检测SNP分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用的制作方法

检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明涉及结直肠癌进展诊断试剂盒技术领域，具体涉及检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.单核苷酸多态性是指在基因水平上由单个核苷酸变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，具有高密度、稳定遗传和易于分型的特点，在疾病诊断以及药物开发等领域都有着很高的研究价值和应用前景。但目前仍缺乏用于识别具有高进展风险结直肠癌患者的分子标记。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用。本发明所述应用制备得到的试剂盒能够无创、准确的检测linc01978基因rs60012205 g>a位点的基因型，识别具有高进展风险的结直肠癌患者。
4.本发明提供了检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用，所述snp分子标记含有位于linc01978基因上rs60012205位点处多态性为g或a的核苷酸序列。
5.优选的是，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述核苷酸序列的第272位多态性为g或a。
6.本发明还提供了一种检测高进展风险结直肠癌患者识别用snp分子标记的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
7.本发明还提供了一种识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物和反应液。
8.优选的是，所述试剂盒还包括上述技术方案所述应用中snp分子标记的测序用引物，所述测序用引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.优选的是，所述试剂盒还包括棉拭子。
10.优选的是，所述反应液包括dna提取试剂和pcr扩增试剂；所述dna提取试剂包括chelex
‑
100和蛋白酶k；所述pcr扩增试剂包括2
×
taq pcr master mix。
11.本发明提供了检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用。本发明所述应用制备得到的试剂盒能够无创、准确的检测待测者rs60012205 g>a位点的基因型，有助于识别具有高进展风险的结直肠癌患者，实施个体化治疗。试验结果表明，位于linc01978基因上的单核苷酸多态性位点rs60012205 g>a与结直肠癌进展存在显著关联；与携带有rs60012205 gg基因型的结直肠癌患者相比，携带rs60012205 aa基因型的结直肠癌患者患iii iv期肿瘤的风险显著增加。
附图说明
12.图1为本发明提供的pcr扩增产物(含rs60012205位点)琼脂糖凝胶电泳图；
13.图2为本发明提供的linc01978基因rs60012205 g>a位点的测序结果(箭头指示rs60012205位点的出峰位置)。
具体实施方式
14.本发明提供了检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用，所述snp分子标记含有位于linc01978基因上rs60012205位点处多态性为g或a的核苷酸序列。本发明所述高进展风险直肠癌患者指的是患者容易患iii iv期肿瘤的风险。本发明发现，位于linc01978基因上的单核苷酸多态性位点rs60012205(g或a)与结直肠癌进展存在显著关联，与携带有rs60012205 gg基因型的结直肠癌患者相比，携带rs60012205 aa基因型的结直肠癌患者患iii iv期肿瘤的风险显著增加。本发明利用检测snp分子标记的试剂鉴定rs60012205 g>a位点的基因型将有助于识别具有高进展风险的结直肠癌患者，对于实施个体化治疗有着重要的价值。
15.在本发明中，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示：ttatatgaacttcccttccatacattatttgaggctgggcacggtggctcacacctgttatcccaacacttttggaggccgagatgggtggatcatctgaggtcaggagtttgagaccagcctgaccaaaatggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaaaattagctgggtgtggtggcgcatgcctgtaatcccagctactcaggaggctgaggcaggataatcgcttgaatccgggaggcagagattgcagtgggcctagatcrtgccattgtactcctgcctaggtgacagagcaagactccgcctcaaaaataaaaaataaaaaataaattatttggaaaaaaaaccagcttaggtttttctgccac；r＝g或a(>nc_000017.11:79923656
‑
79924032homo sapiens chromosome 17,grch38.p13 primary assembly)，所述核苷酸序列的第272位多态性为g或a。
16.本发明还提供了一种检测高进展风险结直肠癌患者识别用snp分子标记的引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.2(f：ttatatgaacttcccttccataca)和seq id no.3(r：gtggcagaaaaacctaagctg)所示。本发明所述引物能够特异性扩增含有rs60012205位点的dna片段。本发明对所述引物的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的人工合成方法进行人工合成即可，如委托公司进行人工合成。
17.本发明还提供了一种识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物和反应液。在本发明中，所述试剂盒还包括棉拭子。在本发明中，所述试剂盒检测的样品优选包括口腔粘膜细胞，本发明优选使用棉拭子进行取样。在本发明中，所述反应液包括dna提取试剂和pcr扩增试剂；所述dna提取试剂包括chelex
‑
100和蛋白酶k；所述pcr扩增试剂包括2
×
taq pcr mastermix。本发明所述试剂盒能够准确的检测待测者rs60012205 g>a位点的基因型，有助于识别具有高进展风险的结直肠癌患者，实施个体化治疗。目前针对单核苷酸多态性位点的检测，大多以外周血基因组dna为模板进行有创检测，本发明的试剂能够用于无创检测待测者rs60012205 g或a位点的基因型，具体的，本发明所述试剂盒能够无创提取基因组dna，同时基于测序仪准确检测待测者rs60012205 g>a位点的基因型。
18.在本发明中，所述dna提取的方法优选为chelex
‑
100法，包括以下步骤：在样品中加入chelex
‑
100，再加入6μl蛋白酶k，混匀，水浴，冷却，离心取上清，得到dna。本发明得到
dna后，优选将dna稀释到工作浓度5～10ng/μl。
19.提取得到dna后，本发明进行pcr扩增，在本发明中，所述pcr扩增的反应体系以20μl为例，优选包括引物f和r各1μl(10um)，10μl 2
×
taq pcr master mix，1μl dna模板(待测样品)和7μl ddh2o。在本发明中，所述pcr扩增的程序优选为：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min；4℃保存。
20.在本发明中，所述试剂盒优选还包括上述技术方案所述应用中snp分子标记的测序用引物，所述测序用引物的核苷酸序列如seq id no.4所示：ggtggcgcatgcctgtaatc。本发明对所述引物的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的人工合成方法进行人工合成即可，如委托公司进行人工合成。本发明所述测序用引物能够通过测序仪可以快速准确地对受检者rs60012205位点进行分型。本发明对所述测序仪的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售测序仪即可，如abi3730测序仪。测序结果本发明优选用chromas软件进行分析。位于linc01978基因上的单核苷酸多态性位点rs60012205 g>a与结直肠癌进展存在显著关联，与携带有rs60012205 gg基因型的结直肠癌患者相比，携带rs60012205 aa基因型的结直肠癌患者患iii iv期肿瘤的风险显著增加。
21.下面结合具体实施例对本发明所述的检测snp分子标记的试剂在制备识别高进展风险结直肠癌患者的试剂盒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
22.实施例1
23.1.采用棉拭子收集576例结直肠癌患者的口腔黏膜细胞；
24.2.采用chelex
‑
100提取细胞基因组；
25.3.以基因组dna为模板，使用pcr引物扩增含rs60012205位点的dna片段；
26.4.采用测序引物，对扩增出的dna片段进行测序；
27.5.采用chromas软件分析每一个患者rs60012205位点的基因型；
28.6.采用logistic回归分析linc01978基因rs60012205位点多态性与结直肠癌临床阶段的关系，结果如表1所示。
29.表1 linc01978基因rs60012205 g>a位点多态性与结直肠癌临床阶段的关系
[0030][0031]
结果表明，位于linc01978基因上的单核苷酸多态性位点rs60012205g>a与结直肠癌进展存在显著关联；与携带有rs60012205 gg基因型的结直肠癌患者相比，携带rs60012205 aa基因型的结直肠癌患者患iii iv期肿瘤的风险显著增加。鉴定rs60012205 g>a位点的基因型将有助于识别具有高进展风险的结直肠癌患者，对于实施个体化治疗有着重要的价值。
[0032]
实施例2
[0033]
基于本发明提供的试剂盒检测待测者linc01978基因rs60012205 g>a位点的基因型。
[0034]
1)dna提取
[0035]
用棉拭子收集口腔粘膜细胞，剥取棉拭子表层，放入离心管中，加入5％chelex
‑
100液300ul，使其浸没标本，再加入6μl蛋白酶k，混匀，56℃水浴30min，混匀，沸水浴10min，置于冰上10min，14000r/min离心2min，取上清液dna，使用nano
‑
100测定浓度并将样本稀释到工作浓度5～10ng/μl。
[0036]
2)pcr反应(20μl)：
[0037]
pcr扩增引物各1μl(10um)，10μl 2
×
taq pcr mastermix，1μl dna模板，7μl ddh2o；
[0038]
程序：94℃3min (94℃30s 57℃30s 72℃30s)*32个循环 72℃10min 4℃，∞。
[0039]
扩增结果如图1所示，根据图1可知，运用设计的引物及pcr反应条件可以特异性扩增含有rs60012205位点的片段。
[0040]
3)sanger测序
[0041]
按照sanger测序试剂盒中操作步骤，对pcr产物进行纯化、测序反应和纯化。使用abi3730测序仪对产物进行测序，测序结果用chromas软件进行分析，结果如图2，1～3号样本均为ii期结直肠癌患者，测序分析结果表明，1号样本为aa型，2号样本为ag型，3号样本为gg型，提示1号患者发生高进展结直肠癌的风险更高(根据表1计算可知，aa型患者发生高进展结直肠癌的风险是gg型患者的3.36倍)。
[0042]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。