一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体为一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法。


背景技术：

2.胎儿纤维连接蛋白ffn是人体20余种纤维连接蛋白的一种，孕妇血循环及羊水中富含ffn，它是由蜕膜和绒毛之间的细胞外基质产生的复合物，可能与受精卵的种植及胎盘与蜕膜间的粘附有关。当绒毛膜与蜕膜融合完毕(约20周)后ffn很少测到或在50ug/l以下，近足月时升高。若孕20
‑
37周宫颈阴道分泌物ffn≥50ug/l，则早产可能性较大。同时ffn也是某些肿瘤早期标志物之一。为更好的检测ffn，在此利用盐析、亲和层析、凝胶过滤层析等方法开发出一种工艺用于提取天然来源的ffn，并将其作为后期制备单抗的免疫原。


技术实现要素：

3.为了更好的检测ffn，本发明提供一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法。
4.本发明一种胎儿纤维连接蛋白在制备过程中使用到的纤维连接蛋白来源于人脐带血，制备出的蛋白为天然蛋白，具有更好的免疫原性；本发明提取出的纤维连接蛋白纯度与收率更高；本发明所使用到的纯化方法有效的保持了目的蛋白的结构和功能。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：
7.步骤s1、原料的粗处理：
8.(1)将孕妇脐带血在30
‑
35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；
9.(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；
10.步骤s2、盐析：
11.(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，以2000
‑
3000rpm的转速离心5
‑
10min，离心温度为3
‑
5℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；
12.(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，以3000
‑
5000rpm的转速离心5
‑
10min，离心温度为3
‑
5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；
13.(3)将收集的沉淀加入10mmpbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；
14.步骤s3、亲和层析：
15.(1)将制得的样品与明胶按照2∶5
‑
10的体积比混合，之后在30
‑
35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；
16.(2)之后通过含有2.5murea的10mmpbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。
17.步骤s4、凝胶过滤层析：
18.(1)将sephacryl s
‑
300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后
除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
‑
300凝胶，之后将sephacryl s
‑
300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；
19.(2)使用含有2.5murea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；
20.(3)洗脱结束后分管收集并电泳，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。
21.进一步地，所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。
22.进一步地，步骤s4中所述电泳的条件为：在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20
‑
25ma，控制电泳时间为2h。
23.进一步地，步骤s2中(1)中控制体系的饱和度为20％，(2)中控制体系的饱和度为50％。
24.本发明的有益效果：
25.(1)本发明一种胎儿纤维连接蛋白在制备过程中使用到的纤维连接蛋白来源于人脐带血，制备出的蛋白为天然蛋白，具有更好的免疫原性；
26.(2)本发明提取出的纤维连接蛋白纯度与收率更高；
27.(3)本发明所使用到的纯化方法有效的保持了目的蛋白的结构和功能。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：
31.步骤s1、原料的粗处理：
32.(1)将孕妇脐带血在35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；
33.(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；
34.步骤s2、盐析：
35.(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20％，以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；
36.(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为50％以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；
37.(3)将收集的沉淀加入10mmpbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；
38.步骤s3、亲和层析：
39.(1)将制得的样品与明胶按照2∶5的体积比混合，之后在35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；
40.(2)之后通过含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。
41.步骤s4、凝胶过滤层析：
42.(1)将sephacryl s
‑
300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
‑
300凝胶，之后将sephacryl s
‑
300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；
43.(2)使用含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；
44.(3)洗脱结束后分管收集并电泳，在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20ma，控制电泳时间为2h，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。
45.所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。
46.实施例2
47.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：
48.步骤s1、原料的粗处理：
49.(1)将孕妇脐带血在35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；
50.(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；
51.步骤s2、盐析：
52.(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20％，以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；
53.(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为50％以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；
54.(3)将收集的沉淀加入10mm pbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；
55.步骤s3、亲和层析：
56.(1)将制得的样品与明胶按照2∶6的体积比混合，之后在35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；
57.(2)之后通过含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。
58.步骤s4、凝胶过滤层析：
59.(1)将sephacryl s
‑
300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
‑
300凝胶，之后将sephacryl s
‑
300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；
60.(2)使用含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；
61.(3)洗脱结束后分管收集并电泳，在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20ma，控制电泳时间为2h，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。
62.所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。
63.实施例3
64.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：
65.步骤s1、原料的粗处理：
66.(1)将孕妇脐带血在35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；
67.(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；
68.步骤s2、盐析：
69.(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20％，以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；
70.(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为50％以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；
71.(3)将收集的沉淀加入10mm pbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；
72.步骤s3、亲和层析：
73.(1)将制得的样品与明胶按照2∶8的体积比混合，之后在35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；
74.(2)之后通过含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。
75.步骤s4、凝胶过滤层析：
76.(1)将sephacryl s
‑
300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
‑
300凝胶，之后将sephacryl s
‑
300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；
77.(2)使用含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；
78.(3)洗脱结束后分管收集并电泳，在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20ma，控制电泳时间为2h，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。
79.所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。
80.实施例4
81.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：
82.步骤s1、原料的粗处理：
83.(1)将孕妇脐带血在35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；
84.(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；
85.步骤s2、盐析：
86.(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20％，以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；
87.(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为50％以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；
88.(3)将收集的沉淀加入10mm pbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；
89.步骤s3、亲和层析：
90.(1)将制得的样品与明胶按照2∶9的体积比混合，之后在35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；
91.(2)之后通过含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。
92.步骤s4、凝胶过滤层析：
93.(1)将sephacryl s
‑
300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
‑
300凝胶，之后将sephacryl s
‑
300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；
94.(2)使用含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；
95.(3)洗脱结束后分管收集并电泳，在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20ma，控制电泳时间为2h，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。
96.所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。
97.实施例5
98.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：
99.步骤s1、原料的粗处理：
100.(1)将孕妇脐带血在35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；
101.(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；
102.步骤s2、盐析：
103.(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为20％，以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；
104.(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，直至体系的饱和度为50％以3000rpm的转速离心5min，离心温度为4℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；
105.(3)将收集的沉淀加入10mm pbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；
106.步骤s3、亲和层析：
107.(1)将制得的样品与明胶按照2∶10的体积比混合，之后在35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；
108.(2)之后通过含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。
109.步骤s4、凝胶过滤层析：
110.(1)将sephacryl s
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300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
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300凝胶，之后将sephacryl s
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300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；
111.(2)使用含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；
112.(3)洗脱结束后分管收集并电泳，在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20ma，控制电泳时间为2h，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。
113.所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。
114.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
115.以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1、原料的粗处理：(1)将孕妇脐带血在30
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35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；步骤s2、盐析：(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，以2000
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3000rpm的转速离心5
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10min，离心温度为3
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5℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，以3000
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5000rpm的转速离心5
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10min，离心温度为3
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5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；(3)将收集的沉淀加入10mmpbs缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在pbs缓冲液中透析，制得样品；步骤s3、亲和层析：(1)将制得的样品与明胶按照2∶5
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10的体积比混合，之后在30
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35℃下孵育1h，孵育结束后用pbs缓冲液洗涤三次；(2)之后通过含有2.5murea的10mmpbs缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。步骤s4、凝胶过滤层析：(1)将sephacryl s
‑
300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的sephacryl s
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300凝胶，之后将sephacryl s
‑
300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；(2)使用含有2.5m urea的10mm pbs缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1ml/min；(3)洗脱结束后分管收集并电泳，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mm pbs缓冲液透析并冷冻保存。2.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，所述pbs缓冲液的ph7.2，该pbs缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/l的磷酸二氢钾溶液50ml和浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液35ml混合，加入新沸过的冷水稀释至200ml，混合均匀，制得pbs缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述电泳的条件为：在恒流条件下，控制最大电压为300v，分离胶内电流为10ma，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20
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25ma，控制电泳时间为2h。4.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，步骤s2中(1)中控制体系的饱和度为20％，(2)中控制体系的饱和度为50％。
技术总结
本发明公开一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤S1、原料的粗处理；步骤S2、盐析；步骤S3、亲和层析；(1)将制得的样品与明胶按照2∶5


技术研发人员：缪连军 赵杰 张磊
受保护的技术使用者：安徽环球基因科技有限公司
技术研发日：2021.02.26
技术公布日：2021/6/29