本发明属于检测技术领域，具体涉及一种苜蓿饲草中黄曲霉素b1含量测定的方法。
背景技术：
霉变是造成饲料大量浪费的世界性危害。据联合国粮农组织估计，全世界每年大约有5％～7％的饲料受真菌侵蚀而发生霉变。真菌在生长繁殖过程产生次生毒性代谢物真菌毒素，牲畜食用了被产毒真菌及其毒素污染的饲料可引起中毒及某些慢性疾病。
黄曲霉毒素(aflatoxins)是黄曲霉或寄生曲霉产生的一类次级真菌毒素。污染粮食的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2和m1等。在天然污染的粮食中，黄曲霉毒素b1(即afb1)毒性最大，奶牛可将饲料中的黄曲霉毒素b1转化为乳品中的黄曲霉毒素m1，进而带来乳品和乳制品的食品安全问题。黄曲霉毒素b1可在粮食和饲草中检测到，尤其是高温高湿地区的检出率和含量更高。
目前已建立各种食品中黄曲霉素的检测方法，如液-质联用法、高效液相色谱法、酶联免疫法等。其中酶联免疫法抗体等耗材昂贵，液-质联用法和高效液相色谱法需要柱前或柱后衍生以提高方法的灵敏度，这些都增加了检测成本。同时国家标准规定的样品前处理方法均采用iac对黄曲霉素进行提取和净化，这些前处理方法虽然灵敏度高，选择性好，但成本高，操作繁琐。因此探索灵敏、经济、快速的方法提取饲草中的黄曲霉素是十分必要的。
技术实现要素：
针对上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种苜蓿饲草中黄曲霉素b1含量测定的方法，以解决现有技术成本高，选择性低的问题。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种苜蓿饲草中黄曲霉素b1含量测定的方法，包括有如下步骤：将种植或购买的紫花苜蓿饲草当作大宗产品处理，子样的采集按照系统采样法，按相同的时间、空间或质量的间隔采取子样，第一个子样在第一个间隔内随机采取，其余的子样按选定的间隔采取。以苜蓿饲草灰分的质量分数表示采样精密度，灰分精密度a为±(1％-5％)，灰分标准差s为±(2％-3％)，采集子样数为n，子样数量n的建立由单个子样的标准差s和采样精密度a来确定
(1)制备不同样品的待测紫花苜蓿饲草溶液：将每份苜蓿饲草样品粉碎，时间至少为10秒，过60目筛，以保证样品的均一性，称取5g固体饲草样品于50ml塑料离心管中，加入20ml甲醇和水混合溶液(75:25，v/v)，超声提取30min后，以10000rpm离心5min，取上清液备用。
(2)制备磁性分子印迹纳米材料；
(3)取待测饲草溶液20ml，并加入磁性分子印迹纳米颗粒afb1-ba3v2o8(eu)@pda15mg，调节ph值为7.5，超声吸附搅拌均匀，混合液在外加磁场作用下分层，除去上层清液，下层沉淀用近红外光谱仪进行漫反射测定，磁性分子印迹纳米材料以超声辅助方式分散于溶液中，将目标物与干扰物有效分离，并通过外加磁场，使该印迹材料快速沉降，达到高效净化的目的，无需经离心或过滤方式与溶液分离，是一种更方便经济的方法；
(4)用甲醇将黄曲霉素b1从磁性分子印迹纳米材料中解吸，在外加磁场作用下分层，收集上层清液，吸取少量解吸液用超高效液相色谱进行黄曲霉素b1测定；
(5)对不同样品重复步骤1-4进测定，根据步骤3中苜蓿饲草溶液与磁性分子印迹纳米颗粒afb1-ba3v2o8(eu)@pda结合的近红外漫反射光谱图和步骤4洗脱后超高效液相色谱结果建立的近红外光谱线性模型得出饲草中黄曲霉素b1含量。
进一步，所述超声萃取吸附时间为5min。
进一步，所述外加磁场是指以磁铁作为外加磁场源。
进一步，步骤4中的解析液为甲醇，用2ml甲醇，分两次解吸，每次1min。
进一步，应用傅立叶变换近红外光谱仪采集吸附黄曲霉素b1的磁性分子印迹纳米颗粒的光谱信息。具体包括：选择吸收模式采集样品漫反射光谱，光谱扫描范围为10000-4000cm-1，分辨率为16cm-1，扫描次数为32次，每个样品重复扫描3次，计算其平均光谱。
光谱预处理的实现包括：对漫反射原始光谱进行导数处理、标准正态变量变换和去趋势分析等处理，用opus光谱软件将近红外光谱值与超高效液相色谱化学值关联，利用偏最小二乘法建立近红外光谱线性模型，并对模型进行优化和评价。代表性苜蓿饲草样品溶液用磁性分子印迹纳米颗粒afb1-ba3v2o8(eu)@pda结合后，应用傅立叶变换近红外光谱仪采集吸附饲草afb1的磁性纳米颗粒的漫反射光谱，并对甲醇洗脱后的上清用超高效液相色谱进行检测，将近红外光谱结果和液相色谱结果建立模型并对模型进行优化和评价。
进一步，所述高效液相色谱检测条件为:色谱柱:c18柱，碳十八烷基硅烷键合硅胶粒径为5μm。流动相:乙腈、甲醇、体积浓度0.1％甲酸水溶液，体积比20:30:50。荧光检测器激发波长:360nm，发射波长:440nm。
所述磁性分子印迹纳米材料按如下方法制备：
⑴铕掺杂钒酸钡纳米颗粒的合成
室温下，将总量为9克的复合氢氧化物(naoh/koh)以摩尔比为51.5∶48.5的比例均匀混合后放入25ml有盖的teflon管中；将0.5mmolbacl2和0.5mmolv2o5混合均匀后，再加入微量硝酸铕作为掺杂物，倒入teflon管中；将teflon管放入高压釜中，密封后置入预先加热到200℃的马弗炉中保温13h；保温后取出高压釜自然冷却到室温，将产物用去离子水溶解，洗涤，过滤，收集去除产物表面上的氢氧化物，然后再用去离子水和无水乙醇洗涤数次，最后在60℃烘干得到白色的钒酸钡掺铕样品。
⑵钒酸钡掺铕磁性分子印迹材料的合成
称取0.2g钒酸钡掺铕纳米材料颗粒于250ml三颈瓶中，加入80mltris-hcl缓冲溶液(10mm,ph8.5)。室温下，机械搅拌1h直至钒酸钡掺铕纳米材料颗粒均匀分散于缓冲液中。再加5ml2μg/ml模板分子afb1，继续搅拌2h，使afb1更好地与钒酸钡掺铕纳米材料颗粒表面接触。随后，加入100mg多巴胺盐酸盐，再继续搅拌反应4h。最后，在外加磁铁作用下，将固体产物与溶液分离。产物依次用超纯水洗涤5次以去除未反应的多巴胺，6％乙酸-60％甲醇溶液(v/v)洗涤直至afb1未被液相色谱检测出来，超纯水洗涤5次使溶液呈中性，获得的afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料在60℃真空干燥6h；由于聚多巴胺在溶液中稳定，与黄曲霉素相容性好，可以在磁性分子印迹复合材料表面形成了含有活性官能团的聚合物薄膜，可实现进一步对黄曲霉素有效萃取的功能化。
与现有技术相比，本发明技术具有以下有益效果:
⑴针对饲草成分体系复杂，黄曲霉素含量极低这一特点，以及磁性材料增强近红外光谱信号的特性，建立高灵敏度的磁性分子印迹纳米颗粒afb1-ba3v2o8(eu)@pda—近红外漫反射—高效液相色谱荧光法对黄曲霉毒素b1进行含量测定研究，afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹纳米颗粒与超高效液相色谱-荧光检测法相结合，进一步提高了方法的灵敏度，黄曲霉素b1的检出限为0.18pg/ml，比国家标准方法要低。
⑵该发明无需利用净化柱和抗体等试剂耗材，磁性分子印迹纳米颗粒还可以解吸后重复利用10次，具有成本低的优点。磁性分子印迹纳米材料的吸附预富集饲草黄曲霉素b1后可直接采集近红外漫反射光谱，且无需洗脱，为苜蓿饲草溶液中黄曲霉素b1的定量分析提供了一种可能的快速方便的方法。
⑶该功能化的磁性分子印迹纳米颗粒afb1-ba3v2o8(eu)@pda具有适合黄曲霉素b1的空间结构，具有高度的专一性，对黄曲霉素b1选择性好，同时又具有超顺磁性，在微量黄曲霉素b1样品的前处理方面是理想的固相吸附剂。
附图说明
图1为本发明实施中苜蓿饲草中黄曲霉毒素的快速检测方法的流程示意图。
图2为黄曲霉毒素b1真实值与预测值的相关性图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
如图1和图2所示，本发明实施例提供一种苜蓿饲草中黄曲霉素b1含量测定的方法，
本发明实施例所用苜蓿饲草由重庆天友集团武陵山牧场提供。
本发明实施例外加磁场均以150mm×120mm×30mm的磁铁块靠近烧杯作为外加磁场源。
实施例
磁性分子印迹纳米颗粒afb1-ba3v2o8(eu)@pda的制备
⑴铕掺杂钒酸钡纳米颗粒的合成
室温下，将总量为9克的复合氢氧化物(naoh/koh)以摩尔比为51.5∶48.5的比例均匀混合后放入25ml有盖的teflon管中；将0.5mmolbacl2和0.5mmolv2o5混合均匀后，再加入微量硝酸铕作为掺杂物，倒入teflon管中；将teflon管放入高压釜中，密封后置入预先加热到200℃的马弗炉中保温13h；保温后取出高压釜自然冷却到室温，将产物用去离子水溶解，洗涤，过滤，收集去除产物表面上的氢氧化物，然后再用去离子水和无水乙醇洗涤数次，最后在60℃烘干得到白色的钒酸钡掺铕样品。
⑵钒酸钡掺铕磁性分子印迹材料的合成
称取0.2g钒酸钡掺铕纳米材料颗粒于250ml三颈瓶中，加入80mltris-hcl缓冲溶液(10mm,ph8.5)。室温下，机械搅拌1h直至钒酸钡掺铕纳米材料颗粒均匀分散于缓冲液中。再加5ml2μg/ml模板分子afb1，继续搅拌2h，使afb1更好地与钒酸钡掺铕纳米材料颗粒表面接触。随后，加入100mg多巴胺盐酸盐，再继续搅拌反应4h。最后，在外加磁铁作用下，将固体产物与溶液分离。产物依次用超纯水洗涤5次以去除未反应的多巴胺，6％乙酸-60％甲醇溶液(v/v)洗涤直至afb1未被液相色谱检测出来，超纯水洗涤5次使溶液呈中性。获得的afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料在60℃真空干燥6h。
近红外光谱结果和液相色谱结果建立关联模型：
⑴代表性苜蓿饲草afb1萃取过程的建立：称取10mgafb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料于100ml烧杯中，分别加入20ml代表性苜蓿饲草溶液，用0.1mnaoh调节ph为7.5。室温下超声萃取5min后，在外加磁场作用下，此分子印迹材料从溶液中达到快速分离。
⑵结合苜蓿样品afb1的磁性纳米颗粒近红外光谱的采集过程的建立：直接采集吸附富集上afb1的afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料的近红外漫反射光谱信号。选择吸收模式采集样品漫反射光谱，光谱扫描范围为10000-4000cm-1，分辨率为16cm-1，扫描次数为32次，重复扫描3次，计算其平均光谱。
⑶结合苜蓿样品afb1的磁性纳米颗粒解吸后超高效液相色谱的测定过程的建立：2ml甲醇分两次(1ml 1ml)做解吸附剂分别将afb1从磁性分子印迹材料中解吸出来。吸取0.16ml解吸液于1.5ml进样瓶中，加入0.68ml水和0.16ml乙腈，混匀。取10μl上述溶液直接进入hplc，荧光检测器定量分析。
⑷利用hplc检测结果和近红外漫反射光谱结果建立苜蓿样品afb1的近红外定量模型。
磁性分子印迹纳米颗粒萃取条件的优化：
1、样品溶液ph：取紫花苜蓿饲草溶液各20ml，将ph分别调成2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，向样品溶液中分别均匀加入15mg例1方法制备的afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料，超声萃取5分钟，随着溶液中ph不断增大，afb1的萃取回收率则明显增加，直至ph为7.0时，萃取回收率达到最大值，为90.6％。当溶液处于碱性状态时，afb1的萃取回收率显著降低，这可能与黄曲霉毒素b1属中性化合物有关。因此，ph7.0作为溶液的最佳酸度。
2、磁性分子印迹材料的用量：取紫花苜蓿饲草溶液各20ml，调节ph为7.0，分别加入例1方法制备的afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg，超声萃取5分钟，当afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料的用量增大到15mg时，其回收率由67.6％增大到90.1％；当材料使用量继续增加时，回收率则迅速下降到60％。因此，实验选择15mg为磁性分子印迹材料用量。
3、磁性分子印迹纳米颗粒超声萃取吸附时间：取紫花苜蓿饲草溶液各20ml，调节ph为7.0，加入15mgafb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料，超声萃取时间设定为1min、2min、5min、10min、15min、20min，超声时间增加到5min时，afb1的萃取回收率增加到90％，随时间增加，其回收率没有明显增加，因此，5min为最佳超声萃取吸附时间。
4、解吸液体积：取紫花苜蓿饲草溶液各20ml，调节ph为7.0，加入15mgafb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料，超声萃取时间为5min，以甲醇为解吸附剂，当甲醇使用量为1ml、2ml、3ml、4ml、5ml时，afb1的回收率没有明显变化，因此，选择2ml甲醇分两次(1ml 1ml)为最佳使用量。
5、样品体积：向体积为10、20、50、100、150和200ml紫花苜蓿饲草溶液中加入20μl浓度为100ng/mlafb1标准溶液，在优化后的实验条件下对黄曲霉毒素b1进行富集和解吸实验。在较低的样品体积时，黄曲霉毒素b1的回收率较大，随着样品体积逐渐加大时，黄曲霉毒素的回收率也逐渐下降。因此20ml作为最佳苜蓿饲草样品体积。
苜蓿饲草中黄曲霉素b1的含量测定：
量取苜蓿饲草溶液20ml，均匀加入15mgafb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料，搅拌并超声萃取吸附5min，外加磁场将afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料与上清液分离，倾出上层溶液。利用傅立叶变换近红外光谱仪扫描吸附了饲草abf1的磁性分子印迹颗粒，选择吸收模式采集样品漫反射光谱，光谱扫描范围为10000-4000cm-1，分辨率为16cm-1，扫描次数为32次，重复扫描3次，计算其平均光谱。并按相同方法对来源于5个天友牧场的120份苜蓿饲草样品进行黄曲霉素b1测定，并制作图2，图中x代表测量值，y代表预测值；黄曲霉素测量值大于10ng/kg饲草的均为新鲜牧草采样后不经干燥贮藏30天样品，r2代表预测值和测量值之间的决定系数，r2＞0.9，表示模型可以较好地进行定量分析，rpd代表相对分析误差，rpd＞3，表示定标模型成功，sec表示校正标准差，sep表示预测标准差。
表1不同牧场苜蓿饲草样品中黄曲霉素bl含量测定样品测定结果(ng/kg)
注：“—”表示低于定量限
表2苜蓿饲草中黄曲霉素b1定量分析验证集结果(ng/kg)
注：黄曲霉素测量值大于10ng/kg饲草的均为新鲜牧草采样后不经干燥贮藏30天样品
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
1.一种饲草中黄曲霉素b1含量测定方法，其特征在于：
(1)制备不同样品的待测紫花苜蓿饲草溶液：每个样品称取5g粉粹过60目筛的苜蓿饲草样品于离心管中，加入20ml甲醇和水混合溶液，其体积比为75:25，超声提取30min后，以10000rpm离心5min，取上清液；
(2)制备afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料；
(3)在待测紫花苜蓿饲草溶液中加入磁性分子印迹纳米材料5-30mg，调节ph值为2-10，搅拌均匀，室温下超声萃取，同时外加磁场使磁性分子印迹纳米材料在外加磁场作用下分层，弃去上清液体，将磁性分子印迹纳米材料用近红外漫反射光谱分析；
(4)用甲醇将黄曲霉素b1从磁性分子印迹纳米材料中解吸附，在外加磁场作用下分层，收集上层清液，吸取少量解吸液用超高效液相色谱进行黄曲霉素b1测定；
(5)对不同样品重复步骤1-4进测定，用opus光谱软件将近红外光谱值与超高效液相色谱化学值关联，利用偏最小二乘法建立近红外漫反射光谱结果和超高相液相色谱结果间的化学计量模型。
2.如权利要求1所述的饲草中黄曲霉素b1含量测定方法，其特征在于：所述磁性分子印迹纳米材料加入量为15mg，紫花苜蓿饲草溶液体积为20ml，其中有机溶剂的最大允许量为10％甲醇。
3.如权利要求1所述的饲草中黄曲霉素b1含量测定方法，其特征在于：步骤3中所述磁性分子印迹纳米材料对苜蓿饲草溶液中黄曲霉素b1的超声萃取时间为5min；步骤4中解吸附用甲醇2ml，并分两次从分子印迹材料中解吸出来。
4.如权利要求1所述紫花苜蓿饲草中黄曲霉素b1含量测定的方法，其特征在于：所述外加磁场以磁铁作为外加磁场源。
5.如权利要求1所述的饲草中黄曲霉素b1含量测定方法，其特征在于：步骤3中利用傅立叶变换近红外光谱仪扫描吸附苜蓿样品黄曲霉素b1的磁性分子印迹颗粒，选择吸收模式采集漫反射光谱，光谱扫描范围为10000-4000cm-1，分辨率为16cm-1，扫描次数为32次，每个样品重复扫描3次，计算其平均光谱。
6.如权利要求1所述的饲草中黄曲霉素b1含量测定方法，其特征在于：步骤4中所述超高效液相色谱检测条件为:色谱柱:c18柱，碳十八烷基硅烷键合硅胶粒径为5μm；流动相:乙腈、甲醇、体积浓度0.1％甲酸水溶液，体积比20:30:50；荧光检测器激发波长:360nm，发射波长:440nm。
7.如权利要求1所述的饲草中黄曲霉素b1含量测定方法，其特征在于：所述磁性分子印迹纳米材料按如下方法制备：
⑴铕掺杂钒酸钡纳米颗粒的合成
室温下，将总量为9克的naoh/koh以摩尔比为51.5∶48.5的比例均匀混合后放入25ml有盖的teflon管中；将0.5mmolbacl2和0.5mmolv2o5混合均匀后，再加入微量硝酸铕作为掺杂物，倒入teflon管中；将teflon管放入高压釜中，密封后置入预先加热到200℃的马弗炉中保温13h；保温后取出高压釜自然冷却到室温，将产物用去离子水溶解，洗涤，过滤，收集去除产物表面上的氢氧化物，然后再用去离子水和无水乙醇洗涤数次，最后在60℃烘干得到白色的钒酸钡掺铕样品；
⑵钒酸钡掺铕磁性分子印迹材料的合成
称取0.2g钒酸钡掺铕纳米材料颗粒于250ml三颈瓶中，加入80mltris-hcl缓冲溶液；室温下，机械搅拌1h直至钒酸钡掺铕纳米材料颗粒均匀分散于缓冲液中；再加5ml2μg/ml模板分子afb1并继续搅拌2h；随后加入100mg多巴胺盐酸盐，再继续搅拌反应4h；最后，在外加磁铁作用下，将固体产物与溶液分离；产物依次用超纯水洗涤以去除未反应的多巴胺，6％乙酸-60％甲醇体积比的溶液，洗涤直至afb1未被液相色谱检测出来，超纯水洗涤至溶液呈中性；最后将获得的afb1-ba3v2o8(eu)@pda磁性分子印迹材料在60℃真空干燥6h。
技术总结