StCAD7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用的制作方法

stcad7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用
技术领域
1.本发明属于农业抗病作物品系培育或生产技术领域，特别是涉及stcad7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用。


背景技术：

2.马铃薯是世界上第四大粮食作物，其种植面积和产量仅次于水稻、小麦和玉米。由致病疫霉菌引起的晚疫病是马铃薯生产过程中主要病害，世界各国视其为最严重的农作物病害。据统计，在干旱地区晚疫病可造成马铃薯减产10％～20％；在潮湿地区，马铃薯则会减产80％左右，甚至导致马铃薯绝收，晚疫病导致马铃薯产量和质量严重下降。与其他作物病害的防治一样，培育和利用抗病品种抵抗作物病害是目前防控马铃薯晚疫病最为经济有效的途径。然而由于晚疫病菌的毒性变异，品种抗病性丧失等问题十分突出，严重威胁马铃薯的可持续生产。鉴于此，探索新型的作物抗病途径、鉴定新型的抗病基因资源具有重要的意义。
3.在植物与病原菌互作过程中，往往有一些基因响应于病原菌的诱导而上调表达，从而促进病原菌对植物的侵染，这些上调表达的基因被称为植物免疫负调控因子。如果将免疫负调控因子突变或者缺失，便会抑制病原菌对植物的侵染，即植物获得抗病性，且该种抗病性具有广谱性。尽管目前已鉴定出植物的免疫负调控因子，但针对致病疫霉菌的抗性基因的研究仍然较少，而且免疫负调控因子在抗病育种中的应用更是屈指可数。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了stcad7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用。本发明提供的技术方案中stcad7基因是一个新型的负调因子，能够有效起到负调控马铃薯晚疫病抗性，为培育抗晚疫病的马铃薯品种提供依据。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了一种负调控植物免疫的基因stcad7，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明还提供了一种负调控植物免疫的基因stcad7编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
8.本发明还提供了上述基因或上述蛋白在选育抗晚疫病植物品种中的应用。
9.本发明还提供了上述基因或上述蛋白在提高植物晚疫病抗性中的应用。
10.本发明还提供了一种通过抑制或阻断上述蛋白在细胞核定位提高植物晚疫病抗性中的应用。
11.本发明还提供了一种通过抑制马铃薯stcad7的zn1结构域、zn2结构域和/或nadph结构域功能或使得马铃薯stcad7的zn1结构域、zn2结构域和/或nadph结构域功能缺失来提高植物晚疫病抗性中的应用。
12.优选的，所述植物包括马铃薯。
13.本发明提供了负调控植物免疫的基因stcad7，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。本发明所述基因stcad7促进了晚疫病菌对植物的侵染，stcad7基因编码的蛋白的三个保守结构域是起到免疫功能所必需的，能够起到负调控晚疫病菌的抗性。由实施例可知，在接种致病疫霉菌后马铃薯叶片中的stcad7基因响应晚疫病菌的诱导而上调表达；通过农杆菌介导的瞬时表达体系在马铃薯上瞬时过表达stcad7基因，证明了stcad7基因促进了晚疫病菌对植物的侵染；马铃薯stcad7蛋白的三个保守结构域是其免疫功能所必需的；构建stcad7不同亚细胞定位的融合蛋白载体，证明马铃薯stcad7基因负调控免疫依赖于细胞核定位，证明了stcad7基因作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的用途，可用于抗晚疫病品种的选育。
附图说明
14.图1为实施例1中马铃薯叶片中stcad7基因在接种致病疫霉菌后的表达情况；
15.图2为实施例2提供的pkannibal载体的图谱；
16.图3为实施例2提供的part27载体的图谱；
17.图4为实施例2提供的马铃薯stcad7过表达促进致病疫霉菌的侵染；
18.图5为实施例3提供的中m1、m2和m3的示意图；
19.图6为实施例3提供的过表达m1::myc、m2::myc和m3::myc对致病疫霉菌在马铃薯中的定殖无影响；
20.图7为实施例4提供的gfp融合表达载体nls7::gfp、nes7::gfp和myr7::gfp的激光共聚焦图。
具体实施方式
21.本发明提供了一种负调控植物免疫的基因stcad7，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1所示：
22.atggaaaaaacacatgaaaatgttgaggcatttggatgggcagctagagatacttctggggtactttctcctttcaacttctcaagaagggtgactggtgaaaaagatgtgcaattcaaagttatgtattgtggaatttgtcattctgatcttcatcaactcaagaatgaatggagcaatagtatatatccaatggtaccagggcatgaagttgttggtgtagtaactgaagttggtagcaaagtcgagaaattcaaaattggtgacaaagttggtgttggatgtttagtaggatcatgtagaaaatgtgaaaattgtgacaacgatcttgaaaattactgtcgcgatcagatcatgacatacaatggtgtttacaccgatggaatccccacgtatggtggttactccgatataatggtaaccaacgagcactacgtggtccattggcccgaaaatttaccaatggaagcagcttccctgttatgtgcagggatcacaacttatagtccattgagatattttggacttgacaagcctggaatgcacattggtgttgttggtctaggtggtttgggacatatggctgtgaaatttgctaaggcgttcggaaccaaagttactgtgataagtacatctgttagtaagaaagacgaagcaattgatcgtttaggggcagactcgtttttggtcagtcgtgatcctgaccaaatgcagggtgcagcggggtcactagatggcatcatcgatactgtatccgcgattcatcctcttcttccattgattaatttgttgaaaactcatgggaagcttgtgatggttggtgcccctgaaaaaccactagagttacctgtatttcccctgcttttaggaaggaagctagtggcggggagcgcgataggagggatgaaggagacacaagagatggtagatttcgcggcaaagcataacataacaccagatgttgaagttgtgccaatggactatgtgaataaagcgttggaacgccttttgaaatcggatgtgaagtatcgttttgtgcttgacattggaaacacg
ttgaacaagaat。
23.本发明所述stcad7基因能够负调控植物免疫，stcad7基因的过表达能够增强致病疫霉菌对植物的感病性，负调控stcad7基因能够为培育抗晚疫病的马铃薯品种提供依据。
24.本发明还提供了一种负调控植物免疫的基因stcad7编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示：
25.mekthenvkafgwaardtfgvlspfnfsrrvtgekdvqfkvvycgichtdlhqlknewsnsiypmvpghevvgvvteigtkvekfkigdkvgvgglvescrkcencdndlenycrdqimtyngvytdgtttyggysdimvtnehyvvhwpenlpmeaapllcagitiysplkyfgldkpgmhigvvglgglghmavkfakvfgtkvtvistslskkdeaiehlgadsflvsrdpdqmqgaagsldgiidtvsvihpllplinllktrgklamlgapekplelpvfplllgrklvagsfiggmketqemvdfaakhsitpdvevvpmdyvntaferllksnvkyrfvldigntlnkn。
26.本发明提供了上述基因或上述蛋白在选育抗晚疫病植物品种中的应用。在本发明中，所述植物优选包括马铃薯。
27.本发明提供了上述基因或上述蛋白在提高植物晚疫病抗性中的应用。在本发明中，所述植物优选包括马铃薯。
28.本发明提供了一种通过抑制或阻断上述蛋白在细胞核定位提高植物晚疫病抗性中的应用。在本发明具体实施例中，构建stcad7不同亚细胞定位的融合蛋白载体，说明马铃薯stcad7基因负调控免疫依赖于细胞核定位，证明了stcad7基因作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的用途，可用于抗晚疫病品种的选育。在本发明中，所述植物优选包括马铃薯。
29.本发明提供了一种通过抑制马铃薯stcad7的zn1结构域、zn2结构域和/或nadph结构域功能或使得马铃薯stcad7的zn1结构域、zn2结构域和/或nadph结构域功能缺失来提高植物晚疫病抗性中的应用。在本发明具体实施例中，马铃薯stcad7蛋白的三个保守结构域是其免疫功能所必需的。在本发明中，所述植物优选包括马铃薯。
30.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的stcad7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
31.实施例1
32.在接种致病疫霉菌后马铃薯叶片中基因stcad7的表达情况，
33.包括以下步骤：
34.步骤一：获取植物材料，分别在大西洋品种马铃薯叶上接种致病疫霉菌，接种0h、3h、6h、24h、48h和72h后收取马铃薯叶片；
35.步骤二：rna的抽提，用rna提取试剂盒(omga)抽提rna，用琼脂糖凝胶电泳鉴定rna的完整性，然后在分光光度计上测定rna的纯度和浓度；
36.步骤三：用反转录试剂盒(takara)获得马铃薯的cdna；
37.步骤四：实时荧光定量pcr，在仪器bio
‑
rad iq7实时荧光定量pcr仪上做定量反应，实验结果见表1(表1中0指接种致病疫霉菌0h后马铃薯叶片中stcad7的表达情况；w0是指接种水0h后马铃薯叶片中stcad7的表达情况，3/w3；6/w6；24/w24；48/w48；72/w72以此类推；其中stef1α是马铃薯的内参基因，它在马铃薯各组织中的表达相对恒定，本发明在检测stcad7基因的表达水平变化时以stef1α基因的表达水平作为参照物；qpcr
‑
stcad7是指样
品中stcad7基因的表达情况，qpcr
‑
stef1α是指样品中stef1α基因的表达情况，图1为马铃薯叶片中stcad7基因在接种致病疫霉菌后表达情况。
38.表1马铃薯叶片中stcad7基因和stef1α基因在接种致病疫霉菌后表达情况
39.[0040][0041]
由表1和图1可知，马铃薯stcad7基因在致病疫霉菌接种3h时，相对表达量开始升高，在48h时达到最高，随后相对表达量开始下降。马铃薯stcad7基因响应晚疫病菌的诱导而上调表达。
[0042]
实施例2
[0043]
1、对马铃薯负调控因子stcad7基因进行克隆，包括以下步骤：
[0044]
步骤一：获取植物材料，马铃薯大西洋品种的叶片(可以通过公开渠道获得)；
[0045]
步骤二：rna的抽提，用rna提取试剂盒(omga，lot#:r6827
‑
01)抽提rna，用琼脂糖
凝胶电泳鉴定rna的完整性，然后在分光光度计上测定rna的纯度和浓度；
[0046]
步骤三：基因克隆，用反转录试剂盒(takara，lot#:ahe3187a)获得马铃薯大西洋的cdna，根据sol genomics network：pgsc0003dmc400009489的全长编码序列设计上下游引物，以cdna为模板进行扩增；pcr产物经酶切、连接、菌液pcr验证后构建成载体pkannibal
‑
stcad7(pkannibal质粒载体图谱见图2)，测序并与已公布序列进行比对，正确的质粒经酶切、连接、菌液pcr验证后构建成载体part27
‑
pkannibal
‑
stcad7(part27质粒载体图谱见图3)。
[0047]
引物序列：stcad7
‑
f：ccgctcgagatggaaaaaacacatg aaaatgtaaagg，seq id no:3；
[0048]
stcad7
‑
r：gctctagaattcttgttcaacgtgtttccaatg，seq id no:4。
[0049]
2、stcad7基因过表达植株的获得，本实施例利用根癌农杆菌介导的瞬时表达技术增加目标基因的表达，具体实施如下：
[0050]
步骤一：将上述制备得到的过表达载体part27
‑
pkannibal
‑
stcad7转化入农杆菌感受态，并将转化成功的克隆挑至液体lb培养基中培养24～36h；
[0051]
步骤二：低转速收集菌体，用含有乙酰丁香酮的mes溶液重悬菌体，取部分菌液稀释后用分光光度计检测od
600
的浓度；
[0052]
步骤三：将菌液调整至合适浓度；
[0053]
步骤四：对马铃薯叶片进行注射，2～3天后对叶片进行接菌实验，实验结果见图4。图4为在马铃薯上过表达stcad7促进晚疫病菌对植物的侵染。
[0054]
由图4可知，本发明的负调控因子stcad7基因，作为茄科作物负调控植物抗疫霉菌的基因被克隆，通过农杆菌介导的瞬时表达体系在马铃薯上瞬时过表达stcad7基因，证明了stcad7基因促进了晚疫病菌对植物的侵染。
[0055]
实施例3
[0056]
由于所有cad蛋白均有zn1、zn2和nadph结构域，而马铃薯stcad7蛋白也具有这3个保守结构域，基于此，分别构建了突变体载体m1::myc，m2::myc和m3::myc。其中m1是把zn1中的所有氨基酸突变成丙氨酸；m2是把zn2中的第99、102、105和113位的半胱氨酸分别突变成丙氨酸；m3是把nadph中的所有氨基酸突变成丙氨酸，示意图如图5所示，并构建了含有myc基因的融合表达载体m1::myc，m2::myc和m3::myc。
[0057]
在马铃薯上分别将m1::myc、m2::myc、m3::myc和gfp瞬时表达，之后进行离体叶片接菌测试，结果如图6所示，由图6可知，马铃薯stcad7基因的zn1结构域突变以后，过表达stcad7蛋白不再增强致病疫霉菌对马铃薯的感病性；相同的，马铃薯stcad7蛋白的zn2结构域和nadph结构域突变以后，过表达stcad7蛋白不再增强致病疫霉菌对马铃薯的感病性，上述结果证明马铃薯stcad7蛋白的三个保守结构域是其免疫功能所必需的。
[0058]
实施例4
[0059]
stcad7基因不同亚细胞定位的融合蛋白载体的构建方法如下：分别在stcad7基因的n端加了核输入信号(nls:nuclear location signal)、核输出信号(nes:nuclear export signal)以及肉豆蔻酰化信号(myr:myristoylation signal)，并构建了gfp融合表达载体nls7::gfp、nes7::gfp和myr7::gfp。激光共聚焦的结果如图7所示，由图7可知，nls7::gfp定位于细胞核，nes7::gfp和myr7::gfp定位于细胞膜。利用本氏烟草瞬时表达技术和离体叶片接菌进行测试，发现在本氏烟草上过表达nls7::gfp增强了本氏烟草对致病
疫霉菌的感病性，过表达nes7::gfp和过表达myr7::gfp反而增强本氏烟草对致病疫霉菌的抗性，因此stcad7基因的负调控免疫依赖于细胞核定位。构建stcad7不同亚细胞定位的融合蛋白载体，证明马铃薯stcad7基因负调控免疫依赖于细胞核定位，证明了stcad7基因作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的用途，可用于抗晚疫病品种的选育。
[0060]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.负调控植物免疫的基因stcad7，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。2.负调控植物免疫的基因stcad7编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。3.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白在选育抗晚疫病植物品种中的应用。4.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白在提高植物晚疫病抗性中的应用。5.通过抑制或阻断权利要求2所述蛋白在细胞核定位提高植物晚疫病抗性中的应用。6.通过抑制马铃薯stcad7的zn1结构域、zn2结构域和/或nadph结构域功能或使得马铃薯stcad7的zn1结构域、zn2结构域和/或nadph结构域功能缺失来提高植物晚疫病抗性中的应用。7.根据权利要求3～6任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括马铃薯。
技术总结
本发明属于农业抗病作物品系培育或生产技术领域，特别是涉及StCAD7基因及其编码蛋白作为负调因子在提高马铃薯晚疫病抗性中的应用。本发明所述基因StCAD7促进了晚疫病菌对植物的侵染，StCAD7基因编码的蛋白的三个保守结构域是发挥免疫功能所必需的，能够起到负调控疫晚疫病菌的抗性的作用。疫晚疫病菌的抗性的作用。疫晚疫病菌的抗性的作用。


技术研发人员：单卫星 王小霞
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2021.04.07
技术公布日：2021/6/29