M2型骨髓巨噬细胞外泌体及其应用、脊髓损伤治疗制剂的制作方法

m2型骨髓巨噬细胞外泌体及其应用、脊髓损伤治疗制剂
技术领域
1.本发明属于脊髓损伤治疗技术领域，具体涉及一种m2型骨髓巨噬细胞外泌体及其应用、脊髓损伤治疗制剂。


背景技术：

2.脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，全球发病率为每年每百万人口15
‑
40例，中国现有创伤性脊髓损伤患者超过200万，每年新增10
‑
14万，高于全球发病率。脊髓是大脑和外周神经系统之间信息沟通的主要桥梁，损伤发生后将导致其运动、感觉和自主神经功能丧失，往往严重致残，甚至引起死亡，不仅消耗巨大的医疗资源，也给个人、家庭和社会带来沉重的经济负担。目前对于伴有严重神经功能障碍的患者仍无有效的治疗方法。
3.外泌体是细胞分泌的外囊泡，其中包含多种不同的蛋白质和mirnas，这些"货物"被输送到周围细胞或携带到远端细胞，以调节生物过程。不同细胞来源的外泌体，其作用也不尽相同。外泌体治疗具有诸多优势，良好的生物相容性、特异的靶向性以及低免疫原性使其成为良好的治疗载体，目前外泌体治疗的巨大潜力已引起了人们的极大关注，选择合适的细胞来源以获得相应的外泌体显得尤为重要。针对脊髓损伤治疗的外泌体主要来源于不同类型的干细胞，通过干细胞外泌体的促神经再生作用在一定程度上改善脊髓损伤后功能恢复，但是神经的再生与局部微环境密切相关，在局部缺血缺氧的情况下其再生能力也往往受限，目前尚无以针对脊髓损伤后血管再生治疗为主的外泌体产品。
4.此外，系统性注射的外泌体往往会随血液到达肝肾，并被代谢，仅有少部分到达目标部位发挥治疗作用，局部外泌体给药仅能在早期维持较高效应浓度，难以长期持续性发挥效应。
5.综上，目前仍缺乏一种针对脊髓损伤后促进血管再生的外泌体，并且利用该种外泌体进行持续性给药治疗脊髓损伤。
6.本发明克服了现有的技术缺陷，制备了一种高表达otulin蛋白的m2型骨髓巨噬细胞外泌体即hiotulin
‑
m2
‑
exos，可以发挥改善脊髓损伤后局部缺血缺氧环境，促进血管再生的作用，更加利于神经再生以及局部组织的存活。通过与光固化水凝胶结合形成外泌体缓释系统应用于脊髓损伤局部，提高了外泌体治疗效率，避免了被肝肾代谢，并可持续缓释实现长时间作用，显著改善了小鼠脊髓损伤后的功能恢复。


技术实现要素：

7.本发明旨在克服现有技术缺陷，提供一种m2型骨髓巨噬细胞外泌体及其在制备脊髓损伤治疗制剂中的应用，以及制备得到的脊髓损伤治疗制剂。该外泌体可显著促进损伤脊髓中的血管再生，改善运动功能恢复。
8.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
9.一种m2型骨髓巨噬细胞外泌体，是由m2型骨髓巨噬细胞分泌得到的。
10.所述的外泌体含有特异性标志物，包括cd63、cd9和tsg101，并且首次发现该外泌体高表达otulin蛋白。该蛋白在外泌体中的富集程度为m2型骨髓巨噬细胞中的7.22
±
0.06倍。
11.所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体即hiotulin
‑
m2
‑
exos，是通过分离并培养原代骨髓巨噬细胞，诱导为m2型巨噬细胞；然后用含有无外泌体血清的完全培养基孵育，利用差速离心法收集得到。
12.进一步地，所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体，用pbs洗涤m2型巨噬细胞两次，并用含有无外泌体血清的完全培养基(dmem基础培养基 10％无外泌体血清 1％青链霉素)孵育24
‑
72小时，优选36
‑
60h，将孵育后的培养基500
‑
800
×
g离心8
‑
10分钟，3000
‑
4000
×
g离心20
‑
30分钟；4℃下10000
‑
12000
×
g离心30min
‑
1h后，用0.22μm过滤器过滤上清液，去除细胞和碎片，收集外泌体。将外泌体在100000
‑
140,000
×
g离心1.5
‑
3h后，在pbs中重悬，再在100000
‑
140,000
×
g离心1.5
‑
3h，获得高纯度m2型骨髓巨噬细胞外泌体。
13.本发明还提供了所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体在脊髓损伤治疗制剂中的应用。
14.所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体制备成全身给药制剂或者局部给药制剂，或者局部外用制剂。
15.进一步地，所述的局部外用制剂包括以光固化水凝胶为载体的外泌体
‑
光固化水凝胶缓释制剂。
16.进一步地，将m2型骨髓巨噬细胞外泌体与光固化水凝胶混合，水凝胶中外泌体的浓度为100
‑
200ug/ml，优选200ug/ml，避光条件下进行共孵育1
‑
2h，优选1h，形成外泌体
‑
水凝胶缓释制剂，于
‑
20℃避光保存。
17.进一步地，外泌体
‑
凝胶缓释制剂使用时，将外泌体
‑
凝胶缓释制剂加热到37
‑
40℃，使其处于水相；在损伤脊髓局部以敷料形式按照80
‑
120ul/cm2覆盖外泌体
‑
凝胶缓释制剂，于365
‑
405nm 60mw/cm2条件下光照30s
‑
1min，优选30s，使水凝胶从水相转变为固相，缝合伤口。
18.本发明还提供了一种脊髓损伤治疗制剂，包含上述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体。
19.进一步地，所述的制剂还包括上述外泌体
‑
光固化水凝胶缓释制剂。
20.本发明技术方案的获得过程：
21.一、获取并验证hiotulin
‑
m2
‑
exos
22.m2型骨髓来源巨噬细胞培养：选取4
‑
6周龄的c57bl/6小鼠，分离并培养原代骨髓巨噬细胞。细胞贴壁后培养5
‑
7天，更换为m2型巨噬细胞培养基(含imdm，10ng/ml il
‑
4，10％fbs，1％青链霉素)培养3天，诱导为m2型巨噬细胞。
23.具体：选择4
‑
6周龄的c57bl/6小鼠，脱颈处死。分离股骨和胫骨，用imdm培养基冲洗骨髓中的细胞，并反复轻轻吹打细胞，以吹走骨髓腔内较大的组织块，用70目细胞筛过滤细胞悬液，收集滤液于离心管中，1000
‑
1500转/分离心5
‑
10分钟。弃上清液，加入2ml红细胞裂解液重悬，室温4
‑
5min，加入等体积的培养基，停止红细胞的裂解。1000
‑
1500转离心5
‑
10分钟，弃上清液，将骨髓细胞重悬于细胞培养基中，均匀播种于100mm的培养皿中。12～14h后收集上清液，1000
‑
1500转离心5
‑
10分钟，收集不贴壁的细胞，弃去上清液，补充完全培养基(imdm,10ng/ml m
‑
csf,10％fbs，1％青链霉素)。培养5
‑
7天后，将培养基替换为m2型巨噬细胞培养基(imdm，10ng/ml il
‑
4，10％fbs，1％青链霉素)培养3天，刺激m0型巨噬细胞极化
为m2型巨噬细胞。
24.hiotulin
‑
m2
‑
exos获取：用pbs洗涤m2型巨噬细胞以去除原培养基中的外泌体，并用含有无外泌体血清的完全培养基(dmem基础培养基 10％无外泌体血清 1％青链霉素)孵育24
‑
72小时，利用差速离心法收集外泌体。
25.具体：用pbs洗涤m2型巨噬细胞两次，并用含有无外泌体血清的完全培养基(dmem基础培养基 10％无外泌体血清 1％青链霉素)孵育24
‑
72小时，将孵育后的培养基500
‑
800
×
g离心8
‑
10分钟，3000
‑
4000
×
g离心20
‑
30分钟。4℃下10000
‑
12000
×
g离心30min
‑
1h后，用0.22μm过滤器过滤上清液，去除细胞和碎片，收集外泌体。将外泌体在100000
‑
140,000
×
g离心1.5
‑
3h后，在pbs中重悬，再在100000
‑
140,000
×
g离心1.5
‑
3h，获得高纯度hiotulin
‑
m2
‑
exos。
26.hiotulin
‑
m2
‑
exos成分检测：基于蛋白质谱测序检测了外泌体中的蛋白成分，并进行了western blot验证。
27.hiotulin
‑
m2
‑
exos功能验证：首先利用shrna抑制hiotulin
‑
m2
‑
exos中otulin蛋白的表达并进行western blot验证。其次，提取原代脊髓微血管内皮细胞(scmecs),验证hiotulin
‑
m2
‑
exos被scmecs摄取情况，分别验证hiotulin
‑
m2
‑
exos与抑制otulin后的外泌体即shotulin
‑
m2
‑
exos干预后对scmecs增殖能力，迁移能力以及成管能力的影响。
28.具体：用红色荧光亲脂性染料dil标记hiotulin
‑
m2
‑
exos，将标记的hiotulin
‑
m2
‑
exos在100000
‑
140,000
×
g洗涤1.5
‑
3h，并在无菌pbs中重悬两次，以去除游离的dil和其他杂质，然后将scmecs种于24孔细胞爬片上，待细胞生长至80％密度，加入100
‑
200ug/ml hiotulin
‑
m2
‑
exos并在37℃下培养12
‑
24h后进行免疫荧光染色。用4％多聚甲醛固定细胞10
‑
20min，并用5％bsa孵育30min
‑
1h，以阻断非特异性染色；用cd31分子标记内皮细胞进行免疫荧光染色。
29.使用shrna抑制hiotulin
‑
m2
‑
exos中otulin的表达(抑制序列：5'
‑
caccggacatcctatgaacagtactcgaaagtactgttcataggatgtcc
‑
3')，并通过western blot验证抑制效果。
30.shotulin
‑
m2
‑
exos为shrna处理m2型巨噬细胞后，采用相同方法提取获得的外泌体。
31.随后将100μl scmecs细胞悬液(细胞密度在5
‑8×
103)接种至96孔培养板中，分别用hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100
‑
200μg/ml)，抑制otulin的m2
‑
exos(shotulin
‑
m2
‑
exos，浓度100
‑
200μg/ml)以及pbs(对照组)处理scmecs。将10μl cck
‑
8试剂加入各孔的培养基中。在37℃下孵育4小时后，用酶标仪在450nm处检测吸光度。
32.将scmecs培养在六孔板上直到细胞生长至90％，分别用hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100
‑
200μg/ml)，抑制otulin的m2
‑
exos(shotulin
‑
m2
‑
exos，浓度100
‑
200μg/ml)以及pbs(对照组)处理scmecs，使用100ul tip头尖端做十字形划痕。分别在0小时，6小时和12小时用显微镜观察测量5个随机视野中划痕两侧的距离。
33.将scmecs以2
‑4×
105个细胞/ml的密度培养在24孔transwell小室上室，上室细胞培养基中含1％fbs。在下室加入600μl含10％fbs的培养基，然后分别将hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100
‑
200μg/ml)，shotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100
‑
200μg/ml)以及pbs(对照组)，加入下室进行干预，培养24h后，擦去上室未迁移的细胞，将迁移至下室的细胞用4％pfa固定30min，然后用0.1％结晶紫染色20min，计数。
34.将50μl预冷的基质胶加入96孔板中。胶凝固后，将scmecs以2
‑4×
104个细胞/孔的密度接种。并分别将hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100
‑
200μg/ml)，shotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100
‑
200μg/ml)以及pbs(对照组)，加入进行干预。12小时后，光学显微镜下评估scmecs成管能力，并测定管腔分支节点和小管数量。
35.二、外泌体在脊髓损伤中的应用
36.外泌体
‑
光固化水凝胶缓释制剂构建：将hiotulin
‑
m2
‑
exos与光固化水凝胶(matrix gel，制备方法详见yi hong et al.nat com.2019.)混合，水凝胶中hiotulin
‑
m2
‑
exos的浓度为100
‑
200ug/ml，避光条件下进行共孵育1
‑
2h，形成外泌体
‑
凝胶缓释制剂，于
‑
20℃避光保存。
37.本发明的光固化水凝胶并不限于matrix gel这一种，只要是具有光固化特性，且无毒性的光固化水凝胶均可。
38.脊髓损伤模型建立：利用常规allen’s打击法建立小鼠t10脊髓挫伤模型。
39.外泌体
‑
凝胶缓释制剂应用：将外泌体
‑
凝胶缓释制剂加热到37
‑
40℃，使其处于水相。在损伤脊髓局部以敷料形式按照80
‑
120ul/cm2覆盖外泌体
‑
凝胶缓释制剂，于365
‑
405nm60mw/cm2条件下光照30s
‑
1min，使水凝胶从水相转变为固相，缝合伤口。
40.hiotulin
‑
m2
‑
exos示踪：利用xenogen ivis imaging系统对dir荧光标记的hiotulin
‑
m2
‑
exos进行示踪,检测hiotulin
‑
m2
‑
exos作用持续时间。
41.利用免疫荧光技术评估应用外泌体
‑
凝胶缓释制剂后对脊髓损伤后血管再生的影响。
42.利用bms评分，机械以及热痛觉阈值测定，神经电生理检测评估应用外泌体
‑
凝胶缓释制剂后脊髓损伤小鼠的运动、感觉以及神经传导功能恢复情况。
43.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
44.1、本发明制备了一种外泌体hiotulin
‑
m2
‑
exos，能够改善脊髓损伤后局部组织缺血缺氧状态，更利于局部组织存活及神经再生。
45.2、低副作用。本发明为低免疫原性、高安全性的外泌体制剂，吸收快，副作用较小。
46.3、效果更持久。本发明将外泌体与水凝胶结合形成缓释系统，并进行局部敷料给药，可以使外泌体保持相对稳定的持续缓释效果，作用效果可持续至损伤后28天，和全身给药相比大大延长了外泌体的作用时间。
47.4、作用效率更高。本发明使用光固化水凝胶作为外泌体载体，一般热固化水凝胶由于受环境温度影响容易使凝胶状态发生改变，进而影响外泌体的孵育效果导致外泌体难以均匀分布于凝胶中，而光固化水凝胶在特定波长范围照射下才会变成固相，使外泌体能更好的与水相状态下的水凝胶结合，大大增加了其作用效果。
附图说明
48.图1为m2型骨髓来源巨噬细胞鉴定；
49.图1a中m0和m2型巨噬细胞的形态分析表明，m0型巨噬细胞具有典型的细核突出、胞质平展、多伪足形态，而m2型巨噬细胞则表现为不规则，边缘粗糙、多丝状伪足；
50.图1b中m2型巨噬细胞标志物(f4/80、cd206)的免疫荧光染色显示，m2型巨噬细胞与m0型巨噬细胞相比，cd206的表达量更高。
51.图2为hiotulin
‑
m2
‑
exos透射电镜成像和nta分析；
52.图2a结果显示，外泌体表现出球状的形态；
53.图2b的nta测量显示外泌体平均直径范围为100nm左右；
54.图2c的western blot验证了外泌体标志物包括cd63、cd9和tsg101的表达。
55.图3为hiotulin
‑
m2
‑
exos中蛋白成分分析；
56.图3a利用itraq技术对m2型骨髓巨噬细胞外泌体中的蛋白质表达进行高通量测序；prm验证发现其中otulin上调最为显著；
57.图3b为利用western blot对otulin蛋白含量进一步验证。
58.图4为脊髓微血管内皮细胞(scmecs)摄取hiotulin
‑
m2
‑
exos及内皮细胞功能实验；
59.图4a为scmecs摄取外泌体免疫荧光染色；
60.图4b为抑制otulin表达后western blot验证结果；
61.图4c为cck8细胞活性检测；分别用pbs(对照组),hiotulin
‑
m2
‑
exos以及shotulin
‑
m2
‑
exos干预后对scmecs细胞活力进行检测，结果提示hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs增殖能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组增殖能力明显下降；
62.图4d为scmecs划痕实验；分别用pbs(对照组),hiotulin
‑
m2
‑
exos以及shotulin
‑
m2
‑
exos干预后对scmecs细胞横向迁移能力进行检测；结果显示hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs横向迁移能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组横向迁移能力明显下降；
63.图4e为scmecs transwell小室纵向迁移实验；分别用pbs(对照组),hiotulin
‑
m2
‑
exos以及shotulin
‑
m2
‑
exos干预后对scmecs细胞纵向迁移能力进行检测；结果显示hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs纵向迁移能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组纵向迁移能力明显下降；
64.图4f为scmecs成管实验；分别用pbs(对照组)，hiotulin
‑
m2
‑
exos以及shotulin
‑
m2
‑
exos干预后对scmecs细胞成管能力进行检测；结果显示hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs成管能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组成管能力明显下降；
65.图5为外泌体
‑
凝胶缓释制剂构建及应用；
66.图5a为外泌体
‑
凝胶缓释制剂应用示意图；
67.图5b为在损伤脊髓局部以敷料形式覆盖外泌体
‑
凝胶缓释制剂，对照组则覆盖等量pbs
‑
凝胶制剂，然后利用紫外光筒进行照射。
68.图6为hiotulin
‑
m2
‑
exos示踪结果；
69.用xenogen ivis成像系统采集m2型骨髓巨噬细胞外泌体在脊髓损伤后不同时间点的荧光信号；结果显示，m2型骨髓巨噬细胞外泌体的荧光信号持续到28天，说明其作用效果可以持续28天。
70.图7为hiotulin
‑
m2
‑
exos干预对血管再生的影响；
71.利用免疫荧光技术对脊髓损伤后血管再生情况进行分析，结果发现m2型骨髓巨噬细胞外泌体治疗后7天开始，至28天损伤区域血管密度显著增加，说明血管再生能力明显增强。
72.图8为hiotulin
‑
m2
‑
exos干预对脊髓损伤功能恢复的影响；
73.图8a为对小鼠进行bms评分，结果表明m2型骨髓巨噬细胞外泌体治疗能显著改善
脊髓损伤后的后肢运动能力；(pre
‑
sur：脊髓损伤建模前；sci：脊髓损伤)；
74.图8b
‑
c为热刺激下的撤爪阈值以及机械刺激下的撤爪时间，结果表明m2型骨髓巨噬细胞外泌体治疗能显著改善脊髓损伤后的感觉恢复；(pre
‑
sur：脊髓损伤建模前；sci:脊髓损伤)；
75.图8d为神经电生理分析，结果显示m2型骨髓巨噬细胞外泌体治疗能显著改善脊髓损伤后后肢神经传导功能。
具体实施方式
76.以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
77.实施例1、m2型骨髓来源巨噬细胞的分离与培养：
78.选择4
‑
6周龄的c57bl/6小鼠，脱颈处死。分离股骨和胫骨，用imdm培养基冲洗骨髓中的细胞，并反复轻轻吹打细胞，以吹走骨髓腔内较大的组织块，用70目细胞筛过滤细胞悬液，收集滤液于离心管中，1200转/分离心5分钟。弃上清液，加入2ml红细胞裂解液重悬，室温5min，加入等体积的培养基，停止红细胞的裂解。1200转离心5分钟，弃上清液，将骨髓细胞重悬于细胞培养基中，均匀播种于100mm的培养皿中。12h后收集上清液，1200转离心5分钟，收集不贴壁的细胞，弃去上清液，补充完全培养基(imdm,10ng/ml m
‑
csf,10％fbs，1％青链霉素)。培养5天后，将培养基替换为m2型巨噬细胞培养基(imdm，10ng/ml il
‑
4，10％fbs，1％青链霉素)培养3天，刺激m0型巨噬细胞极化为m2型巨噬细胞。对培养的m2型巨噬细胞进行检测，形态学分析表明，m0型巨噬细胞表现出突出的核与平展的细胞质，而m2型巨噬细胞的特点是形状不规则，边缘粗糙以及丝状伪足多(见图1a)。免疫荧光染色显示，与m0型巨噬细胞相比，m2型巨噬细胞呈cd206、f4/80双阳性(见图1b)。
79.实施例2、hiotulin
‑
m2
‑
exos获取：
80.用pbs洗涤m2型巨噬细胞两次，并用含有无外泌体血清的完全培养基(dmem基础培养基 10％无外泌体血清 1％青链霉素)孵育48小时，将孵育后的培养基800
×
g离心10分钟，3000
×
g离心30分钟；4℃下10000
×
g离心1h后，用0.22μm过滤器过滤上清液，去除细胞和碎片，收集外泌体。将外泌体在140,000
×
g离心3h后，在pbs中重悬，再在140,000
×
g离心3h，获得高纯度m2型骨髓巨噬细胞外泌体。
81.对获得的外泌体进行表征，透射电子显微镜和nta测量表明，分离的外泌体表现出双层膜球状形态，直径范围为100nm左右(见图2a
‑
b)。western blot验证了外泌体特异性标志物cd63、cd9和tsg101的表达情况(见图2c)。
82.实施例3、hiotulin
‑
m2
‑
exos成分检测：
83.利用itraq技术对hiotulin
‑
m2
‑
exos中的蛋白质表达谱进行检测。prm实验发现otulin蛋白上调最为明显(该蛋白在外泌体中的富集程度为m2型骨髓巨噬细胞中的7.22
±
0.06倍)(见图3a)，western blot进一步证实otulin在m2
‑
exos(m2型骨髓巨噬细胞外泌体)中显著富集(见图3b)。
84.实施例4、hiotulin
‑
m2
‑
exos对内皮细胞的影响：
85.用红色荧光亲脂性染料dil标记hiotulin
‑
m2
‑
exos，将标记的hiotulin
‑
m2
‑
exos在140,000
×
g洗涤1.5h，并在无菌pbs中重悬两次，以去除游离的dil和其他杂质，然后将scmecs种于24孔细胞爬片上，待细胞生长至80％密度，加入200ug/ml hiotulin
‑
m2
‑
exos并
在37℃下培养12
‑
24h后进行免疫荧光染色。用4％多聚甲醛固定细胞20min，并用5％bsa孵育30min，以阻断非特异性染色；用cd31分子标记内皮细胞进行免疫荧光染色。结果证实dil标记的hiotulin
‑
m2
‑
exos能够有效被scmecs摄取(见图4a)。
86.使用shrna抑制hiotulin
‑
m2
‑
exos中otulin的表达(抑制序列：5'
‑
caccggacatcctatgaacagtactcgaaagtactgttcataggatgtcc
‑
3')，western blot结果证实shrna处理m2型巨噬细胞后，m2
‑
exos中otulin的蛋白水平明显下降(见图4b)。
87.shotulin
‑
m2
‑
exos为shrna处理m2型巨噬细胞后，采用相同方法提取获得的外泌体。随后将100μlscmecs细胞悬液(细胞密度在5
×
103)接种至96孔培养板中，分别用hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100μg/ml)，抑制otulin的m2
‑
exos(shotulin
‑
m2
‑
exos，浓度100μg/ml)以及pbs(对照组)处理scmecs。将10μl cck
‑
8试剂加入各孔的培养基中。在37℃下孵育4小时后，用酶标仪在450nm处检测吸光度，cck
‑
8检测结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs增殖能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组增殖能力明显下降(见图4c)。
88.将scmecs培养在六孔板上直到细胞生长至90％，分别用hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100μg/ml)，抑制otulin的m2
‑
exos(shotulin
‑
m2
‑
exos，浓度100μg/ml)以及pbs(对照组)处理scmecs，使用100ul tip头尖端做十字形划痕。分别在0小时，6小时和12小时用显微镜观察测量5个随机视野中划痕两侧的距离。结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs横向迁移能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组横向迁移能力明显下降(见图4d)。
89.将scmecs以2
×
105个细胞/ml的密度培养在24孔transwell小室上室，上室细胞培养基中含1％fbs。在下室加入600μl含10％fbs的培养基，然后分别将hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100μg/ml)，shotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100μg/ml)以及pbs(对照组)，加入下室进行干预，培养24h后，擦去上室未迁移的细胞，将迁移至下室的细胞用4％pfa固定30min，然后用0.1％结晶紫染色20min，计数。结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs纵向迁移能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组纵向迁移能力明显下降(见图4e)。
90.将50μl预冷的基质胶加入96孔板中。胶凝固后，将scmecs以2
×
104个细胞/孔的密度接种。并分别将hiotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100μg/ml)，shotulin
‑
m2
‑
exos(浓度100μg/ml)以及pbs(对照组)加入进行干预。12小时后，光学显微镜下评估scmecs成管能力，测定管腔分支节点和小管数量。结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos组的scmecs成管能力明显高于对照组，但shotulin
‑
m2
‑
exos组成管能力明显下降(见图4f)。
91.实施例5、hiotulin
‑
m2
‑
exos
‑
水凝胶缓释系统构建及应用
92.构建小鼠脊髓挫伤模型，将hiotulin
‑
m2
‑
exos与光固化水凝胶(matrix gel，制备方法详见yi hong et al.nat com.2019.)混合，水凝胶中hiotulin
‑
m2
‑
exos的浓度为200ug/ml，避光条件下进行共孵育至少1h，形成外泌体
‑
水凝胶缓释制剂，于
‑
20℃避光保存。将hiotulin
‑
m2
‑
exos
‑
水凝胶缓释制剂加热到37
‑
40℃，使其处于水相，在损伤脊髓局部以敷料形式按照100ul/cm2覆盖外泌体
‑
凝胶缓释制剂，对照组则覆盖pbs
‑
凝胶制剂。于365
‑
405nm60mw/cm2条件下光照至少30s，使水凝胶从水相转变为固相，缝合伤口(见图5a
‑
b)。
93.实施例6、在实施例5基础上对hiotulin
‑
m2
‑
exos
‑
水凝胶缓释制剂在脊髓损伤后的小鼠体内进行示踪，用5μm荧光亲脂性染料dir标记hiotulin
‑
m2
‑
exos，深度麻醉小鼠，使用xenogen ivis成像系统检测红色荧光的荧光分布。结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos的荧光
可持续作用至28天，对照组则无荧光(见图6)。
94.实施例7、构建小鼠脊髓挫伤模型，sham组为假手术组，仅剥离椎板，不进行脊髓损伤，在损伤脊髓局部以敷料形式覆盖外泌体
‑
凝胶缓释制剂，对照组则覆盖等体积pbs
‑
凝胶制剂。对脊髓组织进行冰冻切片，利用cd31标记内皮细胞，免疫荧光分析发现hiotulin
‑
m2
‑
exos组在脊髓损伤后7天和28天，cd31

细胞面积明显高于对照组。表明hiotulin
‑
m2
‑
exos治疗后脊髓损伤部位的血管再生能力显著增强(见图7)。
95.实施例8、hiotulin
‑
m2
‑
exos
‑
水凝胶缓释系统应用后对脊髓损伤恢复的影响
96.实施例7基础上在脊髓损伤后1、3、7、14、21、28天使用bms(basso mouse scale)评分系统评估脊髓损伤后小鼠后肢的运动功能，一共10分，从0(完全瘫痪)开始到9(正常运动)分。由两名熟悉bms评分的研究者在实验设计中双盲观察每只小鼠5分钟。然后记录每只小鼠的平均得分。评估结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos治疗可显著改善小鼠脊髓损伤后的双下肢运动功能(见图8a)。
97.在脊髓损伤前以及损伤后1、3、7、14、21、28天使用hargreaves试验对小鼠后肢热刺激阈值进行检测。将小鼠放在薄玻璃板上适应1h。使后爪受到特定强度的红外辐射刺激，可移动红外热源上的光纤传感器用于测量撤爪阈值。阳性反应的定义如下：快速后爪抽出或突然舔后爪。评估结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos治疗可显著提高小鼠脊髓损伤后的双下肢热痛觉恢复(见图8b)。
98.在脊髓损伤前以及损伤后1、3、7、14、21、28天使用纤毛机械刺激针评估小鼠后肢在机械刺激下的撤爪时间。使用单根纤毛机械刺激针刺激小鼠后爪的足底中心区域，直到刺激针弯曲。阳性反应的定义如下：快速撤出后爪或突然舔舐后爪。在下一次试验中，如果反应显示为正/负，则纤毛机械刺激针更小/更大。在超过50％的试验中产生阳性反应的最小力被确定为最终阈值，进行记录。评估结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos治疗可显著提高小鼠脊髓损伤后的双下肢机械痛觉恢复(见图8c)。
99.在脊髓损伤前以及损伤后28天使用后肢运动诱发电位(mep)对小鼠后肢神经传导功能进行评估。麻醉小鼠后，将刺激电极置于颅骨表面对应大脑皮层运动区，记录电极插入对侧后肢胫骨前肌。刺激电极和记录电极之间的皮下组织用于插入参考电极。手术前(基线)和术后28天采集平均mep值(包括振幅和潜伏期)。评估结果表明，hiotulin
‑
m2
‑
exos治疗可显著提高小鼠脊髓损伤后双下肢的神经传导功能(见图8d)。

技术特征：
1.一种m2型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于，是由m2型骨髓巨噬细胞分泌得到的。2.根据权利要求1所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于，所述的外泌体含有特异性标志物，包括cd63、cd9和tsg101，并且高表达otulin蛋白。3.根据权利要求1所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于，分离并培养原代骨髓巨噬细胞，诱导为m2型巨噬细胞；用含有无外泌体血清的完全培养基孵育，利用差速离心法收集得到外泌体。4.根据权利要求3所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于，用pbs洗涤m2型巨噬细胞两次，并用含有无外泌体血清的完全培养基孵育24
‑
72小时，将孵育后的培养基500
‑
800
×
g离心8
‑
10分钟，3000
‑
4000
×
g离心20
‑
30分钟；4℃下10000
‑
12000
×
g离心30min
‑
1h后，用0.22μm过滤器过滤上清液，去除细胞和碎片，收集外泌体；将外泌体在100000
‑
140,000
×
g离心1.5
‑
3h后，在pbs中重悬，再在100000
‑
140,000
×
g离心1.5
‑
3h，获得高纯度m2型骨髓巨噬细胞外泌体。5.权利要求1
‑
4任一项所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体在制备脊髓损伤治疗制剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体制备成全身给药制剂或者局部给药制剂，或者局部外用制剂。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的局部外用制剂包括以光固化水凝胶为载体的外泌体
‑
光固化水凝胶缓释制剂。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的外泌体
‑
光固化水凝胶缓释制剂构建：将m2型骨髓巨噬细胞外泌体与光固化水凝胶混合，水凝胶中外泌体的浓度为100
‑
200ug/ml，避光条件下进行共孵育1
‑
2h，形成外泌体
‑
水凝胶缓释制剂，于
‑
20℃避光保存。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，外泌体
‑
凝胶缓释制剂使用时，将外泌体
‑
凝胶缓释制剂加热到37
‑
40℃，使其处于水相；在损伤脊髓局部以敷料形式按照80
‑
120ul/cm2覆盖外泌体
‑
凝胶缓释制剂，于365
‑
405nm 60mw/cm2条件下光照30s
‑
1min，使水凝胶从水相转变为固相，缝合伤口。10.一种脊髓损伤治疗制剂，其特征在于，包含权利要求1
‑
4任一项所述的m2型骨髓巨噬细胞外泌体。
技术总结
本发明公开了一种M2型骨髓巨噬细胞外泌体及其应用、脊髓损伤治疗制剂，属于脊髓损伤治疗技术领域。本发明高表达OTULIN蛋白的M2型骨髓巨噬细胞外泌体可以发挥改善脊髓损伤后局部缺血缺氧环境，促进血管再生的作用，更加利于神经再生以及局部组织的存活。通过与光固化水凝胶结合形成外泌体缓释系统应用于脊髓损伤局部，提高了外泌体治疗效率，避免了被肝肾代谢，并可持续缓释实现长时间作用，显著改善了小鼠脊髓损伤后的功能恢复。善了小鼠脊髓损伤后的功能恢复。


技术研发人员：罗子翔 彭伟 曹勇 胡建中 段春岳 吴天定 许琰 谢勇 刘煜东
受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院
技术研发日：2021.04.07
技术公布日：2021/6/29