一种抗菌多肽SA-2及其制备方法和应用与流程

一种抗菌多肽sa
‑
2及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及抗菌多肽sa
‑
2及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着免疫功能缺陷人群的增多,侵袭性真菌感染的发病率和死亡率逐年上升，严重威胁人类健康。目前临床常用抗侵袭性真菌感染药物有三唑类(如氟康唑)、多烯类(如两性霉素b)、棘白菌素类(如卡泊芬净)等，然而这些药物并不能满足临床需要，侵袭性真菌感染的死亡率仍居高不下。因此，研发新的抗真菌药物迫在眉睫。
3.抗菌肽是一类新型的不同于小分子抗生素的多肽类药物，来源广阔。其独特的破膜机制使其较难产生耐药现象。部分抗菌肽来源于天然蛋白中，安全性好，同时可能兼有免疫调控的功能，因此，抗菌肽的研发前景备受关注。
4.人唾液中含有许多抗菌物质，其中包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂。目前已有研究从健康人群口腔唾液中分离出分子量为14kda大小的蛋白半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sa)，该蛋白能够与放线菌结合，对放线菌有一定的抗菌活性，但是其对真菌没有任何效果。为了获得安全性高的抗真菌多肽，提高多肽抗菌谱、不易产生耐药性等优势。引起了国内外研究人员的广泛重视。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种抗菌多肽sa
‑
2，该多肽具有良好的体内外抗菌活性，对于白色念珠菌和新生隐球菌有较好的抗菌活性，其中本发明多肽还可以显著降低肺部和脑组织中的真菌新生隐球菌载量，有望成为治疗新生隐球菌肺部和脑组织感染的新型药物。
6.本发明还提供抗菌多肽sa
‑
2的制备方法和应用。
7.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种抗菌多肽sa
‑
2，其氨基酸序列为seq id no.1：yyrrllrvlrrrw。
8.本发明所述的抗菌多肽sa
‑
2的制备方法，包括如下步骤：
9.依据半胱氨酸蛋白酶抑制剂序列，利用生物信息学选择了sa蛋白序列中疏水性强、螺旋度高的序列为多肽模板，获得的序列为seq id no.2:yyrrllrvlrare的多肽sa
‑
1，将sa
‑
1序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)，将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)，再通过固相合成法合成多肽sa
‑
2。本发明所述的抗菌多肽sa
‑
2在制备抗病原菌感染药物中的应用。
10.进一步地，所述抗病原菌感染药物为病原性真菌感染药物。
11.进一步地，所述病原性真菌为白色念珠菌或新型隐球菌。
12.本发明所述的抗病原菌感染药物组合物，包含所述的抗菌多肽sa
‑
2及其药学上所接受的载体。
13.本发明依据半胱氨酸蛋白酶抑制剂序列，利用生物信息学相关技术选择了该sa蛋白序列中疏水性强、螺旋度高的序列为多肽模板。获得序列为seq id no.2:yyrrllrvlrare的多肽(sa
‑
1)，该序列含有13个氨基酸，4个正电荷。为了进一步提高多肽的正电荷和疏水性，将序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)，将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)，在不改变多肽螺旋含量的同时增加正电荷数，同时利用色氨酸与精氨酸形成吲哚环从而提高稳定性。经过突变后的多肽序列为seq id no.1:yyrrllrvlrrrw(sa
‑
2)，sa
‑
2含有13个氨基酸，6个正电荷。表明多肽的正电荷得到了提高。全序列为酪氨酸
‑
酪亮氨酸
‑
精氨酸
‑
精氨酸
‑
亮氨酸
‑
亮氨酸
‑
精氨酸
‑
缬氨酸
‑
亮氨酸
‑
精氨酸
‑
精氨酸
‑
精氨酸
‑
色氨酸。采用固相合成法获得具有抗真菌活性的多肽sa
‑
2。
14.在得到突变后的多肽序列后，从体外抗菌活性，多肽的细胞毒性以及体内抗菌活性这三个方面来综合评价本发明多肽。
15.体外抗菌试验结果表明，本发明的多肽sa
‑
2在提高了正电荷后，对于白色念珠菌和新生隐球菌有较好的抗菌活性。体外杀菌曲线结果表明，多肽sa
‑
2对新生隐球菌耐药株具有较好的杀菌作用，可在12h内几近杀灭真菌。体外毒性试验表明，本发明的多肽sa
‑
2对绵羊红细胞具有较低溶血毒性，同时，即使在512μg/ml浓度下对肺上皮细胞和肺癌细胞a549具有较低的细胞毒性。
16.在用新生隐球菌构建的小鼠肺部感染模型中，本发明的多肽sa
‑
2能够显著提高被感染小鼠的存活率，并且对其体重具有一定程度的保护作用。此外，本发明多肽还可以显著降低肺部和脑组织中的真菌载量。所述的真菌为新生隐球菌。
17.综上所述，抗菌肽sa
‑
2在低毒性浓度范围下，对真菌尤其是新生隐球菌具有较好的杀灭作用，有望成为治疗新生隐球菌肺部感染的新型药物。而已报到的半胱氨酸蛋白酶抑制剂序列sa、模板序列sa
‑
1以及本发明中只将序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)或者只将将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)均没有无法实现上述效果。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
19.1、本发明制备的抗菌多肽sa
‑
2相对于多肽sa或者sa
‑
1，具有更好的广谱抗菌活性，不仅可以对放线菌有显著的抗菌活性，同时对真菌如白色念珠菌和新生隐球菌也有很好的抗菌效果，且成本大大降低。
20.2、本发明制备的抗菌多肽sa
‑
2在具有广谱抗菌活性的同时，相比于sa
‑
1，稳定性明显提高。
21.3、本发明抗菌多肽sa
‑
2的设计制备方法简单方便，设计新颖，原料来源易得，可以工业化生产应用。
22.4、本发明制备的抗菌多肽sa
‑
2可以应用在制备抗抗真菌感染药物中，具有良好的体内外抗菌活性；在用新生隐球菌构建的小鼠肺部感染模型中，本发明的多肽sa
‑
2能够显著提高被感染小鼠的存活率，并且对其体重具有一定程度的保护作用。此外，本发明多肽还可以显著降低肺部和脑组织中的真菌载量，对真菌尤其是新生隐球菌具有较好的杀灭作用，有望成为治疗如新生隐球菌肺部感染的新型药物。
附图说明
23.图1是sa
‑
2对白色念珠菌的杀菌曲线；
24.图2是sa
‑
2对新生隐球菌的杀菌曲线；
25.图3是sa
‑
2对绵羊红细胞的溶血活性；
26.图4是sa
‑
2对新生隐球菌感染小鼠的生存保护作用；
27.图5是sa
‑
2对新生隐球菌感染小鼠的体重保护作用；
28.图6是sa
‑
2对新生隐球菌感染小鼠的肺组织菌含量的影响；
29.图7是sa
‑
2对新生隐球菌感染小鼠的脑组织菌含量的影响；
30.图8是sa
‑
2的hplc图谱；
31.图9是sa
‑
2的ms图谱。
具体实施方式
32.以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
33.实施例1
34.以半胱氨酸蛋白酶抑制剂序列(sa，np_001313.1)，对sa蛋白序列中疏水性强、螺旋度高的序列进行截取获得序列为seq id no.2:yyrrllrvlrare的多肽(sa
‑
1)为多肽模板。将序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)，将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)，经过突变后的多肽序列为seq id no.1:yyrrllrvlrrrw(sa
‑
2)。
35.固相合成法合成多肽sa
‑236.制备的sa
‑
2的氨基酸序列为：甘氨酸
‑
异亮氨酸
‑
色氨酸
‑
赖氨酸
‑
苯丙氨酸
‑
亮氨酸
‑
赖氨酸
‑
赖氨酸
‑
丙氨酸
‑
赖氨酸
‑
赖氨酸
‑
苯丙氨酸
‑
色氨酸
‑
赖氨酸
37.多肽的合成：多肽sa
‑
2的合成从c端到n端逐个进行。将fmoc
‑
val
‑
wang resin用二氯甲烷浸泡15min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/dmf溶液(每克树脂10ml)，使用氮气鼓动，反应2次，时间为5min和15min，反应结束后用dmf洗涤树脂9次。取取20～40颗加入验色剂abc各2
‑
3滴(a液：茚三酮/无水乙醇溶液；b液：吡啶；c液：苯酚/无水乙醇溶液)在100℃下共热3min，溶液及树脂颜色变为蓝色，以脱除氨基保护。加入过量反应两倍摩尔数的fmoc
‑
val
‑
oh和hobt，用每克树脂10ml的dmf溶解，加入两倍摩尔数的dic和collidine，氮气鼓动，反应1h。反应结束后用dmf洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入tfa，在恒温摇床中反应2h，摇床转速110r/min，温度25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得sa
‑
2粗品多肽。
38.多肽的纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质。同时过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。
39.多肽的纯度测定(hplc法)及质谱分析结果：多肽合成后经纯化得到成品，成品经高效液相色谱和质谱进行鉴定。
40.液相色谱分析条件：c18色谱柱(4.6
×
250mm,5μm)；流动相a为含0.1％三氟乙酸的
乙腈溶液，流动相b为含0.1％tfa的纯净水。检测波长为220nm；流速为1.0ml/min；进样量20μl，进行梯度洗脱。
41.本发明多肽氨基酸序列如seq id no：1所示，纯度大于98％。sa
‑
2的分子量为1906.3，其hplc和ms分别如图8和9所示，与理论值相吻合。
42.实施例2
43.本发明多肽sa
‑
2体外抗菌活性的测定
44.(1)菌种的复苏与活化
45.从甘油管中将实验用菌种，转接至相应的沙氏葡萄糖琼脂斜面中。置于28℃培养48h，保存在4℃的冰箱中备用。
46.(2)菌液的制备
47.用接种环刮取斜面中的少量菌体，接种至3ml的沙氏葡萄糖液体培养基中，在28℃，200rpm摇床上培养，用液体培养基稀释成1
×
105cfu/ml的菌悬液，备用。
48.(3)药物的配制
49.称取实施例1制备的多肽，纯水溶解，配制成1024μg/ml的母液，用0.22μm的水相滤头过滤除菌后，置于
‑
20℃保存备用。
50.(4)多肽sa
‑
2对试验菌株的最低抑菌浓度(mic)和最低杀菌浓度(mbc)的测定
51.多肽药物用液体培养基倍比稀释成不同的浓度梯度后，分别取50μl于96孔板中，之后等体积接种经液体培养基稀释至1
×
105cfu/ml的菌悬液，使药物终浓度为128、64、32、16、8、4、2μg/ml，同时设置不加药物的空白对照组。置28℃培养48h，观察并记录试验结果。以不长菌的最低药物浓度为mic。
52.取上述mic测定的96孔板中未见菌落生长的培养物100μl，加入900μl无菌培养基稀释后，转移至无菌平皿中，倾倒约10ml融化了的沙氏葡萄糖琼脂培养基，置于28℃培养箱中培养48h，观察并记录平皿中的菌落数，菌落数小于5个的最低药物浓度即为mbc值，结果见表1：
53.表1多肽sa
‑
2对白色念珠菌和新生隐球菌的mic和mbc值
[0054][0055]
注：白色念珠菌#1
‑
3为临床株，新生隐球菌#1
‑
6为临床株
[0056]
从表1可以看出，sa
‑
2具有较好的抗真菌活性，对标准及临床耐药的多种真菌都显示出较好的抗菌活性，mic值在8～32μg/ml范围内，mbc值在16
‑
128μg/ml范围内，对临床耐药新型隐球菌以及标准菌株的mic值仅为8μg/ml。表明本发明多肽对真菌尤其是新生隐球菌具有较好的杀灭作用。
[0057]
(5)多肽sa
‑
2对白色念珠菌和新生隐球菌的杀菌曲线
[0058]
将上述试验菌株用沙氏葡萄糖液体培养基稀释至约1
×
105cfu/ml，加入多肽sa
‑
2使其浓度为对应菌株的4
×
mic，置25℃恒温培养，同时加入对应菌株的4
×
mic浓度的两性霉素b和氟康唑作为阳性对照，加入生理盐水作为阴性对照。于0、1、2、4、8和24h定时取出200μl混合培养物，梯度稀释后进行平板活菌计数。以药物作用时间为横坐标，菌落计数值为纵坐标，绘制杀菌曲线，结果见图1和图2：
[0059]
图1
‑
2是sa
‑
2对真菌(包括：白色念珠菌和新型隐球菌)的杀菌作用。从图中可以看出sa
‑
2能在4h内杀死全部的白色念珠菌和新型隐球菌，使其菌落数降低为零，表明sa
‑
2对白色念珠菌和新生隐球菌具有快速的杀菌作用。
[0060]
对比例1
‑
5为不同的多肽采用上述方法测试最低抑菌浓度(mic)和最低杀菌浓度(mbc)：
[0061]
对比例1为半胱氨酸蛋白酶抑制剂序列sa；
[0062]
对比例2为多肽sa
‑
1；
[0063]
对比例3多肽为只将多肽sa
‑
1序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)；
[0064]
对比例4多肽为等浓度的只将多肽sa
‑
1序列带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)；
[0065]
对比例5多肽为将多肽sa
‑
1序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸赖氨酸(k)，将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸缬氨酸(v)，将对比例1
‑
5采用上述相同的体外抗菌活性的测定方法，其中对比例1和2均没有任何的白色念珠菌和新生隐球菌的抗菌和杀菌活性；对比例3和4对白色念珠菌的mic均超过了300μg/ml，对新生隐球菌的mic均超过了500μg/ml，说明本发明中只有同时将序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)，将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)具有显著的增效效果。而对比例5将多肽sa
‑
1序列非极性氨基酸丙氨酸(a)和带负电荷氨基酸谷氨酸(e)进行其他替换，对白色念珠菌、新生隐球菌的mic均超过了200μg/ml，效果也不如本发明的多肽sa
‑
2，说明本发明特定位点的突变才能到达较好的白色念珠菌和新生隐球菌的抗菌和杀菌活性。
[0066]
实施例3
[0067]
本发明多肽sa
‑
2对肺部感染小鼠的保护作用
[0068]
利用无菌注射器吸取脱纤维的绵羊血3.0ml加至无菌ep管，于冷冻离心机中3000rpm离心10min，弃上清，pbs(ph7.4)洗涤3次。用pbs重悬后制成3％(v/v)的红细胞悬液。分别取80μl红细胞悬液加入96孔板中，之后等体积加入倍比稀释的多肽药物，使药物终浓度为512、128、32、8、2μg/ml。同时，以1％triton x
‑
100处理的红细胞为阳性对照组，以pbs缓冲液处理的红细胞为阴性对照组，每组设置3个复孔。培养板置于37℃恒温培养1h后取出，在冷冻离心机3000rpm，4℃离心10min。取上清，用酶标仪测定od
450
值，并计算溶血率，公式如下：
[0069]
溶血率(％)＝[(a
‑
a 0
)/(a
100
‑
a0)]
×
100％
[0070]
a表示多肽sa
‑
2组的吸光值。a 0
表示pbs组的吸光值，a
100
表示triton x
‑
100组的吸光值。
[0071]
由附图3可以看出，即使在最高浓度512μg/ml时，本发明制备的多肽对绵阳红细胞的溶血率不超过5％，结合mic的范围，可以得出结论：多肽sa
‑
2在杀菌浓度下，基本无溶血毒性。
[0072]
实施例4
[0073]
本发明多肽sa
‑
2对肺部感染小鼠的保护作用
[0074]
选取体重约为20～22g的四周龄雄性icr小鼠，随机分为6组，每组8只。除空白对照组外，其余5组小鼠连续三天注射环磷酰胺(100mg/kg/d)后，第四天用乙醚麻醉，滴鼻感染1
×
108cfu/ml的新生隐球菌菌悬液(60μl/只),建立新生隐球菌肺部感染模型，感染组小鼠在感染后立即给予不同浓度的sa
‑
2多肽溶液进行治疗，多肽的高中低给药剂量浓度分别为10、5和2.5mg/kg/d。阳性对照组采用氟康唑(50mg/kg/d)灌胃给药和两性霉素b(0.5mg/kg/d)尾静脉给药联合治疗。模型组注射生理盐水作对照。连续7天进行持续治疗后，观察14天并记录小鼠的存活及体重变化情况。
[0075]
在治疗两周后，颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下解剖取肺、脑组织称重，置于无菌ep管中，加入9倍体积的生理盐水(v组织：v生理盐水＝1:9)，用剪刀剪碎组织，电动匀浆器匀浆各组织。匀浆液用生理盐水10倍梯度稀释后取稀释液加入无菌平皿中，倒入沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀后于28℃培养箱培养48h。观察并记录平板上的菌落数，计算肺、脑组织的真菌数。结果见图4
‑
7。
[0076]
由图4可以看出，模型组小鼠由于真菌感染造成大部分死亡，而多肽中、高剂量给药组相对于模型组，小鼠存活率分别提高至25％和37.5％，证明多肽对真菌感染小鼠的存活有很大程度的保护作用，并且在一定浓度范围内(10mg/kg)多肽的体内药效呈剂量依赖性变化。
[0077]
由图5可以看出，模型组小鼠感染真菌后体重有很大程度的下降，之后未死亡的小鼠体重有缓慢程度的恢复。而多肽和阳性药处理组，小鼠的体重相对于模型组有更快的恢复，说明多肽对小鼠的体重也有一定程度的保护作用。
[0078]
图6和图7是小鼠肺脑组织中的真菌含量，相对于模型组和低剂量组，多肽中剂量组和高剂量组明显降低了小鼠肺组织中的真菌含量，分别下降了0.5和0.8个log值，与模型组比较具有显著性差异(p<0.05)。
[0079]
综合图4
‑
7可以看出，多肽sa
‑
2表现出较好的真菌清除力，进而提高感染小鼠的生存率，具有治疗新生隐球菌肺部感染的潜力。此外，本发明多肽还可以对脑组织中感染新生隐球菌的小鼠以保护作用。

技术特征：
1.一种抗菌多肽sa
‑
2，其特征在于，其氨基酸序列为seq id no.1：yyrrllrvlrrrw。2.一种权利要求1所述的抗菌多肽sa
‑
2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：依据半胱氨酸蛋白酶抑制剂序列，利用生物信息学选择了sa蛋白序列中疏水性强、螺旋度高的序列为多肽模板，获得的序列为seq id no.2:yyrrllrvlrare的多肽sa
‑
1，将sa
‑
1序列上的非极性氨基酸丙氨酸(a)替换为阳离子氨基酸精氨酸(r)，将带负电荷氨基酸谷氨酸(e)替换为极性氨基酸色氨酸(w)，再通过固相合成法合成多肽sa
‑
2。3.一种权利要求1所述的抗菌多肽sa
‑
2在制备抗病原菌感染药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗病原菌感染药物为病原性真菌感染药物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原性真菌优选为白色念珠菌或新型隐球菌。6.一种抗病原菌感染药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗菌多肽sa
‑
2及其药学上所接受的载体。
技术总结
本发明公开了一种抗菌多肽SA


技术研发人员：周长林 许鹏飞 黄晓伟
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021/6/29