用于对虾饲料的芽孢杆菌及对虾饲料用发酵型中草药制剂的制作方法

1.本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种用于对虾饲料的芽孢杆菌及对虾饲料用发酵型中草药制剂。


背景技术：

2.近年来，病害始终是制约对虾养殖业健康发展的瓶颈问题，由于大量使用抗生素作为预防和治疗病害的重要技术措施，产生诸多负面影响，一方面由于长期使用，病原菌易产生抗药性，另一方面抗生素药残超标，严重危害人类健康。随着绿色水产养殖技术的发展，禁用“抗生素”势在必行，因此开发“绿色、安全、高效”中草药制剂成为替代抗生素的重要措施。
3.中草药是一种纯天然产品，我国有着极为丰富的中药资源，因其毒副作用小、不易产生耐药性、提高动物生理健康等优点被广泛应用。目前中草药添加剂多为粉剂或散剂等粗制品，加工深度不够，中药中的有效成分难以得到充分的吸收和利用，中药有效成分利用率较低，因此，如何有效的提高中草药的活性成分与生理功效已成为目前的研究重点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于对虾饲料的芽孢杆菌及对虾饲料用发酵型中草药制剂，该制剂使用复合芽孢杆菌发酵熟地、当归、白芍、川芎四种中草药，该种制剂安全可靠，绿色环保，能够显著提高水产动物生理健康水平；该饲料的制备方法简单可行，可以提高中草药的药效，提高中草药的利用率，节约成本，可大规模推行，进行工业化生产。可以改善对虾生理生化指标，提高对虾机体免疫力，增强抵抗病原菌能力，降低养殖风险，提高养殖收益。
5.为实现上述目的，本发明采用的具体技术方案为：用于对虾饲料的芽孢杆菌，其特征在于包括沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）；所述沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）保藏编号：cgmcc no. 22059，保藏日期：2021年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）保藏编号：cgmcc no. 22060，保藏日期：2021年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.所述的孢杆菌在制备对虾饲料用发酵型中草药制剂中的应用。
7.一种对虾饲料用发酵型中草药制剂，其特征在于该制剂是通过以下步骤制备而得到：（1）中草药的预处理：先将熟地、当归、白芍、川芎四种中草药置于烘箱中烘干24小时后，分别置于高速刀式多级粉碎机中粉碎，过60~100目筛后，使用电子天平精确称取上述
中草药，按比例混合后，装袋密封备用；所述的按比例混合是熟地、当归、白芍和川芎按质量份12
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20份：9
‑
25份：9
‑
12份：6
‑
10份的比例混合；（2）复苏菌种：将置于
‑
80℃超低温冰箱中的上述沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）按1%~5%的体积比分别接种量接种于2216e液体基中培养，在24~28℃，160~220rpm条件下，培养20~28h；使用平板菌落计数法计算活菌数目，当菌种复苏培养基中的活菌数达3.2
×
108~5.2
×
108cfu/ml时，停止活菌的培养；（3）中草药液体发酵培养基的配制：首先，取一定量步骤1得到的按比例混合的中草药，加入中草药质量4~6倍的纯水, 得到中草药溶液，分别向溶液中添加溶液质量分数4~6%的nacl，3~5%的 mgso4·
7h2o,，0.22~0.63%的kh2po4，2~4%的木薯粉，置入蒸汽灭菌锅中，121℃，灭菌35分钟，放置在超净工作台里冷却；然后再往冷却后的中草药溶液中添加其质量分数为0.12~0.34%的l
‑
谷氨酸，0.2~1.2%的vc（均已紫外杀菌消毒过），调节ph为6.8~7.4，配置好的溶液即中草药液体发酵培养基，将其在无菌条件下存放备用；（4）中草药发酵液的制备：将步骤2的沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）按照体积比为1:1~1:4的比例混合成为复合芽孢杆菌，以3%~11%接种于步骤3的中草药液体发酵培养基中，160~210rpm，26~32℃，培养28~36h，即得中草药发酵液；（5）有效成分提取：向获得的中草药发酵液里加入6~10倍质量的纯水，45℃低温浸提2.2~2.8h，低温浸提三次，合并这三次滤液；然后再往浸提后的药渣中加入2倍质量的纯水，浸提两次；合并5次滤液；（6）发酵中草药制剂的制备：将步骤5得到的滤液于45~55℃旋转蒸发，浓缩至粘稠状后，冷冻干燥24~32h即得发酵中草药制剂。
8.发酵前中草药中的5
‑
羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸和四物汤总多糖的含量分别为0.2387、2.3091、0.2531、69.6607 mg/g；而发酵后它们的含量分别为0.2862、3.1111、0.3363、109.7467 mg/g，与发酵前相比，各有效物质含量因发酵分别提高了19.86%、34.74%、32.88%、57.54%。
9.一种基于发酵中草药制剂的对虾饲料，其特征在于该对虾饲料是在基础饲料中添加所述的发酵中草药制剂，且每千克基础饲料中添加的发酵中草药制剂以质量分数计为0.2%—0.8%。
10.所述的对虾饲料，其特征在于每千克基础饲料中添加的发酵中草药制剂以质量分数计为0.2%、0.5%和0.8%。
11.所述的对虾饲料，其特征在于所述的基础饲料包括以下成分：以质量分数计鱼粉34%、豆粕20%、花生粕16.4%、小麦粉22%、大豆磷脂5%、复合维生素0.6%、复合矿物质2%。
12.所述的对虾用中草药发酵制剂能够显著提高对虾机体免疫力，提高对虾成活率，提高对虾体内的蛋白酶和脂肪酶水平，提高对虾肠道对虾肽的基因表达水平，综合提高对虾生理健康水平。
13.本发明的中草药发酵在适宜条件下，借助一种或者多种有益菌，利用其生物学转化制成的含有中药活性成分、菌体及其代谢产物的复合体，借助于微生物丰富的酶系，中草药发酵具有提高药效、提高中药利用率，能够产生新的活性物质等优势，，具有极广阔的应
用前景。
14.本发明的优点和有益效果：（1）药效提高。芽孢杆菌本身含有丰富纤维素酶、植酸酶等酶系，在温和的条件下，有强大的分解能力，能够快速破碎中草药细胞壁，将更多的有效成分释放出来，从而提高药效，节约中药用量，更好促进机体吸收中药有效成分。本专利通过发酵四种中草药，其有效物质成分5
‑
羟甲基糠醛、芍药苷、阿魏酸、四物汤总多糖的发酵提高率分别为：19.86%、34.74%、32.88%和57.54%。
15.（2）中草药和芽孢杆菌的协同作用。芽孢杆菌从对虾肠道筛选，易适应水生动物肠道内的环境，并且芽孢杆菌及其代谢产物能够提高对虾机体免疫力，促进水产动物生长发育。中草药可以促进益生菌生长增殖，产生更多的酶系破壁，释放更多中药活性物质，促进中药成分的吸收利用，相辅相成，符合我国“绿色养殖、生态养殖、健康养殖”的观念。
16.（3）能够提高凡纳滨对虾血细胞吞噬活性。当外来病原入侵对虾机体且直径小于10μm，会诱发血细胞的吞噬作用，血细胞的吞噬作用是对虾抵抗外来入侵的重要屏障。在投喂发酵中草药饲料添加剂的21天内，试验组对虾吞噬活力均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。
17.（4）能够提高凡纳滨对虾血浆的抗菌活性。抗菌活性反映了对虾机体对外来微生物的抵抗能力，是反应对虾机体免疫力强弱的一个重要表现。在投喂发酵中草药饲料添加剂的21天内，试验组对虾血淋巴的抗菌、溶菌活力均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。
18.（5）能够提高凡纳滨对虾的抗氧化性能。为了防止过多活性氧对机体造成损伤，甲壳动物有一套复杂而又有效的抗氧化防御系统来应对氧化应激。在投喂发酵中草药饲料添加剂的21天内，试验组对虾的总抗氧化能力（t
‑
aoc）均显著高于对照组（p<0.05）。
19.（6）能够提高凡纳滨对虾消化酶活性。消化酶活性的高低是评价养殖动物对营养物质消化能力的重要指标。在投喂发酵中草药饲料添加剂的21天内，试验组对虾肝胰腺中消化酶活性均显著高于对照组（p<0.05），而对照组无显著差异。
20.（7）能够提高凡纳滨对虾肠道对虾肽的基因表达水平。对虾肽是先天性免疫系统的一个重要组成。在投喂发酵中草药饲料添加剂的21天内，试验组对虾的对虾肽（pen）的基因表达水平均显著高于对照组（p<0.05）。
附图说明
21.图1为实施例2中对虾血细胞吞噬率的结果图。
22.图2为实施例2中对虾血浆抗菌活力的结果图。
23.图3为实施例2中对虾总抗氧化能力的结果图。
24.图4为实施例2中对虾肠道对虾肽3（pen3）基因表达的结果图。
25.图5为实施例2中对虾肝胰腺蛋白酶的结果图。
26.图6为实施例2中对虾肝胰腺脂肪酶的结果图。
具体实施方式
27.以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发
明的保护范围并不限于这实施例，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。其中，熟地、当归、白芍、川芎均为市售，沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（acillusstratosphericus）由中国海洋大学水产学院水产动物环境生理学实验室的研究人员在对虾肠道筛选而得，其中，沙福芽孢杆菌保存在中国普通微生物菌种保藏中心（北京），保存编号为22059；同温层芽孢杆菌保存在中国普通微生物菌种保藏中心（北京），保存编号为22060。
28.实施例1：对虾发酵中草药微生态制剂及养殖饲料的制备：首先制备发酵中草药有效成分。发酵中草药制剂由从凡纳滨对虾肠道筛选的沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（acillusstratosphericus）按照1:1~1:4（v:v）的比例混合成为复合芽孢杆菌，以3%~11%接种于中草药发酵培养基中。
29.所述中草药发酵培养基中的中草药成分按照重量份数记为熟地12
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20份，当归9
‑
25份，白芍9
‑
12份，川芎6
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10份。
30.具体制备方法如下：（1）先将熟地、当归、白芍、川芎四种中草药置于烘箱中烘干24小时后，分别置于高速刀式多级粉碎机中粉碎，过60~100目筛后，使用电子天平精确称取上述中草药，按比例混合后，装袋密封备用。
31.（2）复苏菌种：将置于
‑
80℃超低温冰箱中的沙福芽孢杆菌和同温层芽孢杆菌按1%~5%（体积比）接种量接种于2216e液体基中培养，在24~28℃，160~220rpm条件下，培养20~28h；使用平板菌落计数法计算活菌数目，当菌种复苏培养基中的活菌数达3.2
×
108~5.2
×
108cfu/ml时，停止活菌的培养。
32.（3）中草药液体发酵培养基的配制：首先，取一定量按比例混合中草药，加入于中草药质量4~6倍的纯水（g：ml）, 分别往里添加4~6% nacl（m:v），3~5% mgso4·
7h2o,，0.22~0.63% kh2po4，添加2~4%木薯粉，置入蒸汽灭菌锅中，121℃，灭菌35分钟，放置在超净工作台里冷却；然后再往灭菌过的培养基中添加0.12~0.34% l
‑
谷氨酸，0.2~1.2%vc（均已紫外杀菌消毒过），调节ph为6.8~7.4，配置好的液体培养基在无菌条件下存放备用。
33.（4）将沙福芽孢杆菌和同温层芽孢杆菌按照1:1~1:4（v:v）的比例混合成为复合芽孢杆菌，以3%~11%接种于中草药液体发酵培养基中，160~210rpm，26~32℃，培养28~36h，即得混合中草药发酵液。
34.（5）有效成分提取：将获得的中草药发酵液里加入6~10倍量的纯水，45℃低温浸提2.2~2.8h，低温浸提三次，合并这三次滤液；然后再往浸提后的药渣中加入2倍量的纯水，充分浸洗两次；合并5次滤液，45~55℃旋转蒸发，将滤液浓缩至粘稠状后，冷冻干燥24~32h即可获取发酵中草药中的有效成分。
35.按照上述的制备方法分别制备三种不同浓度的发酵中草药制剂及相应的养殖饲料，即在基础饲料中添加熟地、当归、白芍、川芎混合发酵后的有效成分，得到含有以质量分数计分别为0.2%、0.5%和0.8%的对虾饲料。
36.实施例2：对虾中草药发酵制剂对凡纳滨对虾生理健康功效的影响。
for lipase activity；pen（对虾肽）表达量的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：analysis of relative gene expression data using real
‑
time quantitative pcr and the 2
−
δδct method。
43.2 结果2.1 血细胞吞噬活性由图1可见：在投喂对虾发酵中草药免制剂的21天后，对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组（p<0.05），21天后，实验组六吞噬活性均显著高于未发酵中草药饲料组（p<0.05），实验组四、五的吞噬活性均高于未发酵中草药饲料组，但差异不显著（p>0.05）。
44.2.2 抗菌活性由图2可见：在投喂对虾发酵中草药制剂的21天后，饲喂发酵中草药饲料组（实验组五、六）的对虾的抗菌活力显著高于未发酵中草药饲料组（p<0.05）。低浓度发酵中草药饲料组（实验组四）的抗菌活力均高于未发酵中草药饲料组（实验组一、二、三）。
45.2.3 总抗氧化能力由图3可见：在投喂对虾发酵中草药制剂的21天后，对虾血浆的总抗氧化能力均显著提高（p<0.05），饲喂发酵中草药饲料组的对虾的总抗氧化能力均显著高于未发酵中草药饲料组（p<0.05）。
46.2.4 pen相对表达水平由图4可见：在投喂对虾发酵中草药制剂的21天后，均显著提高了对虾肠道的对虾肽基因的表达水平（p<0.05），实验组五、六的对虾肠道pen基因表达水平显著高于未发酵中草药饲料组（p<0.05），发酵中草药低浓度组（实验组四）的对虾肠道pen基因表达水平均高于未发酵中草药饲料组。
47.2.5 蛋白酶比活性由图5可见：在投喂对虾发酵中草药制剂的21天后，中高剂量组的对虾肝胰腺蛋白酶比活性均显著高于对照组（p<0.05），21天后，实验组四的对虾肝胰腺蛋白酶比活性均高于对照组，添加发酵中草药各组蛋白酶比活力均高于对照组及未发酵中草药组。
48.2.6 脂肪酶比活性由图6可见：在投喂对虾虾发酵中草药制剂的21天后，对虾肝胰腺脂肪酶比活力均显著高于对照组（p<0.05），21天后，实验组五、六脂肪酶比活力均显著高于未发酵中草药饲料组（p<0.05），发酵中草药低剂量组的脂肪酶比活力高于未发酵中草药高剂量组，但差异不显著（p>0.05）。
49.试验证明了本发明所提供的虾发酵中草药制剂一方面能够提高药效，促进中草药内有效成分析出，能够提高中药利用率；另一方面，本发明可以提高凡纳滨对虾的非特异性免疫能力，增强抗病力，可以在一定程度上减少养殖户损失。此外，本发明的中草药制剂安全、无毒，水产动物不会产生药物依赖性，符合我国“绿色养殖、生态养殖、健康养殖”的观念。

技术特征：
1.用于对虾饲料的芽孢杆菌，其特征在于包括沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）；所述沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）保藏编号：cgmcc no. 22059，保藏日期：2021年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）保藏编号：cgmcc no. 22060，保藏日期：2021年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.权利要求1所述的孢杆菌在制备对虾饲料用发酵型中草药制剂中的应用。3.一种对虾饲料用发酵型中草药制剂，其特征在于该制剂是通过以下步骤制备得到：（1）中草药的预处理：先将熟地、当归、白芍、川芎四种中草药置于烘箱中烘干24小时后，分别置于高速刀式多级粉碎机中粉碎，过60~100目筛后，使用电子天平精确称取上述中草药，按比例混合后，装袋密封备用；所述的按比例混合是熟地、当归、白芍和川芎按质量份12
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20份：9
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25份：9
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12份：6
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10份的比例混合；（2）复苏菌种：将置于
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80℃超低温冰箱中的权利要求1所述的沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）按1%~5%的体积比分别接种量接种于2216e液体基中培养，在24~28℃，160~220rpm条件下，培养20~28h；使用平板菌落计数法计算活菌数目，当菌种复苏培养基中的活菌数达3.2
×
108~5.2
×
108cfu/ml时，停止活菌的培养；（3）中草药液体发酵培养基的配制：首先，取一定量步骤1得到的按比例混合的中草药，加入中草药质量4~6倍的纯水, 得到中草药溶液，分别向溶液中添加溶液质量分数4~6%的nacl，3~5%的 mgso4·
7h2o,，0.22~0.63%的kh2po4，2~4%的木薯粉，置入蒸汽灭菌锅中，121℃，灭菌35分钟，放置在超净工作台里冷却；然后再往冷却后的中草药溶液中添加其质量分数为0.12~0.34%的l
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谷氨酸，0.2~1.2%的vc，调节ph为6.8~7.4，配置好的溶液即中草药液体发酵培养基，将其在无菌条件下存放备用；（4）中草药发酵液的制备：将步骤2的沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）和同温层芽孢杆菌（bacillus stratosphericus）按照体积比为1:1~1:4的比例混合成为复合芽孢杆菌，以3%~11%接种于步骤3的中草药液体发酵培养基中，160~210rpm，26~32℃，培养28~36h，即得中草药发酵液；（5）有效成分提取：向获得的中草药发酵液里加入6~10倍质量的纯水，45℃低温浸提2.2~2.8h，低温浸提三次，合并这三次滤液；然后再往浸提后的药渣中加入2倍质量的纯水，浸提两次；合并5次滤液；（6）发酵中草药制剂的制备：将步骤5得到的滤液于45~55℃旋转蒸发，浓缩至粘稠状后，冷冻干燥24~32h即得发酵中草药制剂。4.一种基于发酵中草药制剂的对虾饲料，其特征在于该对虾饲料是在基础饲料中添加权利要求3所述的中草药制剂，且每千克基础饲料中添加的发酵中草药制剂以质量分数计为0.2%—0.8%。5.如权利要求4所述的对虾饲料，其特征在于每千克基础饲料中添加的发酵中草药制剂以质量分数计为0.2%、0.5%和0.8%。
6.如权利要求4或5所述的对虾饲料，其特征在于所述的基础饲料包括以下成分：以质量分数计鱼粉34%、豆粕20%、花生粕16.4%、小麦粉22%、大豆磷脂5%、复合维生素0.6%、复合矿物质2%。
技术总结
用于对虾饲料的芽孢杆菌及对虾饲料用发酵型中草药制剂，上述发酵中草药制剂是由熟地、当归、白芍、川芎粉碎后按比例混合，接种3%~11%沙福芽孢杆菌和同温层芽孢杆菌混合（1:1~1:4）菌液，经适宜条件发酵而成。所述中药组分按照重量份数组成为：熟地12


技术研发人员：潘鲁青 王宇轩 苏晨 丁彦军
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2021.04.27
技术公布日：2021/6/29