reconstitution following allogeneic transplantation
″
.blood，125：2855
‑
2864(2015).
17.15.nashi et al，“the role of b cells in lupus pathogenesis”.int j biochem cell biol.42(4)：543
‑
550，(2010).
18.16.baker et al，“memory b cells are major targets for effective immunotherapy in relapsing multiple sclerosis”.ebiomedicine，16：41
‑
50，(2017).
19.17.hackett et al mol.ther.(2010)18(4)：674
‑
683.
20.18.macdonald kp et al，“biology of graft
‑
versus
‑
host responses：recent insights”.biol blood marrow transplant.19(1)：s10
‑
s14，(2013).
21.19.graham et al.
″
allogeneic car
‑
t cells：more than ease of access？
″
cells (2018)oct；7(10)：155.
22.20.xu y et al.
″
closely related t
‑
memory stem cells correlate with in vivo expansion of car.cs19
‑
tcells and are presented by il
‑
7and il
‑
15
″
.blood.(2014)；3750
‑
3760.
23.本文中对以上参考文献的承认不应被推测为意指这些参考文献以任何方式与本文公开的主题的可专利性有关。
24.背景
25.多种细胞疗法产品(自体的或同种异体的，特别是在癌症治疗中)是基于细胞的异种混合物作为原料的(watkins等人，2017；turtle等人，2016)。目前用于降低移植细胞群体毒性的分离和富集技术可能会产生更明确的最终产物，该最终产物由于耗尽技术的非选择性特性而缺乏一些所需的生物活性(lamb等人，2017)。这些分离技术利用了机械或表型特征，这些特征通常过于粗糙，并且不够灵敏，不足以区分细胞群体中的期望细胞和不期望细胞。需要一种新的方法来将用于制造基于细胞的产物的起始材料标准化，以获得具有明确生物活性的良好表征且可再现的最终产物。优选地，该方法将在用细胞产物治疗患者之前离体使用，以减少副作用并改善结果。
26.选择性耗尽细胞疗法的另一个主要目标，例如在自身免疫病治疗领域，是开发有效的治疗策略来降低活化潜能和促炎反应(baecher
‑
allan等人,2018)。
27.细胞疗法的另一个挑战是在再生医学领域，当起始材料是异质群体时，无效细胞正在降低细胞疗法产品的效力(mazar j,2009；knight,2010)。
28.在细胞疗法中难以使用异质群体的一个实例是嵌合抗原受体遗传工程化t(car
‑
t)细胞的情况。利用已被研究用于各种抗肿瘤治疗的car
‑
t细胞的过继性t细胞疗法(act)可以提供治疗若干癌症的有效方法，因为car
‑
t细胞可以被遗传工程化以特异性识别抗原性不同的肿瘤群体(参见例如locke等人,2017)。这些基于t细胞的疗法在临床试验中显示出对高度难治性b细胞恶性肿瘤的显著前景。然而，由于在大多数报告的试验中，患者接受了包含t细胞子集的随机组合物的t细胞产品，每个患者接受了不同的治疗剂，这可能影响了t细胞疗法的疗效，并使不同患者之间和跨试验的结果比较复杂化。riddle&maloney小组最近在all患者中的研究表明，与衍生自在表型组成上不同的未选择的t细胞的产物相比，由确定的t细胞子集产生的car
‑
t细胞产物可以提供均匀的效力。(turtle等人,2016；和sommermeyer等人,2016)。
29.car
‑
t细胞免疫疗法代表毒性管理的主要挑战。car
‑
t细胞疗法最常见的两种毒性是car
‑
t细胞相关脑病综合征(cres)和细胞因子释放综合征(crs)，其范围从轻度到危及生命，一系列炎症症状由细胞因子升高引起，通常在细胞施用的第一周内，并在1
‑
2周内达到峰值，并与t细胞活化和增殖有关(bonifant等人2016)。毒性的风险限制了car
‑
t细胞疗法的广泛应用。目前降低与car
‑
t细胞毒性相关的毒性的医学策略包括治疗后抗炎方式。例如，抗il6受体或il6受体拮抗剂和皮质类固醇，这两种方式都抑制炎症反应，并且因此在与细胞疗法相关的crs和cres的管理中是有效的。然而，缺点是这些治疗下调了免疫应答，并且它们阻止t细胞活化和取消临床益处的潜力令人担忧。毒性管理的挑战是控制症状而不损害疗效(bonifant等人,2016)。
30.另一个挑战是转导效率。转导效率受t细胞质量的影响。t细胞的活化是有效转导的先决条件，因为原代人类t细胞在体外是非分裂静止细胞。此外，接受化疗的患者的t细胞质量受到损害。t细胞功能障碍很常见，并且经常无法在制造过程期间完全逆转(graham等人2018)。
31.另一个挑战涉及治疗后免疫下调。有可能在进入抑制性肿瘤微环境时，car修饰的t细胞将变得无效。这在开发用于实体肿瘤的car
‑
t细胞疗法的尝试中尤为重要。肿瘤环境中的凋亡信号传导下调所有免疫效应细胞。
32.研究表明，在体内t细胞扩增、存活、持久性和抗肿瘤活性方面，成熟效应细胞诸如效应记忆t细胞(em)是比由早期分化、不太成熟的t细胞(主要是幼稚和中枢记忆(cm))制成的car
‑
t细胞有效性低的car
‑
t细胞(sommermeyer d,2016，和xu y,2014)。
33.wo2013/132477公开了用于选择凋亡信号传导抗性细胞的装置和方法，包括将免疫细胞群体暴露于凋亡诱导配体。
34.一般描述
35.在其第一个方面，本发明提供了一种用于产生富集非活化/非成熟细胞的细胞群体的方法，包括：
36.a.获得包含哺乳动物细胞的异质群体的生物样品；
37.b.将获得的哺乳动物细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导活性/成熟细胞的凋亡，而非活性/成熟细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集非活性/非成熟细胞的细胞群体。
38.在一种实施方案中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
39.在另一种实施方案中，所述哺乳动物细胞选自由免疫细胞和多潜能基质/间充质干细胞组成的组。
40.在一种实施方案中，所述非活性/非成熟细胞是免疫细胞。
41.在一种实施方案中，所述非活性/非成熟细胞是幼稚免疫细胞。
42.在一种实施方案中，所述容器包含生理溶液和/或生长培养基，和/或自体或非自体人类血浆。
43.在具体实施方案中，本发明提供了一种用于产生富集幼稚免疫细胞的细胞群体的方法，包括：
44.a.获得包含哺乳动物免疫细胞的异质群体的生物样品；和
45.b.将获得的哺乳动物免疫细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所
述接触诱导成熟细胞的凋亡，而幼稚细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集幼稚细胞的细胞群体。
46.在一种实施方案中，所述幼稚免疫细胞是幼稚t细胞或幼稚b细胞。
47.在另一种实施方案中，所述生物样品选自由动员的外周血细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、富集的cd3
t细胞、富集的cd4
或cd8
t细胞、富集的b细胞、脐带血细胞和骨髓细胞组成的组。
48.在一种实施方案中，所述免疫细胞对于患者是自体的或对于患者是同种异体的。
49.在一种实施方案中，所述容器包含生理溶液和/或生长培养基，和/或自体或非自体人类血浆。
50.在一种实施方案中，凋亡诱导配体被固定在容器的内表面上或容器中包含的珠或膜上。
51.在一种实施方案中，凋亡诱导配体选自由tnf
‑
α、fas配体(fasl)、trail和tweak组成的组。
52.在一种实施方案中，与凋亡诱导配体的所述接触步骤进行在约1小时至约48小时。
53.在一种实施方案中，所述接触步骤进行约2小时。
54.在一种实施方案中，所述凋亡诱导配体是fasl，并且其中所述fasl以约1ng/ml至约800ng/ml的浓度施用。
55.在一种实施方案中，fasl以约100ng/ml的浓度施用。
56.在一种实施方案中，fasl以约10ng/ml的浓度施用。
57.在一种实施方案中，所述成熟细胞是选自由t
h
1/t
c
1、t
h
17、t
scm
、t
cm
、t
em
和t
eff
细胞群体组成的组的成熟t细胞。
58.在另一方面，本发明提供了通过前述权利要求中任一项的方法制备的富集幼稚t细胞的细胞群体。
59.在一种实施方案中，所述富集幼稚t细胞的细胞的特征为ccr7
cd45ra
cd95
‑
lfa1
低
。
60.在另一方面，本发明提供了本发明的富集幼稚t细胞的细胞群体，用于在治疗癌症和自身免疫病中使用。
61.在另一方面，本发明提供了保持其活化潜能作为用于遗传修饰的先决条件的富集t细胞的细胞群体，用于在治疗癌症和自身免疫病中使用。
62.在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的自身免疫病的方法，包括向所述患者施用通过本发明的方法制备的富集幼稚t细胞的细胞群体。
63.在一种实施方案中，所述成熟细胞是选自由记忆和浆母细胞b细胞群体组成的组的成熟b细胞群体。
64.在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法制备的富集幼稚b细胞的细胞群体。
65.在一种实施方案中，所述幼稚b细胞的特征为cd27
cd38
。
66.在另一方面，本发明提供了本发明的富集幼稚b细胞的细胞群体，用于在治疗癌症、自身免疫病或炎性疾病中使用。
67.在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的自身免疫病的方法，包括向所述患者施用通过本文所述的本发明方法制备的富集幼稚b细胞的细胞群体。
68.在另一方面，本发明提供了治疗患有自身免疫病的方法，所述方法包括：
69.a.将包含t细胞和b细胞的哺乳动物免疫细胞的异质群体与凋亡诱导配体接触，其中所述接触降低所述t细胞和b细胞的活化水平；和
70.b.向有相应需要的患者施用步骤(a)中获得的所述细胞群体。
71.在另一方面，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，包括施用本发明的富集非成熟t细胞的细胞群体，其中所述细胞保持其抗癌活性。
72.在另一方面，本发明提供了一种用于产生car
‑
t细胞的方法，包括：
73.a.从生物样品分离单个核细胞；
74.b.通过使所述细胞与至少一种t细胞活化剂接触来活化所述细胞；和
75.c.用car构建体转导所述细胞；
76.其中所述方法还包括在活化步骤(b)之前和/或转导步骤(c)之后，使所述细胞与凋亡诱导配体接触，从而获得car
‑
t细胞。
77.在一种实施方案中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
78.在一种实施方案中，所述生物样品选自由外周血单个核细胞(pbmc)、富集的cd3
t细胞、富集的cd4
t细胞、富集的cd8
t细胞及其任何组合组成的组。
79.在一种实施方案中，所述细胞是pbmc。
80.在一种实施方案中，所述t细胞活化剂是抗cd3和抗cd28抗体。
81.在一种实施方案中，凋亡诱导配体选自由fasl、tnf
‑
α、trail和tweak组成的组。
82.在一种实施方案中，与凋亡诱导配体的所述接触步骤进行在约1小时至约48小时。
83.在一种实施方案中，所述接触步骤进行约2小时。
84.在一种实施方案中，所述凋亡诱导配体是fasl，并且所述fasl以约1ng/ml至约800ng/ml的浓度施用。
85.在一些实施方案中，fasl以约10ng/ml、50ng/ml或100ng/ml的浓度施用。
86.附图简述
87.为了更好地理解本文公开的主题并例示如何可在实践中实行本文公开的主题，现在将仅通过非限制性示例的方式，参考附图来描述实施方案，在附图中：
88.图1.是一组显示t细胞亚型表面上cd95(fasr)表达水平的图(图1a
‑
图1g)。用流式细胞术对来源于g
‑
csf动员的外周血细胞(mpbc)移植物的t细胞(cd3
)进行了表征。(a)cd3
细胞；(b)cd4
细胞；(c)各种cd4
亚型：幼稚、t干细胞记忆(t
scm
)、中枢记忆(cm)、效应记忆(em)、效应(eff)；(d)th1、th17亚型的成熟t细胞；(e)cd8
细胞；(f)各种cd8
亚型：幼稚、t
scm
、cm、em、eff；(g)tc1亚型的成熟t细胞。
89.图2.是一组图(图2a
‑
图2q)，显示(a
‑
g)，与mpbc对照相比，在fas
‑
l处理的mpbc中t细胞亚型群体百分比的基于免疫表型的分布。分析中排除了7aad
(坏死/晚期凋亡)细胞。(a)cd4
t辅助细胞(th)；(b)各种cd4
亚型：幼稚、t
scm
、cm、em和eff；成熟促炎性t细胞(c)th1(d)th17；(e)cd8
t细胞毒性(tc)；(f)各种cd8
亚型；(g)成熟促炎性t细胞：tc1；
90.(h
‑
n)是显示fas
‑
l处理的细胞的早期凋亡水平的图，通过使用膜联蛋白v
7aad
‑
染色的流式细胞术进行评价，并与对照mpbc进行比较。结果以具有一式三份的3组独立实验中代表性实验的平均值 sd表示。(h)cd4
细胞；(i)各种cd4
亚型：幼稚、t
scm
、cm、em、eff；(j)th1亚型的成熟t细胞；(k)th17亚型的成熟t细胞；(l)cd8
细胞；(m)各种cd8
亚型：幼稚、
t
scm
、cm、em、eff；(n)tc1亚型的成熟t细胞；
91.(o)和(p)是显示使用流式细胞术在fasl处理的辅助性t细胞(cd4
cd25
)(o)和细胞毒性t细胞(cd8
cd25
)(p)中测量的cd25受体(活化标志物)表达并与mpbc对照相比的图。(q)与mpbc对照相比，fasl处理后cd4
cd25
活化的辅助性t细胞中调节性t细胞(treg)(cd127
‑
)的百分比。平均值 sem，n＝11个独立移植物。使用非参数、配对student’s t检验进行统计分析；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001****p<0.0001。
92.图3.是一组显示fas
‑
l处理的t淋巴细胞响应于体外活化的活化减少的图。将从fas配体处理的动员的外周血细胞和对照细胞分离的t淋巴细胞以0.75
×
106个细胞/ml孵育，并用cd3/cd28活化珠以1:10珠:细胞的比率刺激24或48小时。使用流式细胞术在fas
‑
l处理的辅助性t细胞(cd4
cd25
高
)(a)和细胞毒性t细胞(cd8
cd25
高
)(b)中测量cd25
高
受体的表达，并与mpbc对照进行比较。(c)使用elisa测量fas
‑
l处理的细胞和对照细胞的ifnγ分泌。结果代表了两项独立的研究。数据被表示为平均值 sd，n＝3个重复。使用非配对的、参数t检验进行统计分析；(d)将fas
‑
l处理的人类mpbc(5x106个)移植到3组亚致死性辐射(2gy)nsg小鼠中，并与mpbc对照(n＝8
‑
10只/组)或媒介物(移植缓冲液，n＝2只/组)进行比较。在三个终止时间点(移植后3、7和14天)，脾中hcd3
t细胞的绝对数量(通过将流式细胞术检测的hcd3
t细胞百分比乘以从每个组织收获的细胞的绝对数量来计算)。(e)kaplan maier存活曲线(移植物抗宿主病(gvhd)存活曲线)。(f)移植后第14天血清ifn
‑
γ水平。结果代表了两项独立研究(n＝8
‑
10名接受者/组)。数据显示为平均值 sem。使用曼
‑
惠特尼检验进行统计分析；*p≤0.05,**p≤0.01,***p≤0.001,****p≤0.001。
93.图4.是一组图，显示fas
‑
l处理、随后成熟细胞群体的减少，在体外和体内都不影响移植物抗白血病活性。mpbc对照或fas
‑
l处理的mpbc对(a)u937(b)mv4
‑
11白血病细胞系的细胞毒性活性测定。将2x104个cfse标记的白血病细胞/孔在96孔板中培养，将扩增的t细胞(用抗cd3和重组il2培养12天)以白血病:t细胞的高比率加入。活的cfse
‑
白血病细胞在共培养24小时后通过facs进行评估。数据被表示为平均值 sd，n＝3个重复。(c)nod
‑
scid il2rγ
‑
无效(nsg)小鼠在第(
‑
1)天接受γ
‑
辐射(200cgy)，10x10^6个mv4
‑
11白血病细胞在第0天通过静脉(iv)团注施用。4
‑
6小时后，通过iv团注施用3x10^6个mpbc或fasl处理的mpbc。每周两次对动物评分。在移植后3周，通过流式细胞术在(d)脾、(e)骨髓和(f)血液中评估人类造血细胞移植物(cd45
cd123
‑
)和白血病负荷(cd45
cd123
)。数据以平均值
±
sem表示，n＝每组7只雌性nsg小鼠。两个独立实验中的一个的代表性结果。*p<0.05,**p<0.01对比媒介物处理组，以及#p<0.05,##p<0.01对比mpbc对照组(曼
‑
惠特尼检验)。
94.图5.是一组显示fas
‑
l处理在体外和体内对抗原呈递细胞(apc)
‑
b细胞和骨髓细胞的影响的图。(a)用流式细胞术测量mpbc对照细胞的fasr(cd95
)表达水平(n＝3)。(b)在fasl处理的mpbc中与对照mpbc相比，检测凋亡细胞百分比(膜联蛋白v
染色细胞，n＝8)和表达hla
‑
dr
hi
的细胞百分比(一式三份，n＝1)：(c)cd19
细胞的hla
‑
dr
百分比和(d)cd33
细胞的hla
‑
dr
百分比。(e
‑
l)对nsg小鼠移植fasl处理的mpbc或mpbc对照(5x106个总有核细胞(tnc)/小鼠)(n＝8
‑
10只/组)。在每个指定的终止时间点(第3/7/14天)，收集脾和骨髓，并在脾(e)和(f)以及骨髓(i)和(j)中检测b细胞和骨髓细胞的绝对数量。与mpbc对照移植小鼠相比，在用fasl处理的mpbc移植小鼠的脾(g)和(h)以及骨髓(k)和(l)中表达hla
‑
dr
hi
的b细胞和骨髓细胞的百分比。数据表示为平均值 sem。使用student’s t检验进行统计分析：
(b，配对，非参数)；(c，d非配对，参数)(e
‑
l，非配对，非参数)；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
95.图6.是一组显示b细胞亚型在g
‑
csf动员的pbc移植物中的分布、其对fasr的表达和对fas
‑
1诱导的凋亡的响应的图。(a)使用流式细胞仪测量g
‑
csf动员的外周血样品中b细胞亚型根据其成熟阶段(过渡/幼稚/记忆和浆母细胞)的fasr(cd95
)表达水平。(b)通过流式细胞术使用膜联蛋白v
7aad
‑
染色评价了fas
‑
l处理的mpbc中b细胞亚型的早期凋亡水平，并与对照mpbc进行比较。(c)fas
‑
l处理的mpbc和对照mpbc的b细胞亚型的免疫表型谱系分析。分析中排除了7aad
(坏死/晚期凋亡)细胞。数据表示为一式三份的平均值 sd。使用非配对、参数t检验进行数据分析；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
96.图7.是一组显示用递增剂量的fasl处理的外周血单个核细胞在不同处理后的图。用fasl孵育2h
‑‑
用不同浓度的fasl孵育单个核细胞2小时。用fasl孵育2h 活化48h
‑‑
单个核细胞用不同浓度的fasl孵育2小时，并且然后用抗cd3和抗cd28抗体活化48小时。活化48小时 用fasl孵育2小时
‑‑
用抗cd3和抗cd28抗体活化单个核细胞48小时，并且然后用fasl孵育2小时。(a)不同处理后的活cd3
细胞，(b)不同处理后表达cd25
的活化cd3
细胞(％cd3
/cd25
)，(c)cd3
细胞的早期凋亡(％cd3
/膜联蛋白v
)。
97.图8.是显示fas
‑
l对转导效率和对转导的t细胞存活率(通过总cd3
细胞群体中活的gfp
细胞的百分比来测量)的影响的图。在三个不同的细胞组中检查了两种浓度的fas
‑
l(50ng/ml和100ng/ml)，并与无fas
‑
l(0ng/ml)进行比较：一组在活化前接受fas
‑
l，一组在活化后接受fas
‑
l，并且一组在转导后接受fas
‑
l。标准car
‑
t是按照car
‑
t细胞制造的标准程序处理的细胞。
98.图9.是显示由暴露于其抗原mda
‑
mb
‑
231细胞刺激的erbb2
‑
car
‑
t细胞的ifn
‑
γ分泌(pg/ml)和gfp
表达测量的转导效率的图。1
‑
活化前fas
‑
l0ng/ml；2
‑
活化前fas
‑
l 50ng/ml；3
‑
活化前fas
‑
l 100ng/ml；4
‑
活化后fas
‑
l 0ng/ml；5
–
活化后fas
‑
l 50ng/ml；6
‑
活化后fas
‑
l 100ng/ml；7
–
转导后fas
‑
l 0ng/ml；8
–
标准car
‑
t；ut
–
对照未经处理的细胞。
99.图10.是一组图，显示转导后浓度为1、10和50ng/ml的fas
‑
l处理对car
‑
t细胞数量的影响，通过以下来测量：总cd3
细胞群体中活的gfp
细胞的％(a)及其活化状态(通过细胞群体中活的gfp
cd25
细胞的％来测量)(b)。图比较了cd3
细胞、cd8
细胞和cd4
细胞的结果。
100.图11.是一组图，显示了转导后添加的递增浓度的fas
‑
l(0、1、10、50ng/ml)对以下cd4
和cd8
t细胞亚型的影响：幼稚细胞、中枢记忆(cm)细胞、效应记忆(em)细胞和效应(eff)细胞。(a)活的cd8
转导细胞(gfp
cd8
)亚型的组成；(b)活的cd8
tc1细胞；(c)活的cd4
转导细胞(gfp
cd4
)亚型的组成。(d)活的cd4
th亚型th1和th17。所有的细胞在car
‑
t产生过程结束时即在fas
‑
l处理和il
‑
2恢复4天后进行分析。结果展示为一式两份的平均值 sd。
具体实施方式
101.本发明基于令人惊讶的发现，即免疫细胞的异质群体，例如从人类供体的g
‑
csf动员的外周血样品获得的细胞，暴露于凋亡诱导配体fas
‑
l，导致样品中存在的细胞的组成和活化状态的改变。特别是，受处理影响的细胞是成熟的、凋亡易感的t细胞亚型、b细胞和骨
髓细胞，所有这些细胞表达不同水平的fas(cd95)受体。
102.细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，可能由tnf超家族成员的特异性受体(包括例如fasl(术语fasl和fas
‑
l在本文中可互换使用)、tnfα、trail、tweak)介导。这些受体在多种细胞群体中表达，主要是在成熟的活化细胞中，其中这些特异性受体的表达与受控的细胞死亡相关，使它们成为凋亡易感细胞，而幼稚细胞是不敏感的。由于细胞内机制，尽管死亡配体受体表达，其他细胞类型可能对死亡配体诱导的凋亡具有抗性(kim等人2002)。对诱导的细胞死亡的不同敏感性可用作选择工具。
103.成熟的t细胞和b细胞表达fas受体，并且易受fas配体的凋亡效应的影响(sprent和tough,2001；strasser等人2009)。本发明提出的fas
‑
l处理使用这种fas
‑
fas配体机制来消除这些易受凋亡影响的反应性细胞(这些细胞在健康供体血液中处于稳定状态的较低水平，以及在自身免疫患者或炎性疾病患者的血液中处于较高水平)，并从而可以减少急性、不希望的促炎反应。
104.本发明的发明人证明，在g
‑
csf动员的外周血细胞中的t细胞中，辅助性t细胞(t
h
)(即cd4
细胞)比细胞毒性t细胞(t
c
)(即cd8
)表达更高水平的fas受体(fasr)，并且与幼稚t细胞相比，t
h
和t
c
细胞的成熟亚型(包括记忆和效应t细胞以及t
h
1/t
c
1和t
h
17细胞)以及t干细胞记忆(t
scm
)细胞表达广泛水平的fasr。
105.此外，发明人表明，在与凋亡诱导剂(例如fasl)一起孵育的g
‑
csf动员的外周血细胞中，cd4
t
h
细胞和cd8
t
c
细胞都发生显著减少。此外，fasl选择性地耗尽t
h
和t
c
细胞二者的特定亚型，即辅助性和细胞毒性t
scm
群体。
106.源于幼稚t细胞的t
scm
细胞是幼稚t细胞的一种特殊亚型。目前的研究表明，活化后，t
scm
进一步分化为记忆和效应t细胞，记忆和效应t细胞在t细胞重建和促炎响应中发挥重要作用(zhang等人2005,和roberto等人2015)。发明人示出t
scm
亚型表达高水平的fasr，并且因此是幼稚群体中最易受fas
‑
l测量影响的一部分。
107.除了t细胞，其他免疫细胞诸如b细胞和骨髓细胞也受到fasl处理的影响。
108.因此，本发明提供了一种通过将免疫细胞群体暴露于凋亡诱导配体来修饰混合细胞群体诸如免疫细胞群体以包含分化较低的免疫细胞(例如t细胞、b细胞和骨髓细胞)的方法。这种经修饰的免疫细胞群体可用于包括免疫细胞移植的任何方法中，其中从移植物消除凋亡易感细胞可通过减少凋亡易感细胞(例如t或b或骨髓细胞)的促炎反应来增加移植物的效用。
109.因此，在其第一个方面，本发明提供了一种用于产生富集非活化/非成熟细胞的细胞群体的方法，包括：
110.a.获得包含哺乳动物细胞的异质群体的生物样品；和
111.b.将获得的哺乳动物细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导活性/成熟细胞的凋亡，而非活性/成熟细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集非活性/非成熟细胞的细胞群体。
112.在一种实施方案中，所述哺乳动物细胞的异质群体是免疫细胞的群体。所述异质群体包括凋亡抗性和凋亡易感免疫细胞，包括凋亡易感t细胞和/或凋亡易感b细胞。
113.如本文所用，术语“凋亡易感t细胞”包括cd95
t细胞亚型，包括但不限于t
h
1/t
c
1、t
h
17、t
scm
、t
cm
、t
em
和t
eff
。在某些实施方案中，这些t细胞亚型由某些标志物的表达谱定义，如
下：
114.t
scm
(ccr7
cd45ra
cd95
lfa1
高
),
115.t
cm
(ccr7
cd45ra
‑
cd95
lfa1
高
),
116.t
em
(ccr7
‑
cd45ra
‑
cd95
lfa1
高
),
117.t
eff
(ccr7
‑
cd45ra
cd95
lfa1
高
),
118.t
h
1/t
c
1(cd3
cd4
cxcr3
),
119.t
h
17(cd3
cd4
ccr6
cxcr3
‑
)。
120.如本文使用的，术语“幼稚t细胞”包括cd95
‑
的细胞。在一种实施方案中，幼稚t细胞由以下表达谱定义：ccr7
cd45ra
cd95
‑
lfa1
低
。
121.如本文使用的，术语“凋亡易感b细胞”包括cd95
b细胞亚型，包括但不限于浆母细胞、记忆细胞、过渡或幼稚b细胞。在某些实施方案中，这些b细胞亚型由某些标志物的表达谱定义，如下：
122.b过渡(cd27
‑
cd38
)
123.b幼稚(cd27
‑
cd38
‑
)
124.b记忆细胞(cd27
cd38
‑
)
125.b浆母细胞(cd27
cd38
)
126.在一种实施方案中，所述容器由生物相容材料制成。在一种实施方案中，所述凋亡诱导配体被固定到容器的内表面。
127.根据另一种实施方案，所述凋亡诱导配体被固定到容器内存在的珠的表面。
128.根据另一种实施方案，容器选自由袋、柱、管、瓶、小瓶和烧瓶组成的组。
129.在一种实施方案中，凋亡诱导配体选自由tnf
‑
α、fas配体(fasl)、trail和tweak组成的组。
130.在具体的实施方案中，凋亡诱导配体是fas
‑
l。
131.现有的过继细胞疗法技术使用修饰的、活化的或工程化的自体细胞。基于自体的疗法的局限性之一是需要为每个个体患者生成肿瘤特异性淋巴细胞，这在技术上和经济上都具有挑战性。然而，同种异体过继移植面临着移植物抗宿主病(gvhd)的危险。预先选择施用的活化t细胞以减少引起gvhd的细胞，可以导致肿瘤特异性治疗，而没有肿瘤外损伤的风险。
132.因此，在一种实施方案中，本发明的方法可用于制备表达重组b细胞抗原受体的自体细胞群体，例如car
‑
t细胞移植，同时降低高水平释放细胞因子的风险。
133.在另一种实施方案中，本发明的方法可用于制备表达重组b细胞抗原受体的同种异体细胞群体，例如car
‑
t细胞移植，同时降低细胞因子高水平释放的风险，并且另外减轻gvhd的风险。
134.在另一种实施方案中，本发明的方法可用于减少具有自身反应性的引起炎症的细胞，诸如在t细胞介导的自身免疫性和炎性疾病中，包括但不限于多发性硬化(ms)、类风湿性关节炎(ra)、自身免疫性糖尿病、1型和2型糖尿病、sle(系统性红斑狼疮)、重症肌无力、进行性系统性硬化、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、原发性胆汁性肝硬化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、关节炎状况、关节发炎、湿疹、炎症性皮肤状况、炎症性眼病、结膜炎、胃灼热、炎症引起的组织坏死、特应性
皮炎、乙型肝炎抗原阴性慢性活动性肝炎、气道炎症、哮喘和支气管炎。
135.在一种实施方案中，本发明的方法可用于通过减少促炎性th1和th17群体来降低免疫活性，这两种群体已知会提高自身免疫性多发性硬化(ms)中的自身免疫反应(baecher
‑
allan等人,2018)。也就是说，根据本发明的一种实施方案，ms患者的外周单个核细胞被暂时去除，用凋亡诱导配体(例如fasl)处理，导致自身免疫负荷降低，并无自身反应克隆地(clean from autoreactive clones)重新移植到患者体内。
136.在另一种实施方案中，本发明的方法可用于减少自身免疫病诸如但不限于红斑狼疮(nashi等人,2010)、多发性硬化(baker等人,2017)中产生自身抗体的b细胞或b细胞抗原呈递。
137.在一种实施方案中，本发明的方法可用于在再生医学中使用祖细胞，诸如多潜能基质/间充质干细胞、神经祖细胞和内皮祖细胞，以改善由于施用选定群体而导致的结果。
138.在另一种实施方案中，本发明的方法可用于促进使用双脐带血作为造血干细胞移植的方法，即降低gvhd和一个脐带血单位的细胞对另一个的交叉攻击。
139.在另一种实施方案中，获得供体细胞的异质群体(例如，从健康、知情同意的干细胞供体的单采物获得的g
‑
csf(粒细胞集落刺激因子)动员的外周血细胞)。将细胞与凋亡诱导配体(例如fas配体)一起孵育。例如通过一个或更多个洗涤步骤从细胞培养物除去fasl。在一种实施方案中，不执行进一步的分离步骤。
140.在某些实施方案中，与凋亡诱导配体(例如fasl)的孵育可以在表面附着有fasl的装置中进行。
141.本发明公开了一种用于产生细胞群体的方法，凋亡易感细胞的特定亚型被从该细胞群体中耗尽。该方法使得能够从异质细胞群体中同时阳性选择支持移植的免疫细胞、期望的活性诸如抗肿瘤活性、支持组织再生的细胞和阴性选择具有有害作用诸如释放威胁生命水平的细胞因子的细胞、针对自身抗原的细胞、在引起移植物抗宿主病(gvhd)中起关键作用的细胞、具有引起炎症的特征或其他作用的细胞。
142.免疫细胞群体包括凋亡信号传导抗性细胞和凋亡信号传导敏感性细胞。该方法包括提供包含异质细胞群体的样品，将细胞与凋亡诱导配体一起孵育，从而从样品去除对凋亡更敏感的细胞(例如成熟效应细胞)，并富集凋亡信号传导抗性细胞(例如幼稚t或b或骨髓或cd34细胞或其他祖细胞)的群体。
143.描述了制备细胞群体的方法，所述细胞群体诸如遗传修饰的t细胞，例如表达嵌合抗原受体的t细胞，或一些其它活化的t细胞，并且具有较低的毒性和gvhd或其他毒性活性。该方法需要使细胞与凋亡诱导配体接触，例如在治疗性细胞制备的各个步骤期间，例如在培养和扩增表达重组抗原受体的t细胞群体之前或之后。
144.嵌合抗原受体(car)是一种重组生物分子，可特异性地结合靶细胞的细胞表面上存在的靶分子，例如b细胞上的cd19抗原。car分子的非限制性实例包括嵌合t细胞受体、人工t细胞受体或遗传工程化受体。这些受体可用于将单克隆抗体或其结合部分的特异性赋予所需细胞，例如t细胞。car可以结合抗原和转导t细胞活化，独立于mhc限制。因此，car是“通用的”免疫受体，可以治疗抗原阳性肿瘤的患者群体，而不论他们的hla基因型。使用表达肿瘤特异性car的t淋巴细胞的过继免疫疗法可以是用于治疗癌症的强有力的治疗策略。
145.car编码序列可以通过本领域已知的任何方法产生，尽管优选地使用重组dna技术
产生。编码嵌合受体的若干区域的核酸可以通过本领域已知的标准分子克隆技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。所得的编码区优选地插入表达载体，并用于转化合适的表达宿主细胞，优选地t淋巴细胞。使用病毒或非病毒转染载体将基因插入宿主基因组有若干可用的技术。例如，核酸可以注射穿过细胞的核膜直接进入细胞核中，或者使用病毒载体向细胞施用以产生遗传修饰的细胞。
146.用病毒载体转染是用于产生遗传修饰的细胞诸如t细胞的常用技术。这项技术被称为病毒转导。使用本领域熟知的方法，使用病毒诸如慢病毒或腺病毒或质粒作为载体，将核酸导入细胞。
147.外周血单个核细胞以及富集的t细胞群体(例如cd4 和cd8 t细胞)可以通过各种方法分离，用car表达载体转导，并通过本文所述的方法培养。
148.如本文使用的，术语“car
‑
t”或“car
‑
t细胞”是指用car构建体转导的t细胞。
149.如本文使用的，术语“car构建体”是指包含编码所需car的基因的载体，任选地还包含表达所述基因所需的另外核酸序列，并且任选地还包含编码用于增强car功能的辅助分子的另外组分。
150.如本文使用的，术语“单个核细胞(mononuclear cells)”是指任何具有圆形细胞核的血细胞。这些细胞由淋巴细胞(t细胞、b细胞、nk细胞)和单核细胞(monocytes)组成。术语“外周血单个核细胞”是指在外周血中发现的单个核细胞。
151.可以使用本领域熟知的方法从全血分离pbmc，例如使用ficoll(一种分离血液层的亲水性多糖)和梯度离心，其将血液分成具有血小板的顶层血浆、随后是一层单个核细胞和底层多形核细胞(诸如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞。
152.例如，可以通过梯度分离、淘析或亲和纯化从外周血分离t细胞。将细胞与凋亡诱导配体一起孵育，并且因此细胞群体向更不成熟的状态转移。然后，可以用例如指导car(例如cd19或her2特异性car)表达的sin慢病毒载体转导细胞。遗传修饰的t细胞可以在体外扩增，并且然后冷藏保存(cryopreserved)或新鲜提供以立即使用。可选地，t细胞可以用例如指导car(例如cd19或her2特异性car)表达的sin慢病毒载体转导，然后用凋亡诱导配体孵育细胞，并且从而细胞群体向更不成熟的状态转移。所选的遗传修饰的t细胞可以在体外扩增，并且然后冷藏保存或新鲜提供以立即使用。
153.如以下实施例所示，在用抗cd3/cd28抗体活化前，外周血单个核细胞暴露于fasl导致选择具有更高潜力被有效转导成car
‑
t细胞的细胞，如通过表达car的细胞的数量和通过这些细胞暴露于靶抗原时分泌的ifnγ水平测量的。
154.因此，在car
‑
t产生的程序期间(并且特别是在细胞活化步骤之前)暴露于fasl的步骤可以导致转导的改善，特别是但不限于自体car
‑
t移植的情形，其中转导效率受损，例如由于以前的化疗治疗。
155.此外，如以下实施例所示，转导后fasl处理可降低潜在的促炎性car t细胞及其活化状态。因此，转导步骤后暴露于fasl的步骤可导致减少细胞因子释放风暴，或减轻同种异体car
‑
t移植情形中gvhd的发展。
156.因此，在本发明的多个方面的另一个方面，提供了一种用于产生car
‑
t细胞的方法，所述方法包括：
157.a.从生物样品分离单个核细胞；
158.b.通过将细胞与t细胞活化剂(例如抗cd3/cd28抗体)接触来活化所述细胞；
159.c.用car构建体转导所述细胞，
160.其中所述方法还包括在活化步骤(b)之前和/或转导步骤(c)之后，使所述细胞与凋亡诱导配体接触，从而获得car
‑
t细胞。
161.在某些实施方案中，所述方法导致获得改进的转导效率。在某些实施方案中，所述方法在同种异体car
‑
t移植的情况下导致患者细胞因子释放风暴减少或gvhd减少。
162.在一种实施方案中，所述分离的单个核细胞是外周血单个核细胞。在一些实施方案中，所述单个核细胞富集cd3
、cd
4
和/或cd8
t细胞。
163.在一种实施方案中，所述活化步骤(b)进行约1
‑
3天的时间段。在一种具体实施方案中，所述活化步骤进行约48小时(2天)。
164.本文使用的术语“转导(transduction)”或“转导(transducing)”是指通过载体将car构建体转移到t细胞中、导致car转录物整合到细胞中的方法。常见的技术使用病毒感染、病毒载体、电穿孔、原生质体融合、转座子/转座酶系统(参见例如hackett等人(2010))和化学试剂来增加细胞渗透性，例如磷酸钙转染。常用于基因治疗的病毒有例如腺病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒或慢病毒。
165.当根据说明书阅读时，本文公开内容中的术语应该给出它们的平实和普通含义。鉴于整个说明书，本领域技术人员将理解所使用的术语。
166.如本文使用的，“一个(a)”或“一个(an)”可以指一个或一个以上。
167.如本文使用的，术语“约”表示值包括误差的固有变化，例如10％的变化。
168.实施例
169.实施例1：fasl处理对不同的t细胞亚型有不同的作用
170.该实验用从健康、知情同意的干细胞供体的单采物获得的g
‑
csf(粒细胞集落刺激因子)动员的外周血细胞(mpbc)样品进行。供体在白细胞单采术前接受4
‑
5天的g
‑
csf(10
‑
12μg/kg/天)。细胞用含有edta的缓冲液进行两次洗涤步骤，并以100
±
20x106个细胞/ml的浓度用含有浓度为100ng/ml的重组人类fas配体(mega fasl,adipogen)的cellgro scgm培养基(cellgenix)在37℃，在增湿的5％co2的培养箱中孵育2小时。与fasl一起孵育后，对细胞进行两个另外的洗涤步骤以除去未结合的fasl。没有进行进一步的分离步骤。对照非处理样品由来自同一供体的原始未处理mpbc组成。
171.t细胞亚型的免疫表型分析通过使用下列抗体的流式细胞术(miltenyi)来进行：cd4、cd8、ccr7、cd45ra、lfa1、cd95、cxcr3和ccr6。使用流式细胞仪(macsquant,miltenyi)从样品获得数据(图1)。根据其受体表达确定了以下群体：辅助性t细胞(t
h
，cd4
)，细胞毒性t细胞(t
c
，cd8
)，其亚型：幼稚t细胞(ccr7
cd45ra
cd95
‑
lfa1
低
)、t
scm
(ccr7
cd45ra
cd95
lfa1
高
)、t
cm
(ccr7
cd45ra
‑
)、t
em
(ccr7
‑
cd45ra
‑
)、t
eff
(ccr7
‑
cd45ra
)、t
h
1/t
c
1(cxcr3
)、t
h
17(ccr6
cxcr3
‑
)。分析这些t细胞亚型表面上fasr(cd95)的表达水平。
172.图1中描述的fasr(cd95)表达谱显示，辅助性t(t
h
)细胞(cd4
)比细胞毒性t(t
c
)细胞(cd8
)表达更高的水平，并且与幼稚t细胞相比，t
h
和t
c
细胞二者的成熟亚型(包括记忆和效应t细胞、以及th1/tc1和th17细胞)以及t
scm
细胞表达广泛水平的fasr。
173.实施例2：t细胞亚型的群体百分比和凋亡
174.在收集后24小时内从健康供体的单采物获得的g
‑
csf mpbc样品，在封闭的输注袋
系统中与fas配体一起或不与fas配体一起孵育。简而言之，对细胞进行计数，用含有edta的缓冲液洗涤两次，以在cellgro scgm培养基(cellgenix)中100
±
20x106个细胞/ml的浓度在浓度为100ng/ml的凋亡介质fas配体(megafasl,adipogen)的存在下在37℃、在增湿的5％co2的培养箱中孵育2小时，然后洗涤两次以除去未结合的fasl。t细胞从与fas配体一起孵育后的mpbc或对照mpbc使用磁性人类t细胞分离珠(easysep,stemcell,17951)根据制造商的方案分离。分离的t细胞亚型的免疫表型分析通过使用下列miltenyi ab的流式细胞术来进行：cd4、cd8、ccr7、cd45ra、lfa1、cd95、cxcr3和ccr6。使用流式细胞仪(macsquant,miltenyi)从样品获得数据。根据其受体表达确定了以下群体：辅助性t细胞(t
h
,cd4
)、细胞毒性t细胞(t
c
,cd8
)、幼稚t细胞(ccr7
cd45ra
cd95
‑
lfa1
低
)、t
scm
(ccr7
cd45ra
cd95
lfa1
高
)、t
cm
(ccr7
cd45ra
‑
)、t
em
(ccr7
‑
cd45ra
‑
)和t
eff
(ccr7
‑
cd45ra
)、t
h
1/t
c
1(cxcr3
)、t
h
17(ccr6
cxcr3
‑
)。此外，使用膜联蛋白v染色(ebiosciences bms500fi)和7aad(ebiosciences 00
‑
6993)染色评估t细胞亚型的凋亡和坏死水平，其中膜联蛋白v
7aad
‑
细胞被定义为早期凋亡，并且所有7aad
细胞被认为是晚期凋亡/坏死细胞，并被排除在活细胞分析之外。
175.fasl处理选择性地耗尽辅助性和细胞毒性t细胞子集二者。从图2a
‑
图2g可以看出，在与fasl一起孵育后，辅助性和细胞毒性t
scm
细胞和t
em
细胞的百分比降低。此外，t
h
17、t
h
1和tc1细胞的百分比由于与fasl一起孵育而显著降低：fasl处理优先诱导t
h
1、t
c
1和t
h
17群体凋亡(分别为45％、48％和92％，p<0.0001)，而幼稚t
h
和t
c
细胞受影响较小。
176.如图2a
‑
图2g所示并如下面将进一步阐述的，与凋亡诱导剂(fasl)一起孵育的mpbc显示cd4
t
h
细胞(10.7％，p<0.001)和cd8
t
c
细胞(14.0％，p<0.05)二者显著减少。此外，fasl选择性地耗尽t
h
和t
c
细胞二者的特定亚型。本文提供的结果进一步证明了辅助性(23.2％，p<0.01)和细胞毒性(41.8％，p<0.01)t
scm
群体的统计学显著减少。
177.结果表明，暴露于凋亡诱导配体fas
‑
1选择性地耗尽辅助性t(t
h
)细胞：记忆性t
h
细胞子集减少，而在幼稚t
h
中，只有一小部分细胞表达fasr(即t
scm
子集)，并且该特定子集受到凋亡攻击的影响。此外，显示暴露于fas
‑
l优先地诱导促炎th1、tc1和th17群体的凋亡(图2h
‑
图2n)。
178.不希望被理论所束缚，这些结果表明，与凋亡诱导配体fas
‑
l一起孵育导致凋亡易感的成熟辅助性t细胞的消除，留下较低分化状态的亚群。
179.此外，用fasl预处理还显著降低了效应记忆辅助性t(th
em
)亚型以及效应记忆细胞毒性t(tc
em
)和效应(tc
eff
)亚型(分别是26.0％,p<0.0001,16.4％,p<0.01；13.6％,p<0.01)，而在幼稚的tc亚型中没有效果，并且在幼稚的th细胞中仅显示出轻微的减少(6.0％,p<0.01)。此外，与mpbc对照相比，促炎性成熟t细胞th1、tc1和th17的水平显著降低(分别为55.1％、47.9％和91.8％，p<0.0001)。除了每种t细胞亚型的活群体百分比降低之外，fasl处理后早期凋亡水平也显示增加。图2h
‑
图2n显示cd4辅助性t细胞(th)早期凋亡水平增加1.93倍(p<0.05)，以及cd8细胞毒性t细胞(tc)早期凋亡水平增加2.48倍(p＝0.08)。此外，与mpbc相比，th和tc二者的tscm(2.00倍，p<0.01；2.42倍，p<0.01)，cm(1.87倍，p<0.01；3.78倍，p<0.001)和em(2.89倍，p<0.01；6.09倍,p<0.01)亚型中的早期细胞凋亡水平分别显著升高，而幼稚t细胞的早期凋亡水平没有变化。此外，与mpbc对照相比，促炎性成熟t细胞th1、tc1和th17的早期凋亡水平显著升高(分别是3.6倍，p<0.01；3.4倍，p<0.05和11.4倍，p<0.01)。在图2o
‑
图2q中，表达cd25活化标志物的辅助性和细胞毒性t细胞的百分
比显著降低。已知cd25受体在t细胞活化期间上调。此外，负责抗炎反应的调节性t细胞(treg)在总cd25
辅助性t细胞中的比例显示出显著升高。
180.总的来说，这些数据表明，与目前使用的完全t细胞耗尽方法不同，fasl预处理选择性地耗尽特定亚群，并减少活化。因此，并且不希望受到理论的束缚，看起来用凋亡诱导配体诸如fasl处理导致凋亡易感性成熟t细胞的消除，留下分化状态较低，较不活化并维持抗炎性的t细胞亚群。
181.实施例3：fas
‑
l预处理的t细胞亚型响应于体外活化的活化减少
182.接下来，在活化的t细胞亚型中评价cd25受体(细胞活化的标志物)的表达水平。从fasl预处理的mpbc和mpbc对照分离t细胞，并与抗cd3/cd28活化珠一起孵育1或2天。如图3a
‑
图3b所示，并且与上述结果一致，活化后第1天和第2天，与对照t细胞相比，表达cd25
高
的fasl预处理的cd4
细胞(分别为39.7％和24.3％；p<0.05和p<0.001)和cd8
细胞(分别为53.3％和33.9％；p<0.01和p<0.001)显著减少。此外，与mpbc对照t细胞相比，在孵育后的第1天和第2天，图3c中显示的促炎细胞因子ifnγ分泌显著降低(分别为56.1％，p<0.05和52.1％，p<0.001)，表明fasl预处理的t细胞的活化状态较低。图3d
‑
图3f的结果显示在gvhd小鼠模型中炎症减轻。用fas
‑
l处理的或对照mpbc移植经γ
‑
辐射的il2rγ
‑
空(nsg)小鼠。在移植后的第3、7和14天，从移植了fasl处理的mpbc的小鼠获得的脾中cd3
t淋巴细胞的绝对细胞数减少(图3d)。在mpbc移植组，gvhd的进展是致命的，移植后第28天以后没有小鼠存活。相比之下，移植fasl处理的mpbc显著延长了小鼠的生存期(p<0.0001)，因为在60天的随访期间没有发现动物死亡(图3e)，并且与在mpbc对照小鼠的血清中检测到的高水平ifnγ相比，在第14天的血清中没有检测到ifnγ细胞因子(图3f)。这些结果支持图2所示的结果，其中，fasl处理的mpbc显示，t细胞亚型的较低分化和较低活化谱，导致刺激后活化减少。
183.在这些实验中，将来自mpbc对照和与fas
‑
l一起孵育的mpbc的分离的t细胞计数并以0.75
×
106个细胞/ml在rpmi完全培养基(补充有10％fcs、1％l
‑
谷氨酰胺、1％pen
‑
strep、1％非必需氨基酸和1％丙酮酸钠)中孵育，并使用活化珠(dynabeads
tm
人类t
‑
活化剂cd3/cd28 gibco 111.32d)以1:10的珠:细胞比率刺激24/48小时。为了分析t细胞亚型，用上述实施例2中描述的所有ab对细胞进行染色。此外，进行流式细胞术分析用于cd25活化受体表达。此外，使用elisa的ifnγ细胞因子分泌也根据制造商的方案(r&d systems,quantikine elisa试剂盒dif
‑
50)进行。
184.重要的是要注意，如上数据所示，凋亡易感性成熟细胞的消除以及活化状态的降低不会影响t细胞群体的其他属性。图4显示，mpbc的fasl处理不影响移植物抗白血病活性(参见下面实施例4中的细节)。
185.实施例4：fasl处理在体外和体内不影响移植物抗白血病细胞毒性活性
186.fas
‑
l处理的mpbc或对照细胞通过在24孔板中以1x10^6个细胞/ml的浓度在补充30μg/ml抗cd3(ebioscience,16
‑
0037,okt3)和1000u/ml重组il2(hr
‑
il
‑
2r&d systems,202il
‑
500)的完全rpmi培养基(含有10％fcs、1％l
‑
谷氨酰胺、0.2％β
‑
巯基乙醇、1％pen/strep、1％丙酮酸钠和1％非必需氨基酸)中孵育而扩增。在第4天，用完全新鲜的培养基(含有抗cd3和il
‑
2)替换培养基，并且计数细胞，并将细胞以5x10^6个细胞/ml重新接种在6孔板中。对细胞进行计数，并且每隔一天更换培养基。在扩增的第12天，将两种不同类型的白血病细胞系mv4
‑
11和u937细胞用2μm cfse(ebioscience,65
‑
0850)标记，并以2x10^4/100μ
l接种在96孔板的完全rpmi中。
187.将扩增的fas
‑
l处理的mpbc或对照细胞洗涤、计数，并以高浓度与标记的白血病细胞一起(mpbc:白血病细胞比率为1:1、1:5、1:10和1:30)共同培养过夜。在孵育结束时，用碘化丙锭对细胞进行染色以检测死亡细胞，使用facscalibur流式细胞仪(bd biosciences,san jose,ca,usa)分析活的cfse
‑
白血病细胞的数量；数据使用bd cellquest软件(version3.3；bd biosciences)分析(图4a
‑
图4b)。
188.此外，mpbc杀死白血病细胞的能力也使用体内小鼠模型进行了评价。在该模型中，mv4
‑
11白血病细胞在第0天被给予γ
‑
辐射的nsg小鼠(10x106个细胞/小鼠)，并且fasl处理的和对照mpbc移植物(3
×
106个总有核细胞(tnc)/小鼠)在4
‑
6小时内注射(图4c)。两组小鼠移植后3周，与媒介物相比，共移植小鼠的脾、bm和血液中的白血病细胞相似地减少(p<0.01)(图4d
‑
图4f)。总之，fasl处理的mpbc和对照mpbc移植小鼠表现出相同的移植物抗白血病活性，而fasl处理的mpbc还表现出gvhd的降低。
189.实施例5：fasl处理减少apc活化
190.除其他以外，t细胞的同种反应性取决于作为抗原呈递细胞的骨髓细胞(树突细胞和单核细胞)以及b细胞的抗原呈递(macdonald等人,2013)。除了t细胞群体，apc也表达cd95，并也暴露于fasl，因此，我们假设它们可能起作用并有助于降低gvhd。对未处理的mpbc中cd95表达的评估显示b细胞群体中的中等水平，以及骨髓细胞中的高水平(图5a)。在fasl处理的mpbc中，检测到b细胞和骨髓细胞二者的凋亡细胞百分比显著升高(图5b)，这分别与两种细胞群体中负责抗原呈递的mhc ii类细胞表面受体hla
‑
dr的0.36倍(p<0.001)和0.62倍(p<0.0001)的显著降低相关(图5c
‑
图5d)。图3d描述了体内实验的结果，显示在第3、7和14天，fasl处理的mpbc移植小鼠的脾中人类t细胞数量显著减少。在这些fasl处理的mpbc移植小鼠的脾中进一步发现了显著低数量的人类b细胞和人类骨髓细胞(图5e
‑
图5f)，其表达极低水平的hla
‑
dr
hi
抗原呈递介质，表明这些细胞的活化水平降低(图5g
‑
图5h)。在这些用fasl处理的mpbc移植的小鼠的骨髓中也发现了类似的结果，显示人类b细胞和骨髓细胞的数量显著减少，并且表达hla
‑
dr
hi
的细胞水平显著降低(图5i
‑
图5l)。
191.实施例6：b细胞亚型表达fasr并响应凋亡诱导
192.使用抗cd95抗体(miltenyi)在b细胞亚型中测量mpbc对照细胞的fasr(cd95
)表达。使用以下抗体进行b细胞亚型的分析：抗cd19、抗cd27和抗cd38。使用流式细胞仪(macsquant,miltenyi)从样品获得数据。根据其受体表达确定了以下b细胞亚群：过渡(cd27
‑
cd38
)、幼稚(cd27
‑
cd38
‑
)、记忆(cd27
cd38
‑
)和浆母细胞(cd27
cd38
)。此外，使用膜联蛋白v(ebiosciences bms500fi)和7aad(ebiosciences 00
‑
6993)染色评估b细胞亚型的早期凋亡，其中膜联蛋白v
7aad
‑
细胞被定义为早期凋亡，并且所有7aad
细胞被认为是晚期凋亡/坏死细胞，并被排除在活细胞分析之外。
193.图6显示了与fasl一起孵育2小时后和在对照细胞中的fasr表达水平(a)、早期凋亡细胞的百分比(b)和b细胞亚型的百分比(c)。从图6a可以看出，与过渡/幼稚细胞(早期分化的b细胞)相比，浆母细胞b细胞亚型(b细胞的最成熟亚型并在其表面表达fasr)的比例最高。与高fasr表达一致，该群体在与fasl一起孵育后显示最强的早期凋亡信号(图6b)。其他b细胞亚型也受到fasl处理的影响，因为早期凋亡细胞的百分比升高，并且在fasl处理后群体减少(图6c)，这表明在上述所有b细胞亚型中存在凋亡易感b细胞。
194.实施例7：人类间充质干细胞(msc)表达fasr并响应于凋亡诱导
195.将人类msc在培养基中保持其原始的未分化状态，并在其达到融合后传代。为了评估fasl对msc的影响，将细胞以5
×
103个细胞/cm2的密度接种在6孔板中，并用不同剂量(1ng/ml至50ng/ml)的fasl处理。在不同的日子，分离和用血细胞计数器或自动细胞计数器计数细胞。收集培养上清液并分析血管生成细胞因子(例如bfgf、fgf2、hgf、il
‑
8、timp
‑
1、timp
‑
2和vegf)和促炎细胞因子/趋化因子(il
‑
6、ccl2、ccl7和ccl8)的分泌。
196.实施例8：fasl体外处理人类msc对在体内减轻gvhd的作用
197.测试在有或没有fasl的培养物中生长的人类msc在体内对gvhd的减轻。nod.scid il2rg
无效
(nsg)小鼠接受全身γ
‑
辐射(tbi)。gvhd通过施用动员的外周血细胞(mpbc)而诱发。1至10天后，fasl处理或未处理的msc通过静脉(iv)团注施用。体重变化以及gvhd症状的发展每周评估两次。追踪小鼠直到死亡或安乐死。计算每个处理组的存活曲线和中位存活时间。
198.实施例9：fasl对car
‑
t细胞制造过程和结果的影响的评价
199.如前述实施例所示，在g
‑
csf动员的外周血细胞与凋亡介质fas配体(fasl)一起短暂孵育(例如2小时)后，t细胞的组成发生了改变。fasl处理降低了成熟和活化的t细胞的百分比，表现为效应细胞百分比的降低和幼稚细胞百分比的增加。此外，暴露于fasl后，群体中活性细胞的比例降低(如表达cd25标志物的t细胞数量所示)。此外，在使用抗cd3/cd28珠体外活化fasl处理的t细胞后，检测到表达cd25的t细胞数量减少，以及ifnγ分泌水平降低和分化动力学速率降低，表明t细胞组成不太成熟和活跃。
200.因此，进行以下实施例以测试在car
‑
t细胞制造过程中联合fasl是否可以减少潜在的细胞因子释放综合征(crs)，提高嵌合抗原受体转导效率，并保持或甚至有助于car
‑
t细胞的存活和抗肿瘤活性。
201.i.检测t细胞活化之前和之后递增浓度的fasl对pbmc的影响
202.以下实验是一项初步研究，旨在确定外周血单核细胞(pbmc)样品中诱导t细胞凋亡的fasl浓度范围、分化和对活化潜能的影响。
203.在ficoll梯度上从血沉棕黄层分离外周血单个核细胞(pbmc)。在活化细胞之前或之后，用递增剂量的fasl处理pbmc。在涂有抗cd3/cd28抗体的24孔培养皿中进行活化。检查的fasl浓度为0、1、5、10、25、50或100ng/ml fasl。
204.分析了三组细胞：
205.1)用浓度为1
‑
100ng/ml的fasl(megafasl adipogen)孵育2小时的细胞。
206.2)用浓度为1
‑
100ng/ml的fasl(megafasl adipogen)孵育2小时，然后用抗cd3/cd28抗体活化48小时的细胞(用fasl孵育2小时 活化48小时)。
207.3)最初用抗cd3/cd28抗体活化48小时，并且然后用fasl孵育2小时的细胞(活化48小时 用fasl孵育2小时)。
208.接下来，使用流式细胞术分析每组细胞。
209.fasl对t细胞生存力的影响：在用浓度为50ng/ml和100ng/ml的fasl处理、然后在活化条件(用抗cd3/cd28抗体)孵育48小时的t细胞(第2组，图7a)中，检测到活的t细胞(cd3
7aad
‑
细胞)的百分比显著降低。
210.fasl对t细胞活化状态的影响：表达cd25的t细胞的百分比第2组中随着fasl浓度
的升高而显著降低，但在第1组几乎没有，并且在第3组没有，主要是在浓度高于25ng/ml时(图7b)。
211.fasl对早期凋亡诱导的作用：当fasl处理后不久进行流式细胞术分析时，检测到递增浓度的fasl处理后早期凋亡水平(膜联蛋白v
t细胞)的剂量依赖性升高(第1组和第3组，图7c)。在活化条件孵育另外48小时后，早期凋亡水平显著降低(第2组，图7c)。
212.基于这些结果，描绘了fasl的浓度范围。
213.ii.测试fasl在car
‑
t细胞制造过程期间的不同阶段的作用
214.在ficoll梯度上从血沉棕黄层分离pbmc。在涂有抗cd3/cd28抗体的24孔培养皿中进行活化。细胞在car
‑
t细胞制造过程期间的不同阶段用fasl处理：在活化前(第1组)、活化后(第2组)和car
‑
t转导后(第3组)，在这种情况下用erbb2 car。fasl以0ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的浓度来使用。根据标准程序用慢病毒载体进行car
‑
t转导(参见例如zhang等人2017biomark.res.5:22；fesnak等人nature protocols,stem cell technologies"production of chimeric antigen receptor t cells")。
215.在car转导过程结束时(孵育10天后)，评价以下参数：生存力(7aad
‑
细胞)、car转导的功效(通过gfp
细胞百分比的升高检测)、由t细胞亚型(幼稚/cm/em/eff细胞)指示的分化状态和通过流式细胞术分析的活化状态(cd25
)。
216.此外，通过将每个处理组的t细胞与靶抗原一起孵育进行特异性测定(人类肿瘤细胞系：mda
‑
mb
‑
231)。erbb2
‑
car
‑
t细胞识别肿瘤细胞，并引发促炎反应，在此期间细胞向培养基中释放ifnγ。收集培养基，并使用elisa评价ifnγ水平。
217.这一实验结果表明：
218.与标准car
‑
t相比，在活化前将细胞暴露于fasl导致了car转导的改进(图8)。在本实验中，0ng/ml fasl(无fasl)样品给出了高的转导背景。
219.car转导后暴露于高浓度fasl(50
‑
100ng/ml)，导致与50ng/ml fasl一起孵育的细胞中的细胞死亡增加(活的转导细胞减少)。转导后用100ng/ml fasl处理后，没有细胞存活(图8)。
220.对cd4
和cd8
细胞获得类似的发现。
221.在转导erbb2
‑
car
‑
t细胞后，将这些细胞与其靶肿瘤细胞(mda
‑
mb
‑
231人类细胞系)共培养。与标准car
‑
t和活化后暴露于fasl的细胞相比，活化前暴露于fasl的细胞分泌高水平的ifnγ(图9)。infγ分泌的增加表现为与fasl浓度的增加有关(图9)。通过gfp
染色测量的转导效率(图8)与infγ分泌相关。
222.总结以上结果，活化前fasl处理导致更好的car转导(图8)。结果显示，与标准car
‑
t相比，该组的gfp
细胞百分比更高。
223.car转导的改进也反映在测量car
‑
t细胞由其靶肿瘤细胞的刺激的测定中。与标准car
‑
t和活化后暴露于fasl的细胞相比，活化前暴露于fasl并与其靶细胞一起孵育的细胞分泌高水平的ifnγ(图9)。infγ分泌的增加表现为与fasl浓度的增加有关(图9)。
224.这些结果表明，在活化步骤之前与fasl一起孵育可能对car
‑
t细胞的转导效率和对car
‑
t细胞对抗原的响应增加具有有益的作用。
225.iii.测试car
‑
t细胞转导后低浓度fasl的影响
226.用不同浓度的fas(0、1、10、50ng/ml)孵育转导的car
‑
t细胞2小时。在用fasl处理
后，在分析前，将car
‑
t细胞在il
‑
2的存在下再孵育4天，以进一步恢复。
227.染色小组包括t细胞亚型(幼稚/cm/em/eff细胞)，以及导致促炎反应恶化(在crs和gvhd期间)的分泌ifnγ和il17的th1、th17和tc1促炎亚型的另外小组。
228.与实验ii中获得的结果相似，在转导后用10ng/ml和50ng/ml的fasl处理car
‑
t细胞导致转导细胞(gfp
)的数量以剂量依赖的方式减少(图10a)。在恢复期期间，将细胞与不含活化剂的il
‑
2一起孵育，因此细胞的总体活化状态较低(图10b)。与标准car
‑
t相比，fasl处理进一步降低了转导的cd3
细胞的活化状态(如cd25的表达所示)(图10b)，这种作用在cd4
亚群中最为明显。暴露于50ng/ml fasl后，剩余的gfp
cd8
细胞高度活跃，如通过表达cd25的gfp
细胞的比例测量的(图10b)。fas处理对不同t细胞亚型(幼稚、中枢记忆(cm)、效应记忆(em)和效应(eff))的影响在图11示出。
技术特征：
1.一种用于产生富集非活化/非成熟细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：a.获得包含哺乳动物细胞的异质群体的生物样品；和b.将获得的哺乳动物细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导活性/成熟细胞的凋亡，而非活性/成熟细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集非活性/非成熟细胞的细胞群体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自由免疫细胞和多潜能基质/间充质干细胞组成的组。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述非活性/非成熟细胞是免疫细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非活性/非成熟细胞是幼稚免疫细胞。6.一种用于产生富集幼稚免疫细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：a.获得包含哺乳动物免疫细胞的异质群体的生物样品；b.将获得的哺乳动物免疫细胞的异质群体与凋亡诱导配体在容器中接触，其中所述接触诱导成熟细胞的凋亡，而幼稚细胞保持对凋亡信号的抗性，从而分离富集幼稚细胞的细胞群体。7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述幼稚免疫细胞是幼稚t细胞或幼稚b细胞。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自由动员的外周血细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、富集的cd3
t细胞、富集的cd4
或cd8
t细胞、富集的b细胞、脐带血细胞和骨髓细胞组成的组。9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞对于所述患者是自体的或对于所述患者是同种异体的。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述凋亡诱导配体被固定在所述容器的内表面上或所述容器中包含的珠或膜上。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述凋亡诱导配体选自由tnf
‑
α、fasl、trail和tweak组成的组。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与凋亡诱导配体的所述接触步骤进行约1小时至约48小时。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述接触步骤进行约2小时。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述凋亡诱导配体是fasl，并且其中所述fasl以约1ng/ml至约800ng/ml的浓度施用。15.根据权利要求14所述的方法，其中fasl以约10ng/ml或100ng/ml的浓度施用。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成熟细胞是选自由t
h
1/t
c
1、t
h
17、t
scm
、t
cm
、t
em
和t
eff
细胞群体组成的组的成熟t细胞。17.一种富集幼稚t细胞的细胞群体，所述细胞群体通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备。18.根据权利要求17所述的富集幼稚t细胞的细胞群体，其中所述细胞的特征为ccr7
cd45ra
cd95
‑
lfa1
低
。19.根据权利要求17或权利要求18所述的富集幼稚t细胞的细胞群体，所述细胞群体用
于在治疗癌症和自身免疫病中使用。20.一种治疗患者的自身免疫病的方法，所述方法包括向所述患者施用通过根据权利要求7至16中任一项所述的方法制备的富集幼稚t细胞的细胞群体。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成熟细胞是选自由记忆和浆母细胞b细胞群体组成的组的成熟b细胞。22.一种富集幼稚b细胞的细胞群体，所述细胞群体通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备。23.根据权利要求22所述的富集幼稚b细胞的细胞群体，其中所述细胞的特征为cd27
cd38
。24.根据权利要求22或权利要求23所述的富集幼稚b细胞的细胞群体，所述细胞群体用于在治疗癌症或自身免疫病或炎性疾病中使用。25.一种治疗患者的自身免疫病的方法，所述方法包括向所述患者施用通过根据权利要求1至15和21
‑
23中任一项所述的方法制备的富集幼稚b细胞的细胞群体。26.一种治疗自身免疫病的方法，所述方法包括：a.将包含t细胞和b细胞的哺乳动物免疫细胞的异质群体与凋亡诱导配体接触，其中所述接触降低所述t细胞和b细胞的活化水平；和b.向有相应需要的患者施用步骤(a)中获得的所述细胞群体。27.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括施用根据权利要求17或18中任一项所述的富集幼稚t细胞的细胞群体，其中所述细胞保持其抗癌活性。28.一种用于产生嵌合抗原受体(car)
‑
t细胞的方法，所述方法包括：a.从生物样品分离单个核细胞；b.通过使所述细胞与至少一种t细胞活化剂接触来活化所述细胞；和c.用car构建体转导所述细胞；其中所述方法还包括在活化步骤(b)之前和/或转导步骤(c)之后，使所述细胞与凋亡诱导配体接触，从而获得car
‑
t细胞。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述生物样品选自由外周血单个核细胞(pbmc)、富集的cd3
t细胞、富集的cd4
t细胞、富集的cd8
t细胞及其任何组合组成的组。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞是pbmc。32.根据权利要求28所述的方法，其中所述t细胞活化剂是抗cd3抗体和抗cd28抗体。33.根据权利要求28
‑
32中任一项所述的方法，其中所述凋亡诱导配体选自由fasl、tnf
‑
α、trail和tweak组成的组。34.根据权利要求28
‑
33中任一项所述的方法，其中用凋亡诱导配体的所述接触步骤进行约1小时至约48小时。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述接触步骤进行约2小时。36.根据权利要求28
‑
35中任一项所述的方法，其中所述凋亡诱导配体是fasl，并且其中所述fasl以约1ng/ml至约800ng/ml的浓度施用。37.根据权利要求36所述的方法，其中fasl以约10ng/ml、约50ng/ml或约100ng/ml的浓度施用。
技术总结
本发明涉及用于产生富集非活化/非成熟细胞、特别是非活化/非成熟T和/或B细胞、任选地遗传修饰的T和/或B细胞的细胞群体的方法。该方法包括将哺乳动物细胞的异质群体与凋亡诱导配体接触，其中所述接触诱导活性/成熟细胞的凋亡，而非活性/成熟细胞保持对凋亡信号的抗性。本发明还涉及富集的细胞群体的治疗用途。途。
技术研发人员：S
受保护的技术使用者：塞莱克特生物疗法有限公司
技术研发日：2019.08.22
技术公布日：2021/6/29
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