青虾PDHE1基因及其编码蛋白和应用的制作方法

青虾pdhe1基因及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，涉及青虾的发育调控，具体为青虾pdhe1基因及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.青虾，学名日本沼虾(macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目(decapoda)、长臂虾科(palaemonidae)、沼虾属(macrobrachium)，广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2018年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过22万吨，年产值超过200亿元，是目前淡水养殖业中最有发展前途的品种之一。在青虾养殖过程中存在着显著的雌雄生长差异现象，即雄性青虾的生长速度显著快于雌性青虾，在收获季节，雄性青虾的个体大小为雌性青虾的2
‑
2.5倍，青虾全雄群体选育具有显著的经济价值以及应用前景。同时，性早熟是青虾生产过程中的另外一个主要问题，制约着青虾产业的可持续性发展。雄性青虾在生产过程中存在着性快熟的现象，精巢在幼虾变态后25天即可发育成熟，与其他全同胞家系的子代进行交配，近亲繁殖导致种质资源衰退，抗逆能力下降，上市虾个体偏小等问题。因此，全面了解青虾雄性分化以及发育机制，建立青虾性别选育以及性腺发育调控技术刻不容缓。
3.促雄腺是甲壳类动物特有的内分泌腺，其分泌的激素对甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持起重要的作用。先前研究结果表明，在雄性罗氏沼虾中拔除促雄腺，可诱使雄性罗氏沼虾分化出雌性特征；在雌性罗氏沼虾中植入促雄腺，可诱使雌性罗氏沼虾分化出雄性特征。精巢中表达的基因也已证明在甲壳动物雄性分化以及雄性特征维持方面起重要的作用。基于促雄腺和精巢在甲壳类动物雄性分化及发育过程中的重要作用，对促雄腺中表达基因的研究成为近些年来的热点。环境因素已证明可影响甲壳动物性别相关基因的表达，对甲壳动物性别分化和发育过程起调控作用。现已证明，主要的环境因素包括温度、光照以及营养物质等。本课题组从青虾繁殖季节和非繁殖季节促雄腺和精巢转录组文库中筛选得到编码pdhe1基因的mrna序列以及蛋白质序列。pdhe1基因的表达在繁殖期和非繁殖期精巢和促雄腺中的表达呈显著性差异，因此推测该基因可能参与青虾雄性分化和发育过程。pdhe1基因已证明参与糖异生和三羧酸循环(tca)过程，为靶组织提供能量支持。丙酮酸脱氢酶复合物(pdhc)在糖酵解途径中起重要作用。根据细胞的需要，葡萄糖通过糖酵解还原成丙酮酸，pdhc可催化丙酮酸的氧化脱羧反应成为tca循环所需的乙酰辅酶a。丙酮酸脱氢酶的缺乏导致丙酮酸不能转化为乙酰辅酶a，而是还原为乳酸，从而影响tca循环，导致atp生成减少。tca循环的异常导致代谢紊乱和组织损伤。因此，pdhc在维持动物正常代谢中起着重要作用。pdhc有三种不同组成的酶，分别是e1、e2和e3。丙酮酸脱氢酶e1(pdhe1)是pdhc的关键酶组分，位于pdhc三个组分中的第一个，催化丙酮酸氧化脱羧的限速步骤。pdhe1在小鼠中已证明参与精巢的发育过程。
4.rnai(rna interference,rnai)是一种广泛存在于真核生物中的高效的序列特异性基因剔除技术。rnai是由不同来源和长度的双链rna(double
‑
stranded rna,dsrna)前体
所诱发的，可以有效地抑制靶基因rna的翻译。近年开始在甲壳动物基因功能研究中使用。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供青虾pdhe1基因及其编码蛋白和应用。阐明了pdhe1基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了青虾pdhe1基因，其具有如下所示的序列：
8.(i)、如seq id no.1所示的核苷酸序列；或
9.(ⅱ)、与(i)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(i)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
10.(ⅲ)、与(i)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
11.(ⅳ)、与(i)、(ⅱ)或(ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
12.本发明还提供了青虾pdhe1基因编码的蛋白，其具有如下所示的序列：
13.(i)、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或
14.(ⅱ)、如(i)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
15.(iii)、与(i)或(ⅱ)所述序列至少有90％同一性的氨基酸序列。
16.基于上述研究，本发明还提供了所述的青虾pdhe1基因或所述的蛋白作为靶标在制备青虾精巢发育的抑制剂中的应用。
17.更重要的是，本发明还提供了所述的青虾pdhe1基因在促进青虾变态、雄性分化、性腺发育、正向调控iag基因的表达、全雄群体选育或雄性系统发育调控中的应用。
18.此外，本发明还提供了扩增所述青虾pdhe1基因的引物组，其具有如下所示的序列：
19.(i)、正向引物具有如seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列；
20.(ⅱ)、与(i)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
21.(ⅲ)、与(i)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
22.本发明还提供了扩增如权利要求1所述青虾pdhe1基因的引物组，其具有如下所示的序列：
23.(i)、荧光定量pcr正向引物具有如seq id no.7所示的核苷酸序列，荧光定量pcr反向引物具有如seq id no.8所示的核苷酸序列；
24.(ⅱ)、与(i)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
25.(ⅲ)、与(i)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
26.本发明还提供了所述青虾pdhe1基因的原位杂交探针组，其具有如下所示的序列：
27.(i)、正义原位杂交探针具有如seq id no.9所示的核苷酸序列，反义原位杂交探针具有如seq id no.10所示的核苷酸序列；
28.(ⅱ)、与(i)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
29.(ⅲ)、与(i)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
30.更重要的是，本发明还提供了dsrna，以所述的青虾pdhe1基因为模板转录获得。
31.此外，本发明还提供了所述的dsrna的引物组，其具有如下所示的序列：
32.(i)、正向引物具有如seq id no.11所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no.12所示的核苷酸序列；
33.(ⅱ)、与(i)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(i)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
34.(ⅲ)、与(i)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
35.基于上述研究，本发明还提供了所的dsrna在敲降青虾pdhe1基因的表达量、延缓青虾促雄腺发育、减少雄性激素的分泌量、延缓青虾精巢发育、促进雄性分化、促进青虾变态、促进性腺发育、正向调控iag基因的表达、全雄群体选育或雄性系统发育调控中的应用。
36.综上，本发明的有益效果包括但不限于：
37.(1)本发明所述青虾pdhe1基因在青虾雄性分化过程中的重要作用，为青虾雄性分化研究提供理论以及和思路；(2)本发明所述青虾pdhe1基因对青虾雄性系统的发育有正调控作用，参与青虾雄性雄发育机制，为青虾雄性分化研究提供理论以及和思路；(3)本发明所述pdhe1基因能够用于青虾全雄群体选育中，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景；(4)本发明所述亲虾pdhe1基因能用于青虾雄性系统发育调控，延缓雄性系统发育过程，包括精巢和促雄腺，降低种内自交的风险，延缓种质资源退化，提高青虾群体抗逆能力以及个体大小，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
39.图1示青虾pdhe1基因在不同成体组织中的相对表达量结果图；
40.图2示青虾pdhe1基因在不同发育时期过程中的相对表达量结果图，注：l：出膜后发育时期，pl:变态后发育时期；
41.图3示在雄性青虾中，外源性注射pdhe1
‑
dsrna后，对雄性青虾内源pdhe1基因的表达量的影响；
42.图4示在雄性青虾中，外源性注射pdhe1
‑
dsrna后，对雄性青虾内源iag基因的表达量的影响；
43.图5示在雄性青虾中，外源性注射pdhe1
‑
dsrna后，对青虾精巢发育的影响，注：sg:精原细胞；sc:精母细胞；s:精子；ct:连接组织；
44.图6示在雄性青虾中，外源性注射pdhe1
‑
dsrna后，对青虾促雄腺发育的影响，注：eb:结缔组织；i:促雄腺i期细胞；ⅱ:促雄腺ⅱ期细胞；ⅲ:促雄腺ⅲ期细胞；
45.注：各组数据之间，小写字母示具有显著差异(p＜0.05)，大写字母示具有及显著
差异(p＜0.01)。
具体实施方式
46.本发明公开了青虾pdhe1基因及其编码蛋白和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
47.本发明的一个目的是公开青虾pdhe1基因，pdhe1基因全长cdna序列如seq id no:1所示。seq id no:1序列如下：
48.ataacatgacacgcatacatagatgaagctgttgtgaacattatggtcttgatgctatgaacatattttttcccaggactaatttacgaataatcagttacctgccggcgagtggtgatggttatgtctttgcattgagccattctgttgcataacagttcgactattcgatagaacctttgctggttacgcattgccccttccagtaccgctggcaccaatagtgtttatacccggttgaaagtggccctccttataaataaaatgaccttaacggcaacgagggtcgcaaaacacatctcgggggtgttgacccgtagtttctccacaacaagagtagcagcaggtcaactcactgttcgtgatgctctcaattctgccctggatgaagaaatggagcgggatgaaggggtgttcctgatgggagaagaagtagcacagtatgatggtgcatacaaagtttctcgtggtctatggaagaagtatggagataagagggttatagatactccaattactgaatctggatttgctggcattgctgttggagcagccatggggggactccgaccagtttgtgaatttatgacattcaacttttcaatgcaagccattgatcatgtcatcaattctgcatcaaaaactttctacatgtcagctggtttgatccatgttcctattgtattccgaggcccaaatggagctgctgctggagtaggagctcagcattcccaatgttttggtgcctggtactcccactgcccaggccttaaggttgtttcaccttactcttctgaagatgctaagggtttgcttaaggctgccatccgtgattctgatcctgtagtagttctagaaaatgagataatgtacggtactgcgtttgatgtttccgatgaggttttgtcgaaggattttgtcattcctattggcaaggctaaaattgaacgaccaggtcatcatataactctagtggcacattcacgagctgtgctcttagcactggaggctgcaaaagcacttgctggtgagggagtggaatgtgaagtcataaatcttcgatctctaaggccattagatgaaggtgccattgttaactccgtaatgaagacacgaaaccttgttactgttgaacagggatggccacagtgtggtattggagctgagatctgtgctagaatagtagaaagtcctgccttccactacttggagtccccagtgattcgtgtaacgggtgttgatgtacctatgccttatgccaagagtttagaagctgcttgtatccctcaacaacatgatgttgtgaaagctgttaaaaaagtactcaagattataaagtaaagttgcacaaaacaaatatattctaaaaattttttttattaaaactgttttctttgtacatttgttggcataactcttgttaaggacaatttttagtgcatttgtaaattattgtgacaaatagaaatttaggcatatcagttttaagttagaacatacataccatatttcatataagtacattaatgttattgacagttcattgtagaaatgatgaaatagtaatggttacctattgtttggcagtgacctatcttgtattataaaaaaaaaaaa。
49.优选的，pdhe1基因全长cdna序列克隆的特异性正向引物为：
50.3pdhe1
‑
f1(seq id no:3)：ctgagatctgtgctagaatag；和
51.3pdhe1
‑
f2(seq id no:4)：cccagtgattcgtgtaacggg；
52.特异性反向引物为：
53.5pdhe1
‑
r1(seq id no:5)：tcaggaacaccccttcatccc；和
54.5pdhe1
‑
r2(seq id no:6)：tactcttgttgtggagaaact。
55.优选的，pdhe1基因的荧光定量pcr引物为：
56.pdhe1
‑
rtf(seq id no:7)：tgaccttaacggcaacgagg；
57.pdhe1
‑
rtr(seq id no:8)：tccagggcagaattgagagc。
58.优选的，pdhe1基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为(seq id no:9)：ccgtagtttctccacaacaagagtagcagcaggtcaac，反义原位杂交探针为(seq id no:10)：gttgacctgctgctactcttgttgtggagaaactacgg。
59.优选的，pdhe1基因的rnai实验引物为：
60.pdhe1
‑
rtf(seq id no:11)：taatacgactcactataggggtgctcttagcactggaggc；
61.pdhe1
‑
rtr(seq id no:12)：taatacgactcactatagggccaagtagtggaaggcagga。
62.本发明的另一个目的是提供由青虾pdhe1基因编码的蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。seq id no:2序列如下：
63.mtltatrvakhisgvltrsfsttrvaagqltvrdalnsaldeemerdegvflmgeevaqydgaykvsrglwkkygdkrvidtpitesgfagiavgaamgglrpvcefmtfnfsmqaidhvinsasktfymsaglihvpivfrgpngaaagvgaqhsqcfgawyshcpglkvvspyssedakgllkaairdsdpvvvleneimygtafdvsdevlskdfvipigkakierpghhitlvahsravllaleaakalagegvecevinlrslrpldegaivnsvmktrnlvtveqgwpqcgigaeicarivespafhylespvirvtgvdvpmpyaksleaacipqqhdvvkavkkvlkiik。
64.本发明的另一个目的是提供青虾pdhe1基因在调控青虾雄性分化过程中的应用。
65.本发明的另一个目的是提供青虾pdhe1基因在调控青虾雄性发育过程中的应用。
66.本发明的另一个目的是提供青虾pdhe1基因在青虾全雄群体选育中的应用。
67.本发明的另一个目的是提供青虾pdhe1基因在青虾雄性系统发育调控中的应用。
68.进一步的，本研究的目的就是通过用pdhe1
‑
dsrna注入雄性青虾体内，研究该基因在dsrna刺激下的表达变化，与iag基因的调控关系以及对精巢和促雄腺发育的影响，阐释dsrna对青虾精巢和促雄腺发育的调节机制，为利用pdhe1
‑
dsrna制备全雄群体以及干扰技术抗青虾精巢性快熟的实用化提供新思路和参考依据。
69.本发明提供的青虾pdhe1基因及其编码蛋白和应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
70.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
71.实施例1：青虾pdhe1基因全长cdna的获得
72.总rna提取：选取5只健康成熟的雄性青虾精巢，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。总rna的提取使用takara公司的rnaiso plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量，分光光度计分析该样品od260/280比值在1.8～2.0之间，并测定rna的浓度。
73.从青虾促雄腺转录组中获得pdhe1基因cdna中间片段序列。根据pdhe1基因cdna中间片段序列，设计特异性正向引物3pdhe1
‑
f1(seq id no:3)、3pdhe1
‑
f2(seq id no:4)；和反向引物5pdhe1
‑
r1(seq id no:5)、5pdhe1
‑
r2(seq id no:6)分别进行cdna 3’和5’快速扩增，操作步骤按takara 3
’‑
race和takara5
’‑
race试剂盒说明书进行。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。采用上海生工生物工程有限公司(sangon)的柱式dna胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pmd18
‑
t载体(takara)，并转化入大肠杆菌dh5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的几段产物进行拼接，得到青虾pdhe1基因全长cdna序列。经过序列比对显示，
青虾pdhe1基因与其他物种的同源性为75％，但覆盖度达到98％。其核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
74.实施例2：青虾pdhe1基因不同组织和不同发育时期表达
75.以seq id no:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用ncbi在线引物设计软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer
‑
blast/)设计制备青虾pdhe1基因的荧光定量pcr的引物(seq id no:7
‑
seq id no:8)。从健康成熟的青虾中获取精巢、卵巢、肝胰腺、肌肉、眼柄、腮、脑以及心脏等组织(n≥3)，并将组织保存在rna保存液中(takara)。从全同胞家系青虾幼虾中根据发育过程每隔5天分别取样(n≥3)。取按实施例1所述提取各组织总rna并使用iscripttmcdnasynthesis kit perfect realtime(bio
‑
rad)试剂盒将总rna反转成cdna，采用bio
‑
rad icycler iq5荧光定量pcr分析系统检测pdhe1基因在青虾各组织中的相对表达量。
76.如图1所示，青虾pdhe1基因在精巢中的表达量显著高于其他检测的基因，并且呈显著性差异(p<0.05),因此推测该基因可能在青虾精巢发育过程中起重要的作用。
77.如图2所示，总体来说，pdhe1基因在出膜后发育时期的表达量高于其在变态后后发育时期的表达量，这一研究表明，pdhe1基因在促进青虾变态过程起重要的作用。在变态后发育时期中，变态后发育第5天(pl5)的表达量最高，同时在pl25雄虾幼虾中的表达量显著高于雌性幼虾。通过组织学观察已经证明，变态后第5天到第25天为青虾性别分化和性腺发育的关键时期，这一研究结果表明，该基因在青虾雄性分化及其发育过程中起重要的作用。青虾全雄育种技术路线应该为通过基因编辑手段在雄性青虾中敲除雄性分化相关基因的表达，从而使雄性青虾性逆转成“假雌虾”(遗传特征为雄性，生理特征为雌性)，再用正常的雄性与“假雌虾”进行交配，从而获得青虾全雄群体。本发明专利已证明，pdhe1基因参与青虾雄性分化过程，为青虾雄性分化相关基因，可用于“假雌虾”的生产中，也为后续将该方法应用到全雄虾生产实践提供指导意义。
78.实施例3：青虾pdhe1基因dsrna的合成
79.以seq id no:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用ncbi在线dsrna引物设计软件(http://www.flyrnai.org/cgi
‑
bin/rnai_find_primers.pl)设计制备双链rna的引物(seq id no:11
‑
seq id no:12)，根据transcript aidtm t7 high yield transcription kit(fermentas,inc.,usa)试剂盒说明进行体外转录合成dsrna。将制备好的dsrna溶解在depc水中，测定其浓度并在1.5％琼脂糖凝胶上检测其纯度。将上述dsrna溶液以4μg/g的剂量注射到雄性青虾的围心腔内。对照组注射相同体积的gfp作为阴性对照。在注射后的第1、7、14天分别收集精巢和促雄腺样品(n≥3)，并将组织保存在rna保存液中(takara)用于pdhe1和iag基因表达量验证。同时在注射后的第1、4、7、10/14天分别收集精巢和促雄腺样品(n≥3)用于组织学切片观察。最后提取各样品的总rna并反转成cdna，采用real time pcr检测pdhe1和iag基因相对于对照组的表达量变化，以此来分析pdhe1基因干扰的效率以及是否与iag基因具有调控关系。组织学切片用于观察注射青虾pdhe1dsrna后，实验组精巢和促雄腺相较于对照组组织学变化。
80.如图3所示，相对于对照组的表达量，精巢中pdhe1基因的表达量在注射后第1天下降了14％，在第7天和第14天分别下降了96％和84％，这一结果表明，本发明专利优化的青虾pdhe1 dsrna可有效的敲降pdhe1在青虾中的表达量。
81.如图4所示，相对于对照组的表达量，促雄腺中iag基因的表达量在注射后第1天下降了15％，在第7天和第14天分别下降了49％和27％。iag基因在甲壳类物种中已证明，在甲壳类动物雄性分化以及雄性特征维持方面起重要的作用。这一结果表明，青虾pdhe1基因对iag基因具有正调控作用。
82.图5所示，在对照组精巢中，主要的细胞类型为精子，精原细胞和精母细胞的数量较少。相较于对照组，实验组精巢中精子的数量随着干扰时间的增加而减少，在干扰后的第14天，实验组精巢中基本观察不到精子的存在，而精原细胞和精母细胞的数量随着干扰时间的增加而增多，这一研究结果表明，外源注射的pdhe1
‑
dsrna可以有效的延缓青虾精巢发育过程，为解决青虾精巢性快熟这一生产难题提供了理论依据，也为后续将该方法应用到生产实践提供指导意义。
83.图6所示，在对照组促雄腺中，促雄腺i期细胞、促雄腺ⅱ期细胞、促雄腺ⅲ期细胞的数量大致相同，无显著性差异。相较于对照组，实验组促雄腺中促雄腺ⅲ期细胞的数量随着干扰时间的增加而显著下降，在干扰后的第14天，实验组促雄腺中促雄腺ⅲ期细胞的数量显著少于促雄腺i期细胞和促雄腺ⅱ期细胞的数量，组织学切片结果已表明，青虾促雄腺的发育对青虾精巢的发育具有调控作用。这一研究结果表明，外源注射的pdhe1
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dsrna可以有效的延缓青虾促雄腺发育过程，从而减少雄性激素的分泌量，延缓青虾精巢的过程，为解决青虾精巢性快熟这一生产难题提供了理论依据，也为后续将该方法应用到生产实践提供指导意义。
84.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.青虾pdhe1基因，其特征在于，其具有如下所示的序列：(ⅰ)、如seq id no.1所示的核苷酸序列；或(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)或(ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅳ)、与(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。2.青虾pdhe1基因编码的蛋白，其特征在于，其具有如下所示的序列：(ⅰ)、如seq id no.2所示的氨基酸序列；或(ⅱ)、如(ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或(iii)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述序列至少有90％同一性的氨基酸序列。3.如权利要求所述的青虾pdhe1基因或如权利要求2所述的蛋白作为靶标在制备青虾精巢发育的抑制剂中的应用。4.如权利要求1所述的青虾pdhe1基因在促进青虾变态、雄性分化、性腺发育、正向调控iag基因的表达、全雄群体选育或雄性系统发育调控中的应用。5.扩增如权利要求1所述青虾pdhe1基因的引物组，其特征在于，其具有如下所示的序列：(ⅰ)、正向引物具有如seq id no.3或seq id no.4所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列；(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。6.扩增如权利要求1所述青虾pdhe1基因的引物组，其特征在于，其具有如下所示的序列：(ⅰ)、荧光定量pcr正向引物具有如seq id no.7所示的核苷酸序列，荧光定量pcr反向引物具有如seq id no.8所示的核苷酸序列；(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。7.如权利要求1所述青虾pdhe1基因的原位杂交探针组，其特征在于，其具有如下所示的序列：(ⅰ)、正义原位杂交探针具有如seq id no.9所示的核苷酸序列，反义原位杂交探针具有如seq id no.10所示的核苷酸序列；(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。8.dsrna，其特征在于，以如权利要求1所述的青虾pdhe1基因为模板转录获得。9.如权利要求8所述的dsrna的引物组，其特征在于，其具有如下所示的序列：
(ⅰ)、正向引物具有如seq id no.11所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq id no.12所示的核苷酸序列；(ⅱ)、与(ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(ⅲ)、与(ⅰ)或(ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。10.如权利要求8所述的dsrna在敲降青虾pdhe1基因的表达量、延缓青虾促雄腺发育、减少雄性激素的分泌量、延缓青虾精巢发育、促进雄性分化、促进青虾变态、促进性腺发育、正向调控iag基因的表达、全雄群体选育或雄性系统发育调控中的应用。
技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了青虾PDHE1基因及其编码蛋白和应用。青虾PDHE1基因在青虾雄性分化过程中具有重要作用，为青虾雄性分化研究提供理论以及和思路；青虾PDHE1基因对青虾雄性系统的发育有正调控作用，参与青虾雄性雄发育机制，为青虾雄性分化研究提供理论以及和思路；PDHE1基因能够用于青虾全雄群体选育中，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景；青虾PDHE1基因能用于青虾雄性系统发育调控，延缓雄性系统发育过程，包括精巢和促雄腺，降低种内自交的风险，延缓种质资源退化，提高青虾群体抗逆能力以及个体大小，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景。巨大的应用前景。


技术研发人员：金舒博 傅洪拓 胡宇宁 乔慧 张文宜 蒋速飞 熊贻伟 龚永生
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
技术研发日：2021.03.25
技术公布日：2021/6/29