶杨 张振华 黄得润
受保护的技术使用者：中国水稻研究所
技术研发日：2021.04.07
技术公布日：2021/6/29