鉴定D614G突变位点的特异性crRNA、体系、试剂盒及应用的制作方法

鉴定d614g突变位点的特异性crrna、体系、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于鉴定新冠病毒 d614g突变位点的特异性crrna、体系、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snps)是基因变异的最常见形式，与疾病状态或药物反应密切相关。最近的研究进一步表明，snps可以作为疾病诊断和预后的新一代生物标志物。同时，单核苷酸多态性在病毒进化及传播中发挥重要作用，并且对突变毒株的精准检测对疫病防控至关重用。因此，snp检测对于早期诊断，临床预后和疾病预防非常重要。迫切需要研究人员开发简单、快速和有效的技术，以允许在医疗现场进行敏感和选择性的基因分型和 snp定量。
3.目前，有多种方法可用于单核苷酸多态性基因分型，每种方法都有其优点和局限性。例如，基于核酸测序技术能准确鉴定snp，但该方法耗时长且需送到专业机构完成，无法在临床一线使用；基于等位基因特异性qpcr技术，虽然可以鉴定部分多位点突变，但对单位点突变检测准确性很低。此外，大多数现有方法灵敏度低或特异性差，有效的snp鉴别通常需要使用专门的设备，训练有素的人员以及严格的实验条件和精确的温度控制。另外，现有方法所存在的高耗时、高费用和高复杂性使得它们在资源受限的情况下得不到实际应用。因此，急需开发高准确性、快速、简便易用的核酸突变检测技术方案。
4.crispr
‑
cas(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，crisprs)是细菌中一种适应性免疫系统，cas蛋白通过rna 引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，crispr
‑
cas12通过引导rna 指导双链dna裂解单个ruvc催化结构域。cas12识别富含胸腺嘧啶(thymine，t)核苷酸的间隔区相邻基序(pam)，催化它们自身的指导crispr rna(crrna)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链dna(dsdna)。当cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链dna时，能诱导强大的非特异性单链dna(ssdna)反式切割活性。基于上述特性，科学家开发了基于cas12的快速、准确及灵敏的核酸检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鉴定新冠病毒d614g位点的特异性 crrna、体系、试剂盒及其检测方法，旨在对新冠病毒d614g位点的突变情况进行快速、准确的检测。
6.本发明是这样实现的，用于鉴定新冠病毒d614g突变位点的特异性crrna，该特异性crrna包括如seq id no：2、seq no：8、 seq no：9、seq no：10、seq no：11、seq no：12、seq no： 13、seq no：16、seq no：20、seq no：24、seq no：25和seqno：26所示的任一核苷酸序列。
7.本发明进一步公开了一种基于cas12荧光法构建的特异性检测体系，该体系包含用于鉴定新冠病毒d614g突变位点的特异性 crrna，该特异性crrna包括如seq id no：2、seq no：8、seq no：9、seq no：10、seq no：11、seq no：12、seq no：13、seq no： 16、seq no：20、seq no：24、seq no：25和seq no：26所示的任一核苷酸序列。
8.优选地，该体系包括以下组分：10*buffer 2μl、40u/μl rnaseinhibitors 1μl、200ng/μl cas12 protein 1μl、25pmol/μl dnareporter 1μl、1μm上述crrna 1μl、sample xμl、rna free h2o upto 20μl。在该体系中，sample包含新冠病毒d614g位点野生型和突变型基因片段dna作为模板转录对应的基因rna样品。
9.本发明进一步公开了上述特异性检测体系在鉴定新冠病毒 d614g突变位点中的应用。通过上述体系对新冠病毒d614g位点野生型和突变型基因片段dna作为模板转录对应的基因rna样品基于cas12荧光法进行扩增，对扩增产物在特定荧光下进行肉眼观察即可对新冠病毒d614g突变位点进行鉴定。
10.相应的，本发明进一步公开了一种新冠病毒d614g突变位点的鉴定方法，该方法包括以下步骤：往待检测体系中加入2μl buffer、 1μl浓度为40u/μl的rnase inhibitors、1μl浓度为200ng/μl的 cas12 protein、1μl浓度为25pm/μl的dna reporter、5μl sample、 1μl浓度为1nm/μl权利要求1所述的crrna和9μl h2o，混合均匀后于37℃反应15min，将反应产物置于在485nm激光灯下，肉眼观察获得结果。
11.优选地，该试剂盒包括等温扩增rpa引物对、阳性对照、阴性对照以及权利要求2所述的特异性检测体系。
12.优选地，所述等温扩增rpa引物对的序列为：
13.f4：5
’‑
ttcttttggtggtgtcagtgttataacaccagg
‑3’
；
14.r4：5
’‑
cctgtagaataaacacgccaagtaggagtaagt
‑3’
。
15.优选地，所述阳性对照、阴性对照为g614位点dna片段，所述阴性对照为d614位点dna片段。
16.本发明进一步公开了上述特异性检测试剂盒在鉴定野生型与突变型新冠病毒毒株中的应用。
17.相应的，本发明进一步提供一种野生型与突变型新冠病毒毒株的鉴定方法，该方法包括以下步骤：
18.(1)取5μl包含d614g位点rna样品、25μl 2*buffer、2μl rpa f4引物、2μl rpa r4引物和2.5μl乙酸镁混合均匀，于39℃进行 rt
‑
rpa预扩增30min，获得扩增产物rpa sample；
19.(2)在cas12检测体系中，取2μl buffer、1μl浓度为40u/μl 的rnase inhibitors、1μl浓度为200ng/μl的cas12 protein、1μl浓度为25pm/μl的dna reporter、5μl sample、1μl浓度为1nm/μl 权利要求1所述的crrna和9μl h2o混合均匀，于37℃反应15min，在485nm荧光灯下肉眼观察判定阴阳性结果。
20.本发明克服现有技术的不足，提供一种鉴定新冠病毒d614g位点的特异性crrna、体系、试剂盒及其检测方法。本发明公开了一系列用于鉴定新冠病毒d614g位点是否突变的特异性crrna，其序列为seq no.2，seq no.8到seq no.13，seq no.16，seq no.20 和seq no.24到seq no.26，并通过利用cas12特异识别核酸荧光检测技术，实现对新冠病毒d614g位点突变的核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。本发明检测原理为cas12荧光法，如图1 所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、检测成分设计制备和体系构建和荧光检测检测。本发明中所用crrna是通过独创引入特异人工突变，并进行大量筛选验证获得对d614g最优区分度的 crrna组合，本发明crrna有别于传统天然序列，是具有独创性及特异性的。
21.相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明采用cas12荧光法检测新冠病毒d614g位点突变技术方案，能对新冠病毒d614g位点突变情况进行快速检测，或者对野生型和突变型核酸序列进行快速区分诊断，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势；并且，检测结果可在包含荧光灯下肉眼直接可视检测，能实现方便快捷的结果判读，有效提高检测准确性和可信性；因此，本发明所具有的优势便于在基层实验和临床一线得到推广应用及普及。
附图说明
22.图1是本发明新冠病毒d614g位点鉴定方法的原理示意图；
23.图2是本发明实施例中筛选获得的针对新冠病毒d614g野生型和突变型特异性crrna；
24.图3是本发明实施例中筛选获得针对新冠病毒d614g核酸区段最优等温扩增rpa引物组合；
25.图4是本发明实施例中模拟检测验证本检测体系能有效区分新冠病毒d614g位点突变；
26.图5是本发明实施例中临床样品检测验证本检测体系能有效区分新冠病毒d614g位点突变。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中，rpa扩增试剂盒basic kit 购自twistamp公司；crrna体外转录盒子megashortscript t7transcription kit和纯化盒子megaclear kit购自ambion公司， rnase inhibitors、cas12 protein和dna reporter购自idt；常规试剂如tris
‑
base,nacl,tris
‑
hcl，mgcl2，bsa和甘油等购自thermo fisher 均采购自商业途径；检测用核酸片段、dna探针和rna合成由南京金斯瑞公司完成。
29.实施例1建立并筛选最优的突变检测体系
30.1、核酸制备
31.本实施例中，包含d614g位点突变的待检测核酸为新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的s基因片段，是参考ncbi mn938384.1毒株序列设计，由南京金斯瑞公司合成，命名为，对应序列分别为野生型seqno.27和突变型seq no.28。
32.2、针对sars
‑
cov
‑
2病毒d614g位点突变设计并制备特异性crrna
33.针对sars
‑
cov
‑
2特异性crrna制备按照如下方案进行，针对 sars
‑
cov
‑
2的d614g位点，设计包含识别序列tttn的靶向序列，设计23bp长度的crrna。针对野生型的命名为614d
‑
wt
‑
1到614d
‑
wt
‑
13；针对突变型的命名为614g
‑
mut
‑
1到614g
‑
mut
‑
13。设计完成后，制备crrna。crrna的制备，可交于南京金斯瑞公司合成 oligo，构建到载体puc57
‑
t7
‑
crrna，通过体外转录获得目的crrna，或可交由南京金斯瑞公司直接合成crrna序列对应的rna。
34.本发明筛选提供的sars
‑
cov
‑
2的针对sars
‑
cov
‑
2病毒d614g 位点突变的特异性crrna包括seq no.1到seq no.26，具体信息如表1所示：
35.表1针对sars
‑
cov
‑
2病毒d614g位点突变的特异性crrna
[0036][0037][0038]
3、本实施例中，针对sars
‑
cov
‑
2病毒d614g位点突变的特异性检测采用20μl体系如表2所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
[0039]
表2新冠病毒d614g位点突变的特异性检测体系
[0040][0041]
4、检测结果判定
[0042]
荧光显示肉眼直接判读检测中，检测体系依次加入2μl buffer、 1μl rnase inhibitors、1μl cas12 protein、1μl dna reporter、5μl sample、1μl crrna和9μl h2o。各组分混合均匀后于37℃反应 15min。其中，上述反应体系中rnase inhibitors浓度为40u/μl，cas12 protein为200ng/μl，dna reporter浓度为25pm/μl，crrna浓度为 1nm/μl。
[0043]
首先，依次检测针对sars
‑
cov
‑
2病毒核酸的crrna检测效率。在cas12检测体系中，各加入1μl crrna，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应15min，对上述反应产物进行后续结果检测判定。
[0044]
将上述cas12检测反应15min后产物，置于在485nm激光灯下，可由肉眼直接进行结果判读。当crrna特异性识别靶核酸片段后，反应产物颜色由无色变为荧光绿；对应的，如果待检测无对应靶核酸，反应产物颜色仍未无色。在cas12检测反应15min后，在荧光下进行肉眼判读，并拍照记录。
[0045]
5、检测结果及结论
[0046]
本实施例，结果如图2所示，成功建立基于cas12的针对新冠病毒d614g位点突变核酸检测体系，并成功筛选到能准确及灵敏检测鉴定新冠病毒d614g位点的特异性crrna，包括序列为seq no：2， seq no：8到seq no：13，seq no：16，seq no：20和seq no： 24到seq no：26。
[0047]
实施例2模拟检测野生型与突变型病毒毒株
[0048]
1、核酸制备
[0049]
通过体外转录制备新冠病毒sars
‑
cov
‑
2包含d614g位点基因片段对应的rna核酸样品。具体操作如下：使用megashortscript t7 转录试剂盒(thermo fisher scientific)，分别用以包含d614g位点野生型和突变型基因片段dna作为模板转录对应的基因rna样品 s
‑
rna
‑
614d和s
‑
rna
‑
614g。转录后的rna用megaclear试剂盒 (thermo fisher scientific)纯化，并通过乙醇沉淀法回收；检测转录后rna质量和浓度，并保存在
‑
80℃直至使用。
[0050]
2、设计并筛选等温扩增rpa引物
[0051]
为提高检测灵敏度，我们利用反转录重组酶聚合酶扩增(rt
‑
rpa) 对待检测区域
进行扩增，再进行cas12检测。根据等温扩增引物设计原则，围绕d614g位点设计一系列用于rpa扩增引物seq no：27 到seq no：37，如下表3所示，并筛选最优引物对。
[0052]
表3针对sars
‑
cov
‑
2病毒d614g位点rpa引物
[0053][0054]
3、模拟检测d614g位点突变
[0055]
本实施例模拟sars
‑
cov
‑
2的d614g位点突变检测，本检测使用体外转录rna样品s
‑
rna
‑
614d和s
‑
rna
‑
614g进行模拟验证。
[0056]
本案例中，取5μl包含d614g位点rna样品、25μl 2*buffer、 2μl浓度为40u/μl的rpa f4引物、2μl浓度为40u/μl的rpa r4 引物和2.5μl浓度为200ng/μl的乙酸镁混合均匀，于39℃进行 rt
‑
rpa预扩增30min，获得扩增产物rpa sample，扩增产物进行下一步核酸检测。在cas12检测体系中，取2μl buffer、1μl浓度为 40u/μl的rnase inhibitors、1μl浓度为200ng/μl的cas12 protein、 1μl浓度为25pm/μl的dna reporter、5μl rpa sample、1μl浓度为1nm/μl权利要求1所述的crrna和9μl h2o混合均匀，于37℃反应15min，在485nm荧光灯下肉眼观察判定阴阳性结果。
[0057]
4、检测结果及结论
[0058]
本实施例，结果如图3所示，成功筛选到针对新冠病毒d614g 位点区域高效等温扩增rpa引物组合f4和r4，即seq no：32和 seq no：37组合；结果如图4所示，成功模拟临床新冠病毒d614g 位点rna样品s
‑
rna
‑
614d和s
‑
rna
‑
614g的准确鉴定区分。
[0059]
实施例3临床样品验证有效区分鉴定野生型与突变型病毒毒株
[0060]
本实施例对临床组织样品的新冠病毒d614g位点核酸进行快速检测，本检测在合规实验室进行，并且所有操作合格按照有关法律法规和相关规定进行。
[0061]
本案例中，每个待检测样品取5μl进行rt
‑
rpa预扩增，步骤与实施案例2中相同，获得产物进行cas12检测。在cas12检测体系中，依次加入2μl buffer、1μl rnase inhibitors、1μl cas12 protein、1μl dna reporter、10μl rpa sample、1μl crrna。各组
分混合均匀，在37℃反应15min。在荧光灯下肉眼可有效对模拟临床阴阳性样品判定。
[0062]
本实施例，通过临床样品验证如图5所示，本发明中优选的针对新冠病毒d614g位点的crrna和等温扩增rpa引物组合，在cas12 荧光核酸检测体系能高效、准确、灵敏、便捷的检测并鉴定新冠病毒 d614g突变毒株，与测序结果一致。
[0063]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.用于鉴定新冠病毒d614g突变位点的特异性crrna，该特异性crrna包括如seq no：2、seq no：8、seq no：9、seq no：10、seq no：11、seq no：12、seq no：13、seq no：16、seq no：20、seq no：24、seq no：25和seq no：26所示的任一核苷酸序列。2.基于cas12荧光法构建的特异性检测体系，其特征在于，该体系包含上述权利要求1所述的特异性crrna。3.如权利要求2所述的特异性检测体系，其特征在于，该体系包括以下组分：10*buffer 2μl、40u/μl rnase inhibitors 1μl、200ng/μl cas12 protein 1μl、25pmol/μl dna reporter 1μl、1μm crrna 1μl、sample xμl、rna free h2o up to 20μl。4.权利要求2或3所述的特异性检测体系在鉴定新冠病毒d614g突变位点中的应用。5.一种新冠病毒d614g突变位点的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：往待检测体系中加入2μl buffer、1μl浓度为40u/μl的rnase inhibitors、1μl浓度为200ng/μl的cas12 protein、1μl浓度为25pm/μl的dna reporter、5μl sample、1μl浓度为1nm/μl权利要求1所述的crrna和9μl h2o，混合均匀后于37℃反应15min，将反应产物置于在485nm激光灯下，肉眼观察获得结果。6.基于cas12荧光法构建的特异性检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括等温扩增rpa引物对、阳性对照、阴性对照以及权利要求2所述的特异性检测体系。7.如权利要求6所述的特异性检测试剂盒，其特征在于，所述等温扩增rpa引物对的序列为：f4：5
’‑
ttcttttggtggtgtcagtgttataacaccagg
‑3’
；r4：5
’‑
cctgtagaataaacacgccaagtaggagtaagt
‑3’
。8.如权利要求6所述的特异性检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照、阴性对照为g614位点dna片段，所述阴性对照为d614位点dna片段。9.权利要求6～8任一项所述的特异性检测试剂盒在鉴定野生型与突变型新冠病毒毒株中的应用。10.一种野生型与突变型新冠病毒毒株的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)取5μl包含d614g位点rna样品、25μl 2*buffer、2μl rpa f4引物、2μl rpa r4引物和2.5μl乙酸镁混合均匀，于39℃进行rt
‑
rpa预扩增30min，获得扩增产物rpa sample；(2)在cas12检测体系中，取2μl buffer、1μl浓度为40u/μl的rnase inhibitors、1μl浓度为200ng/μl的cas12 protein、1μl浓度为25pm/μl的dna reporter、5μl sample、1μl浓度为1nm/μl权利要求1所述的crrna和9μl h2o混合均匀，于37℃反应15min，在485nm荧光灯下肉眼观察判定阴阳性结果。
技术总结
本发明公开了一种鉴定D614G突变位点的特异性crRNA、体系、试剂盒及应用。该特异性crRNA包括如SEQ NO：2、SEQ NO：8、SEQ NO：9、SEQ NO：10、SEQ NO：11、SEQ NO：12、SEQ NO：13、SEQ NO：16、SEQ NO：20、SEQ NO：24、SEQ NO：25和SEQ NO：26所示的任一核苷酸序列。在基于Cas12荧光法基础上构建包含上述特异性crRNA的特异性检测体系和特异性检测试剂盒，应用于新冠病毒D614G突变位点的鉴定、以及野生型与突变型新冠病毒毒株的鉴定，鉴定过程具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。优势。优势。


技术研发人员：刘明 王鑫杰 马培翔
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心）
技术研发日：2021.02.26
技术公布日：2021/6/29