本申请涉及用于诊断微生物感染的低成本、便携式荧光检测设备。
背景技术：
冠状病毒是包膜rna病毒，其广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类之间，并引起呼吸道、肠道、肝脏、和神经系统疾病。尽管大多数人类冠状病毒感染是温和的，但两种毒株已与有时致命的疾病有关。其中之一是sars-cov，这是2002年和2003年爆发严重急性呼吸系统综合征的病因；另一种是mers-cov，这是2012年爆发严重呼吸系统疾病的病原体。最近，一种名为2019-ncov即sars-cov2的新型冠状病毒毒株在住院患者中鉴定出来。系统发育分析揭示了2019-ncov即sars-cov2在正冠状病毒亚科(orthocoronavirinae)sarbecovirus亚属内形成分支。该新型毒株也与更严重的和有时致命的疾病有关(zhu等人(2020),2019,nejm,doi:10.1056/nejmoa2001017)。
已经开发了一些方法以诊断2019-ncov即sars-cov2，包括高通量测序和实时逆转录pcr(zhu等人(2020))。然而，这些方法耗时且需要专门的设备。为了更好地诊断和控制像2019-ncov即sars-cov2的微生物感染的传播，需要开发快速且低成本的诊断设备，这些设备可在各种现场测试环境例如当地诊所、火车站、机场和家庭中使用。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入本文。
技术实现要素：
本申请提供荧光检测设备和系统，以及使用此类设备和系统的方法。
本申请的一方面提供用于检测来自检测板的荧光信号的系统，其包括：(a)基座结构，其包括支承面；(b)发光二极管(led)单元，其附接至基座结构，其中所述led单元包括：led光源，和锥形反射器，所述锥形反射器配置为聚焦由led光源发出的光束，以使光束沿着支承面传输并穿过置于支承面上的检测板；和(c)壳体，其配置为封入基座结构和led单元，其中所述壳体包括开口；其中包括相机模块的移动计算设备可以附接至壳体，以捕获通过开口的检测板的图像。在一些实施方案中，系统是便携式的。
在一些根据上述任何一种系统的实施方案中，将锥形反射器配置为聚焦光束，使得所述光束相对于支承面呈约10°以下的角度。在一些实施方案中，将锥形反射器配置为聚焦光束，使得所述光束平行于支承面。
在一些根据上述任何一种系统的实施方案中，系统还包括配置为置于开口上方的滤光器。在一些实施方案中，led光源具有约470nm至约510nm、例如约490nm的波长。在一些实施方案中，所述滤光器选择性地透射波长约530至约580nm、例如约550nm的光。
在一些根据上述任何一种系统的实施方案中，壳体为盒(例如，暗盒)。在一些实施方案中，壳体包括具有开口的表面的盒，其中移动计算设备可以附接至表面。在一些实施方案中，系统还包括封入在壳体中的用于led光源的电池。在一些实施方案中，基座结构与led单元是可拆卸的。
在一些根据上述任何一种系统的实施方案中，系统还包括配置为将相机模块置于开口上方的移动计算设备。在一些实施方案中，移动计算设备是智能手机。
在一些根据上述任何一种系统的实施方案中，系统还包括配置为置于支承面上的检测板。在一些实施方案中，检测板包括两个或更多个反应池。
本申请的另一方面提供一种检测板，其包括两个或更多个反应池，其中每个反应池包括干粉组合物，所述干粉组合物包括：(a)cas核酸酶；(b)指导rna，其包括结合至cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列；和(c)检测dna，其包括荧光标签，其中所述检测dna为单链并且不与指导rna的指导序列杂交，并且其中来自所述荧光标签的荧光信号在所述检测dna切割后是可检测的。在一些实施方案中，所述荧光标签是fam(5(6)-羧基荧光素)。在一些实施方案中，cas核酸酶是v型crispr/cas核酸酶。在一些实施方案中，cas核酸酶是cas12a核酸酶。在一些实施方案中，cas核酸酶是cas12b核酸酶。在一些实施方案中，cas核酸酶是cas12i核酸酶(例如，cas12i1或cas12i2)。在一些实施方案中，cas核酸酶是cas13核酸酶。
在一些根据上述任何一种检测板的实施方案中，其中干粉组合物还包括一种或多种用于重组酶聚合酶扩增(rpa)的试剂。在一些实施方案中，干粉组合物还包括：(a)重组酶；(b)单链dna结合蛋白(ssb)；(c)链置换聚合酶；(d)核酸用于扩增靶核酸的正向引物和反向引物；和(e)dntp。
在一些根据上述任何一种检测板的实施方案中，其中干粉组合物还包括用于逆转录的一种或多种试剂。在一些实施方案中，干粉组合物还包括：(a)逆转录酶；和(b)逆转录引物。
在一些根据上述任何一种检测板的实施方案中，每个反应池的体积约20μl至约500μl，例如约20μl至约200μl、约50μl、或约100μl。在一些实施方案中，每个反应池的尺寸约3mm×约3mm。
本申请的一个方面提供使用上述任何一种系统或检测板检测样品中靶核酸的方法。在一些实施方案中，提供检测样品中靶核酸的方法，其包括：(a)将样品加样至包括上述任何一种检测板的检测板的反应池中；(b)在适合靶核酸或其扩增子的cas切割的温度下孵育检测板；(c)将检测板置于包括以下的系统中：(i)基座结构，其包括支承面，其中检测板置于支承面上；(ii)发光二极管(led)单元，其附接至基座结构，其中led单元包括：led光源，和锥形反射器，所述锥形反射器配置为聚焦由led光源发出的光束，以使光束沿着支承面传输并穿过置于在支承面上的检测板；和(iii)壳体，其配置为封入基座结构和led单元，其中所述壳体包括开口；(d)将包括相机模块的移动计算设备附接至系统的壳体，以将所述相机模块置于所述系统的开口上方；和(e)使用移动计算设备的相机模块捕获反应池的图像，从而检测样品中靶核酸的存在与否。在一些实施方案中，步骤(b)包括在约42℃下孵育检测板约5分钟至约40分钟。在一些实施方案中，所述方法还包括在移动计算机设备中分析捕获的图像。
在一些根据上述任何一种方法的实施方案中，靶核酸是病毒dna、细菌dna、真菌dna、原生动物dna、或藻类dna。在一些实施方案中，靶核酸是病毒rna、细菌rna、真菌rna、原生动物rna、或藻类rna。在一些实施方案中，靶核酸是来自冠状病毒的rna。在一些实施方案中，靶核酸是来自2019-ncov即sars-cov2的rna。在一些实施方案中，样品是鼻或咽拭子样品。
本申请的一个方面提供诊断个体中微生物感染的方法，其包括使用根据上述任何一种检测方法检测与来自个体的样品中的微生物感染相关的微生物的靶核酸。在一些实施方案中，微生物感染是细菌感染。在一些实施方案中，微生物感染是原生动物感染。在一些实施方案中，微生物感染是藻类感染。在一些实施方案中，微生物感染是病毒感染。在一些实施方案中，微生物感染是冠状病毒感染，例如2019-ncov即sars-cov2感染。在一些实施方案中，个体是人类个体。
本申请的另一方面提供干粉组合物，其包括：(a)cas核酸酶，(b)指导rna，其包括结合至所述cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列；(c)检测dna，其包括荧光标签，其中所述检测dna为单链并且不与指导rna的指导序列杂交，并且其中来自所述荧光标签的荧光信号在所述检测dna切割后是可检测的；(d)重组酶；(e)单链dna结合蛋白(ssb)；(f)链置换聚合酶；(g)用于扩增靶核酸的正向引物和反向引物；(h)dntp；(i)逆转录酶；和(j)逆转录引物。在一些实施方案中，干粉组合物是冻干组合物。
还提供试剂盒和制品(articlesofmanufacture)，其包括根据上述任何一种系统的系统，或根据上述任何一种检测板的检测板。在一些实施方案中，试剂盒或制品还包括所述系统和所述检测板。在一些实施方案中，试剂盒或制品包括多个所述检测板。在一些实施方案中，试剂盒或制品还包括根据上述任何一种干粉组合物的干粉组合物。在一些实施方案中，试剂盒或制品包括用于上述任何一种检测方法或诊断方法的说明书。
附图说明
图1显示用于诊断病毒感染的示例性工作流程的示意图。
图2显示便携式荧光检测系统的示意性图示说明。
图3-5显示图2中的系统的三个视角(a、b、和c)的示意图。在图5中，将移动计算设备(例如，智能手机)置于成像盖(表面c)的顶部，使得移动计算设备的镜头位于成像开口的顶部。
图6显示图2的系统的示意性透视图。
图7显示图2的系统的示意性截面图。
图8显示图2的系统的示意性截面图。
图9显示检测板的两个视图。
图10-13显示便携式荧光检测系统的原型的不同视图。在图10中，led单元(包括锥形镜)(左)和抽屉(右)彼此是可拆卸的。在图11中，led单元(包括锥形镜)和抽屉彼此附接。在图12中，将系统的成像盖移去以显示led单元和嵌入暗盒内的抽屉。图13显示置于系统的成像盖的顶部以捕获检测板的图像的智能手机。
图14a-14b显示通过使用图13的系统的智能手机捕获的检测板的图像。
图15示意性地示出使用便携式荧光检测设备检测病毒感染的示例性方法的流程图。
具体实施方式
本申请提供便携式的并且可附接至智能手机以使用手机上的相机功能进行数据捕获和分析的荧光检测设备和系统。本文所述的设备和系统可用于检测任何荧光液体或反应混合物的荧光强度。在一些实施方案中，荧光检测系统用于结合基于crispr/cas的荧光检测系统。还提供使用本文所述的设备和系统用于检测靶核酸的检测、方法和试剂盒。该设备和系统能够在包括当地诊所、机场、火车站、学校、办公室、和患者家中等非专业机构中以低成本快速诊断微生物感染(例如2019-ncov即sars-cov2感染)。
i.定义
除非另外定义如下，否则术语如在本领域中通常使用地在本文中使用。
本文可互换使用的术语"多核苷酸"和"核酸"，指任何长度的核苷酸(无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，术语"多核苷酸"和"核酸"包括单链dna；双链dna；多链dna；单链rna；双链rna；多链rna；基因组dna；cdna；dna-rna杂交体；以及包括嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
如本文所用，术语"个体"、"患者"或"受试者"可互换使用并且指任何单个动物，例如，期望处理的哺乳动物(包括非人类动物，例如如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、羊和非人类灵长类动物)。在一些实施方案中，个体是人类。
应理解，本文所述的发明的实施方案包括"由…组成"和/或"基本上由…组成"的实施方案。
本文涉及的"约"值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及"约x"的描述包括"x"的描述。
如本文所用，所涉及的术语"非"值或参数通常意指和描述"不同于"值或参数。例如，该方法不用于治疗x型癌症是指该方法用于治疗x型以外的癌症。
本文使用的术语"约x-y"具有与"约x至约y"同样的含义。
如本文所用和在所附的权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式"一"、"一个"、和"该"包括复数指称对象。
应理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中所述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案的组合中提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中所述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合来提供。与本文所述的设备、系统和方法有关的实施方案的所有组合都被本发明特别地涵盖，并且在本文中公开，就像每个和每一组合都是单独地并且明确地公开的一样。此外，描述这种变量的实施方案中的设备、系统、和方法的特征和特性的所有子组合也被本发明明确地涵盖，并且在本文中公开，就像每个和每一该子组合都是在本文中单独地并且明确地公开的一样。
ii.荧光检测系统
本发明提供光学(例如，荧光)检测设备和系统。
在一些实施方案中，提供用于检测来自检测板的光学(例如，荧光)信号的设备，其包括：(a)基座结构，其包括支承面；(b)led单元，其附接至基座结构，所述led单元包括：led光源，和锥形反射器(例如，锥形镜)，所述锥形反射器配置为聚焦由led光源发出的光束，以使光束沿着支承面传输。在一些实施方案中，设备包括配置为置于支承面上的检测板。在一些实施方案中，光束沿支承面传输。在一些实施方案中，设备可以置于具有开口的暗盒中，其中移动计算设备(例如，智能手机)可以附接至暗盒，将相机模块置于开口上方以捕获检测板的图像。
在一些实施方案中，提供用于检测来自检测板的光学(例如，荧光)信号的系统，其包括：(a)基座结构，其包括支承面；(b)led单元，其附接至所述基座结构，所述led单元包括：led光源，和锥形反射器(例如，锥形镜)，所述锥形反射器配置为聚焦由led光源发出的光束，以使光束沿着支承面传输；和(c)壳体，其配置为封入基座结构和led单元，其中所述壳体包括开口，并且其中包括相机模块的移动计算设备(例如，智能手机)可以附接至壳体，以捕获通过开口的检测板的图像。在一些实施方案中，系统包括配置为置于支承面上的检测板。在一些实施方案中，系统包括附接至系统的壳体的移动计算设备，其中相机模块置于开口上方。
在一些实施方案中，提供用于检测来自检测板的光学(例如，荧光)信号的系统，其包括：(a)基座结构，其包括支承面；(b)检测板，其配置为置于支承面上；(c)led单元，其附接至所述基座结构，其中所述led单元包括：led光源；锥形镜，其配置为聚焦由led光源发出的光束，以使光束沿着支承面传输并穿过检测板；(d)壳体，其配置为封入芯片和led单元，其中所述壳体包括开口；和(e)光学传感器，其配置为捕获通过开口的芯片的图像。在一些实施方案中，光学传感器是移动计算设备例如智能手机的镜头。
本文所述的荧光检测设备和系统包括例如包括led光源的led单元、锥形反射器、检测板(也称为样品块(sampleblock))、具有支承面的基座结构(例如"抽屉")、壳体(例如暗盒)、以及开口(例如暗盒的盖中的开口)等组件。led光源提供激发光以照射样品中的荧光基团。例如，当样品含有fam(5(6)-羧基荧光素)时，可使用蓝色led光源(例如，波长范围为约470nm-510nm，例如约490nm)。当可以使用具有其它激发波长的荧光基团时，可以选择具有合适波长范围的led光源。具有特定波长的led光源可在市场中容易地获得。led光源可以附接至壳体，或附接至锥形反射器。
锥形反射器例如锥形镜用于防止耀斑并将led光引导成均匀地在检测板上的一个光束。锥形反射器可以置于例如由led光发出的光束相对于支承面或支承面上的检测板呈小角度，例如不大于约30°、20°、15°、10°、5°或更低角度的位置。在一些实施方案中，由led光发出的光束平行于支承面并穿过支承面上的检测板。
将检测板设计为容易使用和成像。在一些实施方案中，检测板是平坦的正方形或矩形。平坦的表面确保检测板不易翻倒。在一些实施方案中，检测板包括两个或更多个反应池。反应池可以是任何合适的形状，例如圆形或正方形。反应池可具有小的体积，以允许使用少量的试剂和样品。在一些实施方案中，每个反应池具有约5mm×5mm、4mm×4mm、3mm×3mm、2mm×2mm、或1mm×1mm的截面，包括这些值之间的任何值和范围。在一些实施方案中，每个反应池的深度为约2mm、2.5mm、3mm、4mm、或5mm的任一者，包括这些值之间的任何值和范围。在一些实施方案中，每个反应池的体积为不大于约1ml、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、30μl、20μl或更低的任一者，包括这些值之间的任何值和范围。在一些实施方案中，检测板包括分别针对阳性对照、阴性对照、和测试样品(例如，患者样品)的3个反应池。在一些实施方案中，检测板是透明的。例如，检测板可由pdms(聚二甲基硅氧烷)或其他透明材料制成。在一些实施方案中，可以轻弹检测板以确保试剂与样品在反应池中均匀混合。在一些实施方案中，在检测板中预先加样试剂。在一些实施方案中，检测板由防止反应混合物在反应池中蒸发的盖子(例如，另一pdms板、或玻璃盖玻片、或塑料片、或透明标签)覆盖。在一些实施方案中，检测板被透明胶带覆盖。
在一些实施方案中，检测板在各个反应池中包括试剂(例如，用于逆转录、rpa、和/或基于crispr/cas的核酸检测的试剂)。在一些实施方案中，试剂为干粉形式。在一些实施方案中，试剂在检测板上的反应池中为冻干的。
在一些实施方案中，检测板的各反应池包括用于基于crispr/cas的核酸检测的试剂。在一些实施方案中，用于基于crispr/cas的核酸检测的试剂包括：(a)cas核酸酶；(b)包括结合至cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列的指导rna；和(c)包括荧光标签的检测dna，其中所述检测dna为单链并且不与指导rna的指导序列杂交，并且其中来自所述荧光标签的荧光信号在所述检测dna切割后是可检测的。
在一些实施方案中，检测板的各反应池还包括用于靶核酸的扩增的试剂。在一些实施方案中，试剂用于等温扩增，例如重组酶聚合酶扩增(rpa)。在一些实施方案中，用于rpa的试剂包括(a)重组酶；(b)单链dna结合蛋白(ssb)；(c)链置换聚合酶；(d)用于扩增靶核酸的正向引物和反向引物；和(e)dntp。
在一些实施方案中，检测板的各反应池还包括用于靶rna分子的逆转录的试剂。在一些实施方案中，用于逆转录的试剂包括：(a)逆转录酶；(b)逆转录引物(例如，poly-dt、随机六聚体、或靶特异性引物)；和(c)dntp。
在一些实施方案中，检测板的各反应池含有包括以下的干粉组合物：(a)cas核酸酶，(b)包括结合至cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列的指导rna；(c)包括荧光标签的检测dna，其中所述检测dna为单链并且不与指导rna的指导序列杂交，并且其中来自所述荧光标签的荧光信号在所述检测dna切割后是可检测的；(d)重组酶；(e)单链dna结合蛋白(ssb)；(f)链置换聚合酶；(g)用于扩增靶核酸的正向引物和反向引物；(h)dntp；(i)逆转录酶；和(j)逆转录引物。
在一些实施方案中，检测板的各反应池含有包括以下的干粉组合物：(a)cas核酸酶，(b)包括结合至cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列的指导rna；(c)包括荧光标签的检测dna，其中所述检测dna是单链并且不与指导rna的指导序列杂交，并且其中来自荧光标签的荧光信号在检测dna切割后是可检测的；(d)重组酶；(e)单链dna结合蛋白(ssb)；(f)链置换聚合酶；(g)用于扩增靶核酸的正向引物和反向引物；和(h)dntp。
基座结构包括可保持检测板的支承面。基座结构在荧光检测期间连接至led单元，但与led单元可以是可拆卸的，以装载或卸载检测板。基座结构可以为可滑入壳体中的槽中以附接至led单元的抽屉的形式。保持检测板的支承面可具有例如短轴(shortshaft)等结构以将检测板保持在适当的位置使得样品不移动。抽屉设计允许用户以最小的接触容易地且快速地将样品放入和取出系统。精确放置抽屉使得检测板与暗盒的顶盖上的相机针孔(即，“开口”)对齐，使得检测板在与led光源相同的水平精确地被闪光(flashed)。
壳体可以是例如暗盒等盒。暗盒避免杂散光。在一些实施方案中，壳体的表面，包括壳体的内表面和外表面，被涂成磨砂黑以最小化来自光散射的噪音信号。壳体设计为允许例如智能电话等移动计算设备在数据收集和分析期间稳定放置。壳体可具有一个或多个可拆卸侧、和一个或多个开口，允许用户将各种组件置于壳体中。壳体封入基座结构(例如，抽屉)和led单元。在一些实施方案中，壳体可内含为led光源供电的电池。
壳体可具有包括用于由移动计算设备捕获图像的开口的盖或表面。开口可以为针孔。盖覆盖盒以确保成像期间的完全的黑暗。孔设计为适配用于数据收集的主相机镜头。开口设计为具有合适的尺寸来适合大部分移动电话上的相机的镜头。盖置于距离检测板适当的距离以促进通过移动计算设备的图像捕获。在一些实施方案中，盖距离检测板至少约8cm、9cm、10cm、12cm、15cm、或更多，包括这些值之间的任何值和范围。
配置为选择性地透射处于样品中的荧光团的发射波长下的光的滤光器可置于开口上方。可使用具有可见光谱中的发射波长的任何荧光团并且可相应地选择适合于荧光团的滤光器。例如，对约530-580nm、诸如约550nm的波长具有选择性的绿色滤光器可用于仅允许来自样品中的fam(5(6)-羧基荧光素)的阳性信号被检测到。滤光器可附接在开口的任一侧，诸如在开口和移动设备的相机镜头之间，或在盖或表面的下方使得滤光器置于相对于移动设备的对侧上。
本文所述的设备和系统可与例如智能电话等各种移动计算设备一起使用。几乎目前市场上的所有智能电话都包括内置相机，其可使用常规成像设置并且不需要通过另外的镜头进一步放大来检测来自检测板的荧光信号。可使用各种品牌和设计的智能电话，以及具有合适的成像能力的其它移动设备，包括但不限于，平板型和膝上型计算机。典型地，移动计算设备包括配置为处理捕获的图像以分析来自样品的荧光信号的处理器。另外地或可选地，移动计算设备包括显示屏，处理器配置为在显示屏上呈现荧光信号的评价(例如，靶核酸的存在或不存在，或个体是否被诊断为具有微生物感染)。
本文所述的系统可具有小的空间量(footprint)使得它们是便携式的。在一些实施方案中，壳体的长度、宽度和/或高度为不超过约50cm、40cm、30cm、20cm、15cm、10cm或更低的任一者，包括这些值之间的任何值和范围。
图2-5提供示例性荧光检测系统(100)的外部的示意图。116是可滑入暗盒中的保持检测板的抽屉的把手。140是含有开口(142)的盖，在其上方可放置移动设备(150)的相机以允许图像捕获。滤光器(144)可置于开口(142)上方、在盖(140)下方或在盖(140)和移动设备(150)之间任一者，其选择性地透射来自样品的荧光信号。
图6中示出示例性荧光检测系统(100)的透视图。抽屉/基座结构(110)附接至包括锥形反射器(120)的led单元，所述锥形反射器(120)将由led光源(未示出，附接至锥形反射器的内部)发出的光束引导至置于板支架(114)上方的检测板(200)。led光源(130)由电池(300)供电。图7和8提供抽屉(110)和led单元(120)的截面图。
图9示出具有3个反应池(212、214、216)以及相应的加样部(222、224、226)的检测板(200)的示意图。
图10-13示出荧光检测系统的原型的图片。系统具有15cmx10cmx10cm的尺寸。从具有成像开口的盖至检测板的距离为至少约8cm。检测板具有2cmx2cm的尺寸，并且各反应池为3mmx3mmx约2.2mm(最小)。
iii.检测或诊断方法
本申请进一步提供检测样品中的靶核酸的方法，和使用本文所述的荧光检测设备和系统的任一者诊断个体中的微生物感染(例如，病毒或细菌感染)的方法。本文所述的方法可用于即时测试(point-of-care)、现场测试、或家庭测试。
在一些实施方案中，提供检测样品中的靶核酸的方法，其包括：(a)将样品加样至本文所述的检测板的任一者的反应池中；(b)在适于靶核酸或其扩增子的cas切割的温度下孵育检测板；(c)将检测板置于本文所述的荧光检测系统的任一者中的支承面上；(d)将包括相机模块的移动计算设备附接至系统使得相机模块置于系统的开口上方；和(e)使用移动计算设备的相机模块捕获反应池的图像，从而检测样品中的靶核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤(b)包括在约42℃下孵育检测板约5分钟至约40分钟。
在一些实施方案中，提供个体中的微生物感染的诊断方法，其包括：(a)获得来自个体的样品；(b)将样品加样至本文所述的检测板的任一者的反应池中；(c)在适于与微生物感染相关的微生物中的靶核酸或其扩增子的cas切割的温度下孵育检测板；(d)将检测板置于本文所述的荧光检测系统的任一者中的支承面上；(e)将包括相机模块的移动计算设备附接至系统使得相机模块置于系统的开口上方；和(f)使用移动计算设备的相机模块捕获反应池的图像，从而基于样品中存在或不存在靶核酸来提供诊断。在一些实施方案中，步骤(b)包括在约42℃下孵育检测板约10分钟至约40分钟。应理解的是，本文所述的检测方法可用于诊断与生物标志物核酸相关的其它疾病或病况。
图15提供诊断患者中病毒感染的示例性方法的示意性流程图。样品收集自含有病毒(例如，诸如2019-ncov即sars-cov2等冠状病毒)的患者。高温加热样品(例如，56℃1分钟)来灭活病毒，并使核酸从病毒释放至样品中。可选地，可使用市售试剂盒来从样品中提取核酸。然后将样品加样至已预加样(例如，干粉的)试剂的检测板的反应池中。在加样样品后，轻弹检测板以使样品与试剂混合。然后将样品检测板置于处于适于反应(例如，逆转录、rpa、和基于cas的核酸检测)的温度例如42℃下的孵育箱中。可同时孵育多个检测板，这可包括实验的重复。在约5-40分钟的孵育后，将检测板装载至抽屉中，然后将抽屉置于荧光检测系统中。然后将智能电话置于荧光检测系统的顶部来捕获检测板的图像。通过手机app分析图像，其将诊断结果提供给用户。
本文所述的方法涉及基于crispr/cas的检测。已描述基于crispr/cas的检测方法，例如，在us10,253,365b1、cn202011414384.3和pct/cn2018/118457中，其全部内容通过引用结合在此。例如，v型crispr/cas核酸酶，诸如cpfl(cas12a)和c2c1(cas12b)等cas12蛋白，一旦由靶dna(双链或单链)的检测激活，可混杂地切割非靶向的单链dna(ssdna)。一旦v型crispr/cas核酸酶(例如，诸如cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12i等cas12蛋白)被指导rna激活，这在指导rna杂交至靶dna(即，样品包括所靶向的dna)的靶序列时发生，核酸酶可混杂地切割ssdna(即，核酸酶切割非靶ssdna，即，指导rna的指导序列未与其杂交的ssdna)。因此，当靶dna存在于样品中时(例如，在一些情况下超过阈值量)，结果为样品中ssdna的切割，这可使用荧光标记的单链检测dna来检测。在一些实施方案中，本文所述的方法使用cas12a、cas12b、cas12i(例如，cas12i1、cas12i2)或cas13核酸酶，包括其功能性变体和突变体。
v型crispr/cas效应蛋白在由靶向dna的rna和靶dna之间的互补区域限定的靶序列处结合至靶dna。就像许多crispr/cas核酸内切酶一样，双链靶dna的位点特异性结合(和/或切割)发生在由以下二者确定的位置：(i)指导rna和靶dna之间的碱基配对互补；和(ii)靶dna中的短基序[被称为前间区序列邻近基序(pam)]。包括结合至cas核酸酶的序列和与靶核酸杂交的指导序列的指导rna可使用本领域已知的方法设计。
“可杂交的”或“互补”或“实质上互补”是指核酸(例如，rna、dna)包括能够使得在合适的温度和溶液离子强度的体外和/或体内条件下以序列特异性、反平行的方式(即，核酸特异性地结合至互补核酸)与另一核酸非共价结合，即，形成沃森-克里克碱基对和/或g/u碱基对、“退火”、或“杂交”的核苷酸的序列。标准的沃森-克里克碱基配对包括：腺嘌呤/腺苷(a)与胸腺嘧啶/胸苷(t)配对，a与尿嘧啶/尿苷(u)配对，鸟嘌呤/鸟苷(g)与胞嘧啶/胞苷(c)配对。另外，对于两个rna分子之间的杂交(例如，dsrna)、和对于dna分子与rna分子的杂交(例如，当dna靶核酸与指导rna碱基配对时，等)：g还可与u碱基配对。
杂交需要两条核酸含有互补序列，尽管碱基之间的错配是可能的。适于两条核酸之间的杂交的条件取决于核酸的长度和互补程度，它们是本领域已知的变量。两条核苷酸序列之间的互补程度越大，具有那些序列的核酸的杂交体的解链温度(meltingtemperature)(tm)的值越大。典型地，可杂交的核酸的长度为8个核苷酸以上(例如，10个核苷酸以上、12个核苷酸以上、15个核苷酸以上、20个核苷酸以上、22个核苷酸以上、25个核苷酸以上、或30个核苷酸以上)。
在一些情况下，使用为单链(ssdna)且不与指导rna的指导序列杂交的检测dna(即，检测ssdna为非靶ssdna)。基于crispr/cas的检测方法包括(a)使样品与以下接触：(i)cas核酸酶(例如，cas12a、cas12b、cas12i或cas13)；(ii)包括以下的指导rna：结合至cas核酸酶的区域，和与靶dna杂交的指导序列；和(iii)荧光标记的检测dna，其为单链且不与指导rna的指导序列杂交；其中荧光信号通过由cas核酸酶切割单链检测dna来产生，从而允许使用本文所述的荧光检测设备和系统检测靶核酸。基于crispr/cas的检测方法具有渺摩尔(attomolar,am)检测灵敏度。
在一些实施方案中，标记的检测ssdna包括淬灭剂/荧光团对，其中包括淬灭剂部分和荧光标签。淬灭剂部分淬灭来自荧光标签的信号(例如，通过吸收标签的发射光谱中的能量)。因此，当淬灭剂部分不在信号部分附近时(例如，当检测dna由cas核酸酶切割时)，来自荧光标签的(发射)信号是可检测的，因为信号不被淬灭剂部分吸收。可使用任何常规的荧光团/淬灭剂部分对，且本领域已知许多合适的对。
在一些实施方案中，在将样品加样至反应池之前，对样品进行一个或多个另外的步骤。例如，可在高温下对样品进行孵育来灭活微生物(例如，病毒)、或使靶核酸从微生物中释放。还可对样品进行提取和/或片段化靶核酸分子的步骤。在一些实施方案中，其中所述靶核酸为rna分子，对样品进行逆转录步骤。在一些实施方案中，对样品进行扩增步骤。在一些实施方案中，首先对样品进行逆转录步骤、接着进行扩增步骤。
在一些实施方案中，在检测板的反应池内对样品同时进行扩增和基于crispr/cas的核酸检测反应。在一些实施方案中，在检测板的反应池内对样品同时进行逆转录、扩增、和基于crispr/cas的核酸检测反应。
本文所述的方法适于快速检测和诊断。在一些实施方案中，允许逆转录、扩增、和/或基于crispr/cas的核酸检测反应的孵育时间为不超过约40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、或更少的任一者，包括之间的任何值和范围。在一些实施方案中，总孵育时间为约5分钟至约40分钟，例如约5分钟至约10分钟、约10分钟至约15分钟、约15分钟至约20分钟、约20分钟至约30分钟、约30分钟至约40分钟、约5分钟至约20分钟、约10分钟至约20分钟、或约10分钟至约40分钟。
在一些实施方案中，扩增步骤为等温扩增步骤。术语“等温扩增”是指可使用单一温度孵育从而避免需要热循环的核酸(例如，dna)扩增(例如，使用酶链反应)的方法。等温扩增是核酸扩增的形式，其在扩增反应期间不依赖于靶核酸的热变性并且因此可不需要温度的多个快速变化。因此等温核酸扩增法可在实验室环境内或外进行。通过与逆转录步骤组合，这些扩增方法可用于等温扩增rna。
等温扩增法的实例包括但不限于：环介导的等温扩增(lamp)、解旋酶依赖性扩增(hda)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、链置换扩增(sda)、基于核酸序列的扩增(nasba)、转录介导的扩增(tma)、切口酶扩增反应(near)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)、网状分支扩增(ram)、环解旋酶依赖性扩增(chda)、单引物等温扩增(spia)、rna技术的信号介导的扩增(smart)、自身维持序列扩增(35r)、基因组指数式扩增反应(gear)和等温多重置换扩增(imda)。
在一些情况下，扩增为重组酶聚合酶扩增(rpa)(参见，例如，美国专利号8,030,000；8,426,134；8,945,845；9,309,502；和9,663,820，其全部内容通过引用结合在此)。重组酶聚合酶扩增(rpa)使用两条相对引物(非常像pcr)并且采用三种酶-重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换聚合酶。重组酶将寡核苷酸引物与双螺旋dna中的同源序列配对，ssb结合至dna的置换链以防止引物被置换，并且链置换聚合酶在引物已结合至靶dna的位置开始dna合成。向rpa反应添加逆转录酶可促进rna以及dna检测，而不需要生成cdna的单独的步骤。用于rpa反应的组分的一个实例如下：50mmtrisph8.4、80mm乙酸钾、10mm乙酸镁、2mmdtt、5％peg化合物(carbowax-20m)、3mmatp、30mm磷酸肌酸、100ng/μl肌酸激酶、420ng/μlgp32、140ng/μluvsx、35ng/μluvsy、2000mdntp、300nm各寡核苷酸、35ng/μlbsu聚合酶、和含核酸的样品。
本文所述的方法可还包括一个或多个数据分析步骤。在一些实施方案中，移动计算设备用于处理捕获的图像，例如，使用在移动设备中的处理器上运行的移动应用。在一些实施方案中，报道二元数据，即，存在或不存在靶核酸、或存在或不存在微生物感染。在一些实施方案中，用户可从网站或“应用商店(appstore)”在移动计算设备上下载移动应用软件。移动应用软件包括用户界面，其指导用户进行测试并根据需要接受用户输入，以及驱动组件来操纵相机模块，和根据需要的移动计算设备的显示屏。应用软件还包括图像处理和分析组件，其分析由相机模块捕获的样品的图像并计算测试结果。
靶核酸可为dna或rna。在一些实施方案中，靶核酸为单链。在一些实施方案中，靶核酸为双链。在一些实施方案中，靶核酸为基因组dna。在一些实施方案中，靶核酸为基因组rna。
靶核酸的来源可为来自任何来源。在一些实施方案中，靶核酸为微生物的基因组核酸(例如，dna或rna)，所述微生物例如致病性微生物，包括但不限于病毒细菌、真菌、原生动物、藻类。在一些实施方案中，靶核酸为细菌例如致病菌的基因组dna。在一些实施方案中，靶核酸为dna病毒的基因组dna。在一些实施方案中，靶核酸为rna病毒的基因组rna。可检测的示例性病毒包括但不限于，冠状病毒(例如，sars、mers、和2019-ncov即sars-cov2)、乳头多瘤空泡病毒(例如，人乳头瘤病毒(hpv)、多瘤病毒)；α流感病毒(例如，流感a病毒h1n1亚型)；肝病毒(例如，乙肝病毒(hbv))；疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒(hsv))、水痘带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv))；腺病毒(例如，阿塔腺病毒、禽腺病毒、鱼腺病毒、哺乳动物腺病毒、猴腺病毒)；痘病毒(例如，天花、痘苗病毒(vacciniavirus)、牛痘病毒、猴痘病毒、羊痘病毒、伪牛痘病毒、牛丘疹性口炎病毒；塔那痘病毒、亚巴猴肿瘤病毒；传染性软疣病毒(mcv))；细小病毒(例如，腺相关病毒(aav)、细小病毒b19、人博卡病毒、布法病毒(bufavirus)、人parv4gi)；虫媒病毒(例如，丙肝病毒(hcv)、寨卡病毒、登革病毒)；慢病毒(例如，人免疫缺陷病毒(hiv))；双生病毒科；矮化病毒科；藻类去氧核糖核酸病毒科(phycodnaviridae)；等。在一些实施方案中，靶核酸来自寄生虫。
术语“样品”在本文中用于意指含有核酸的任何样品。样品可源自任何来源，例如，样品可以是纯化的核酸的合成组合，或样品可以是细胞裂解物。样品可来自患者(例如，用于诊断的目的)。合适的样品包括但不限于唾液、血液、血清、血浆、尿、抽出物、和活体组织样品。在一些实施方案中，获得自患者的样品选自由全血、血浆、血清、或其组合组成的组。在一些实施方案中，样品为归档的血液样品、新鲜的血液样品、或冷冻的血液样品。在一些实施方案中，本公开的样品为组织样品。本公开的样品来自或包括：羊水、血液、血浆、血清、精液(semen)、淋巴液、脑脊髓液、眼液(ocularfluid)、尿、唾液、粪便、粘液、汗液、血液、皮肤、毛发、毛囊、唾液、口腔粘液、阴道粘液、汗液、眼泪、上皮组织、尿液、精液(semen)、精液(seminalfluid)、精浆、前列腺液、考珀液(cowper’sfluid)、排泄物、活体组织、腹水、脑脊髓液、和/或淋巴。在一些实施方案中，样品为固体样品。在一些实施方案中，样品为液体样品。
在一些情况中，样品的来源来自患病的或疑似患病的细胞、液体、组织、或器官。在一些实施方案中，样品的来源为正常(非患病的)细胞、液体、组织、或器官。在一些实施方案中，样片来自疑似具有微生物感染、例如病毒感染的个体。例如，样品的来源可以是其可能或可能不被感染的个体--并且样品可为收集自个体的任何生物样品(例如，血液、唾液、活体组织、血浆、血清、支气管肺泡灌洗、痰、粪便样品、脑脊髓液、细针抽出物、拭子样品(例如，口腔拭子、子宫颈拭子、鼻拭子)、间质液、滑液(synovialfluid)、鼻涕、眼泪、血沉棕黄层(buffycoat)、粘膜样品、上皮细胞样品(例如，上皮细胞刮屑(epithelialcellscraping))，等)。在一些情况中，样品为无细胞的液体样品。在一些情况中，样品为可包含细胞的液体样品。病原体包括病毒、真菌、细菌、原生动物、和微生物寄生虫。
iv.试剂盒或制品
本文还提供用于本文所述的检测方法和诊断方法的任一者的试剂盒和制品。
在一些实施方案中，提供包括本文所述的干粉组合物的任一者的试剂盒。试剂盒可有用于在单个反应管中进行逆转录、rpa和/或基于crispr/cas的核酸检测反应。
在一些实施方案中，提供包括本文所述的检测板的任一者的试剂盒。检测板可包括设计用于检测一个或多个目标靶核酸、例如病毒或细菌的基因组核酸序列的试剂。
在一些实施方案中，提供包括本文所述的荧光检测设备或系统的任一者的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个本文所述的检测板。荧光检测系统可重复使用。
还提供包括本文所述的组合物、设备、系统、或试剂盒的任一者的制品。制品可包括，例如，容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。制品可还包括从商业或用户观点来看期望的其它材料，包括样品收集管、毛细管、手套、缓冲液、溶剂、稀释剂、过滤器、针、注射剂等。
本申请的试剂盒和制品还可包括信息，例如以包装插页的形式。插页或标签可采用任何形式，例如纸或在诸如磁性记录介质(例如，软盘)、cd-rom、和通用串行总线(usb)闪存盘等电子介质上。在一些实施方案中，试剂盒还包括在本文所述的检测方法和诊断方法的任一者中使用试剂盒的说明书。
实施例
以下实施例仅旨在作为本申请的示例，因此不应被认为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述作为说明而不作为限制提供。
实施例1.使用示例性快速检测试剂盒的病毒感染诊断
本实施例描述包括本发明的示例性荧光检测设备的试剂盒用于病毒感染的检测。试剂盒适于在二级医院、社区医院或诊所、机场、和火车站由医务人员诊断病毒感染(例如2019-ncov即sars-cov2)。试剂盒包含用于准备、取样、和孵育的一次性消耗品。荧光检测设备可重复使用。
试剂盒包括：1.75％乙醇用于在测试前后去污染；2.pe手套；3.口罩；4.棉签；5.病毒取样试剂盒(virussamplingkit，yocon)；6.20μl毛细管(包括橡胶尖端(rubbertip))；7.冻干试剂；8.3vled，波长490nm；9.生物危害废弃物袋；10.检测板；11.胶带或3d打印的pdms盖；12.温度计；13.烧瓶和镊子；14.移动电话软件；和15.cr2032电池、电池盒、开关、和电线。
图1示出使用试剂盒的示例性总工作流程的示意图。图15提供总结工作流程中的各种步骤的流程图。
样品通过咽拭子从疑似具有病毒感染的患者获得并且保存在含有病毒保存液的病毒取样管(virussamplingkit，yocon)中。测试前，在56℃下孵育样品10分钟来灭活病毒并使病毒基因组(例如，病毒rna)释放至样品中。
使用顶端具有橡胶吸球(rubberbulb)的20μl毛细管将病毒保存液中的20μl样品添加至检测板(210)的反应池(212或214)中，所述反应池含有试剂粉末。检测板包括用于阴性对照的反应池，向其添加20μl的水或不具有病毒的病毒保存液。检测板还可包括用于阳性对照的反应池。试剂粉末包括用于进行逆转录的试剂(例如，逆转录酶、靶特异性引物、脱氧核苷酸)、重组酶聚合酶扩增(用于扩增病毒核酸的正向和反向rpa引物、重组酶、ssb和链置换聚合酶)、和基于crispr/cas的核酸检测试剂(例如，cas12b、指导rna、fam标记的单链检测dna)。板由盖(220)覆盖并在孵育箱(300)中在42℃下孵育40分钟。
在荧光检测设备(100)中检测来自检测板的荧光信号。荧光检测设备的光源为具有490nm波长的3vled光(120)。样品发出的光由选择性地透射550nm的光的滤光器过滤。由移动电话获得板上的反应池的图像并通过电话上的移动应用分析。
将检测板、镊子、咽拭子、手套、口罩、病毒取样管、毛细管在生物危害废弃物中处置并通过乙醇去污染。
图14a-14b示出含有具有预先确定的浓度的病毒rna的样品的两个检测板的图像。图14a中，顶部池和中部池为阴性对照，底部池每μl含有1个拷贝的靶病毒rna。图14b中，顶部池为阴性对照，中部池每μl含有1个拷贝的靶病毒rna，底部池每μl含有108个拷贝的靶病毒rna。
1.一种用于检测来自检测板的荧光信号的系统，其包括：
基座结构，其包括支承面；
发光二极管(led)单元，其附接至所述基座结构，其中所述led单元包括：
led光源，
锥形反射器，其配置为聚焦由led光源发出的光束，以使光束沿着所述支承面传输并穿过置于所述支承面上的检测板；和
壳体，其配置为封入所述基座结构和所述led单元，其中所述壳体包括开口；
其中包括相机模块的移动计算设备可以附接至所述壳体，以捕获通过所述开口的所述检测板的图像。
2.根据权利要求1所述的系统，其中将所述锥形反射器配置为聚焦所述光束，使得所述光束相对于所述支承面呈约10°以下的角度。
3.根据权利要求2所述的系统，其中将所述锥形反射器配置为聚焦所述光束，使得所述光束平行于所述支承面。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的系统，其还包括配置为置于所述开口上方的滤光器。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中所述led光源具有约470nm至约510nm的波长。
6.根据权利要求4或5所述的系统，其中所述滤光器选择性地透射波长约530至约580nm的光。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述壳体为包括具有所述开口的表面的盒，其中所述移动计算设备可以附接至所述表面。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的系统，其还包括封入在所述壳体中的用于led光源的电池。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中所述基座结构与所述led单元是可拆卸的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其还包括配置为置于所述支承面上的所述检测板。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统，其中所述检测板包括两个或更多个反应池。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的系统，其还包括配置为将所述相机模块置于所述开口上方的所述移动计算设备。
13.一种检测板，其包括两个或更多个反应池，其中每个反应池包括干粉组合物，所述干粉组合物包括：
(a)cas核酸酶，
(b)指导rna，其包括结合至所述cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列；和
(c)检测dna，其包括荧光标签，其中所述检测dna为单链并且不与指导rna的指导序列杂交，并且其中来自所述荧光标签的荧光信号在所述检测dna切割后是可检测的。
14.根据权利要求13所述的检测板，其中所述荧光标签是fam。
15.根据权利要求14所述的检测板，其中所述干粉组合物还包括：
(a)重组酶，
(b)单链dna结合蛋白(ssb)；
(c)链置换聚合酶；
(d)用于扩增所述靶核酸的正向引物和反向引物；和
(e)dntp。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的检测板，其中所述干粉组合物还包括：
(a)逆转录酶；和
(b)逆转录引物。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的检测板，其中每个反应池的体积为约20μl至约200μl。
18.一种检测样品中靶核酸的方法，其包括：
(a)将所述样品加样至根据权利要求13-17中任一项所述的检测板的反应池中；
(b)在适合所述靶核酸或其扩增子的cas切割的温度下孵育所述检测板；
(c)将所述检测板置于根据权利要求1-9中任一项所述的系统中的所述支承面上；
(d)将包括相机模块的移动计算设备附接至所述系统，以将所述相机模块置于所述系统的所述开口的上方；和
(e)使用所述移动计算设备的所述相机模块捕获所述反应池的图像，从而检测所述样品中所述靶核酸的存在与否。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述步骤(b)包括在约42℃下孵育所述检测板约5分钟至约40分钟。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述靶核酸是病毒dna、细菌dna、真菌dna、原生动物dna或藻类dna。
21.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述靶核酸是病毒rna。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述病毒rna是来自冠状病毒的rna。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述样品是鼻或咽拭子样品。
24.一种诊断个体中微生物感染的方法，其包括使用根据权利要求18-23中任一项所述的方法检测与来自所述个体的样品中的所述微生物感染相关的微生物的靶核酸。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染或病毒感染。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物感染是冠状病毒感染。
27.一种干粉组合物，其包括：
(a)cas核酸酶，(b)指导rna，其包括结合至cas核酸酶的序列和与目标靶核酸杂交的指导序列；(c)检测dna，其包括荧光标签，其中所述检测dna为单链并且不与所述指导rna的所述指导序列杂交，并且其中来自所述荧光标签的荧光信号在所述检测dna切割后是可检测的；(d)重组酶；(e)单链dna结合蛋白(ssb)；(f)链置换聚合酶；(g)用于扩增所述靶核酸的正向引物和反向引物；(h)dntps；(i)逆转录酶；和(j)逆转录引物。
28.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-9中任一项所述的系统和/或根据权利要求13-17中任一项所述的检测板。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其还包括用于检测样品中靶核酸或诊断个体中微生物感染的说明书。
技术总结