一种植物组织内生菌总DNA的提取方法与流程

一种植物组织内生菌总dna的提取方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种植物组织内生菌总dna的提取方法。


背景技术：

2.植物个体无论是一粒种子还是参天大树，都是一种相对复杂的生态环境，种类和丰度不同的微生物栖息其中。植物共生菌在植物界广泛分布,种类繁多。一方面,共生菌可能从宿主体内获取营养并通过宿主传播；另一方面,又对宿主植物有促进生长、抵御病虫害、抗逆、固氮等多方面的生物学作用。发挥这些作用的物质基础是伴生菌丰富多样的次生代谢产物,这些生物活性物质在农业、医药等领域具有一定的应用前景。
3.然而在进行植物内生细菌的研究过程中，内生细菌的分离鉴定一般比较困难。集合16s rdna特异片段pcr扩增与第二代高通量测序技术进行植物内生细菌的鉴定是近年来比较流行的一种方法，但是提取的总dna中含有大量的宿主dna，包括大量的线粒体dna与叶绿体dna等，给细菌16s rdna的扩增子的制备造成了极大的干扰。
4.而使用传统的植物组织或细菌提取方法进行提取的基因组dna，存在大量的宿主基因组，会严重干扰内生细菌的扩增以及测序数据质量。使用等渗溶液对叶绿体以及线粒体进行分布去除，操作相对来说比较繁琐，并不适合大批量取。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种植物组织内生菌总dna的提取方法，以解决现有技术的上述问题。
6.本发明的方案是：
7.一种植物组织内生菌总dna的提取方法，包括下列步骤：
8.1)预处理液制备，预处理液ph＝8.0，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙烯吡咯烷酮；
9.2)往1.5ml rnase
‑
free离心管中加入步骤1)中400μl～1ml的预处理液；然后往离心管中加入终浓度为1～10％的巯基乙醇，混匀；
10.3)取80～110mg的植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至所述离心管中，震荡混匀；10000～12000r/min，冷冻离心3～5min；
11.4)弃上清液，往所述离心管内加入500～800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ul rna酶，混匀，37℃孵育30min；
12.6)往所述离心管中加入20ul蛋白酶k，加入25ul sds溶液，混匀，56℃孵育20min；
13.7)往所述离心管中加入等体积的有机溶剂，上下颠倒混匀；
14.8)10000～12000r/min,室温离心5min；
15.9)取上清液，往上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；
16.10)10000～12000r/min,室温离心5min；
17.11)取上清液，往上清液中加入醋酸钠与无水乙醇，混匀，
‑
20℃孵育30min；
18.12)10000～12000r/min,室温离心10min；
19.13)弃上清液，重复清洗一次；
20.14)控干乙醇，加入50ul dnase
‑
free水，得到植物组织内生菌总dna。
21.作为优选的技术方案，所述步骤1)中100ml预处理液包含50mmol/l三羟甲基氨基甲烷，100mmol/l乙二胺四乙酸，10mmol/l氯化钠，0.2～1％v/v的聚乙二醇辛基苯基醚与2～4％w/v的聚乙烯吡咯烷酮。
22.作为优选的技术方案，所述步骤5)中所述裂解液包括50～100mmol/l三羟甲基氨基甲烷、1～2％w/v的十六烷基三甲基溴化铵、1～2mmol/l氯化钠、20～100mmol/l乙二胺四乙酸，所述裂解液ph7
‑
8。
23.作为优选的技术方案，所述步骤5)中所述溶菌酶溶液包括50～100mg/ml溶菌酶、20mmol/l三羟甲基氨基、2mmol/l乙二胺四乙酸与1.2％v/v的聚乙二醇辛基苯基醚。
24.作为优选的技术方案，所述步骤6)中蛋白酶k的浓度为20mg/ml，sds溶液的浓度为10％w/v。
25.作为优选的技术方案，所述步骤11)中醋酸钠的浓度为3～3.5mol/l，醋酸钠的ph为5.2。
26.作为优选的技术方案，所述步骤3)中取100mg的植物材料于液氮中研磨成粉末。
27.作为优选的技术方案，所述步骤7)中有机溶剂包括酚、氯仿与异戊醇，所述酚、氯仿与异戊醇的配制比例为24:25:1。
28.作为优选的技术方案，所述步骤11)中加入的醋酸钠体积为该步骤中上清液体积的三分之一，加入的无水乙醇体积为该步骤中上清液体积的两倍。
29.由于采用了上述技术方案一种植物组织内生菌总dna的提取方法，包括以下步骤：1)预处理液制备，预处理液ph＝8.0，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙烯吡咯烷酮；2)往1.5ml rnase
‑
free离心管中加入步骤1)中400μl～1ml的预处理液；然后往离心管中加入终浓度为1～10％的巯基乙醇，混匀；3)取80～110mg的植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至所述离心管中，震荡混匀；10000～12000r/min，冷冻离心3～5min；4)弃上清液，往所述离心管内加入500～800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ul rna酶，混匀，37℃孵育30min；6)往所述离心管中加入20ul蛋白酶k，加入25ul sds溶液，混匀，56℃孵育20min；7)往所述离心管中加入等体积的有机溶剂，上下颠倒混匀；8)10000～12000r/min,室温离心5min；9)取上清液，往上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；10)10000～12000r/min,室温离心5min；11)取上清液，往上清液中加入醋酸钠与无水乙醇，混匀，
‑
20℃孵育30min；12)10000～12000r/min,室温离心10min；13)弃上清液，重复清洗一次；14)控干乙醇，加入50ul dnase
‑
free水，得到植物组织内生菌总dna。
30.本发明的优点：
31.1、省去了梯度离心的步骤，在预处理过程中预先去除大部分叶绿体、线粒体以及宿主的基因组，随后使用改良的ctab法再进行植物内生细菌基因组提取，操作相对简单；
32.2、现在市面上有许多植物组织提取试剂盒，但价格相对较昂贵且没有针对性；本
方法价格低廉且有针对性提取植物内生细菌，大大降低了实验成本并提高后续实验的成功率。
附图说明
33.图1为绿萝叶片pcr检测电泳图；
34.图中，marker(dl2000)上样量为25μl；1、2泳道为商业试剂盒提取pcr扩增结果；3、4泳道为ctab法提取扩增结果；5
‑
9为改良后的ctab法提取扩增结果(5
‑
9：triton x
‑
100的浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％与1％)。
具体实施方式
35.为了弥补以上不足，本发明提供了一种植物组织内生菌总dna的提取方法以解决上述背景技术中的问题。
36.一种植物组织内生菌总dna的提取方法，包括下列步骤：
37.1)预处理液制备，预处理液ph＝8.0，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙烯吡咯烷酮；
38.2)往1.5ml rnase
‑
free离心管中加入步骤1)中400μl～1ml的预处理液；然后往离心管中加入终浓度为1～10％的巯基乙醇，混匀；
39.3)取80～110mg的植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至所述离心管中，震荡混匀；10000～12000r/min，冷冻离心3～5min；
40.4)弃上清液，往所述离心管内加入500～800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ul rna酶，混匀，37℃孵育30min；
41.6)往所述离心管中加入20ul蛋白酶k，加入25ul sds溶液，混匀，56℃孵育20min；
42.7)往所述离心管中加入等体积的有机溶剂，上下颠倒混匀；
43.8)10000～12000r/min,室温离心5min；
44.9)取上清液，往上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；
45.10)10000～12000r/min,室温离心5min；
46.11)取上清液，往上清液中加入醋酸钠与无水乙醇，混匀，
‑
20℃孵育30min；
47.12)10000～12000r/min,室温离心10min；
48.13)弃上清液，重复清洗一次；
49.14)控干乙醇，加入50ul dnase
‑
free水，得到植物组织内生菌总dna。
50.所述步骤1)中100ml预处理液包含50mmol/l三羟甲基氨基甲烷，100mmol/l乙二胺四乙酸，10mmol/l氯化钠，0.2～1％v/v的聚乙二醇辛基苯基醚与2～4％w/v的聚乙烯吡咯烷酮。
51.所述步骤5)中所述裂解液包括50～100mmol/l三羟甲基氨基甲烷、1～2％w/v的十六烷基三甲基溴化铵、1～2mmol/l氯化钠、20～100mmol/l乙二胺四乙酸，所述裂解液ph7
‑
8。
52.所述步骤5)中所述溶菌酶溶液包括50～100mg/ml溶菌酶、20mmol/l三羟甲基氨基、2mmol/l乙二胺四乙酸与1.2％v/v的聚乙二醇辛基苯基醚。
53.所述步骤6)中蛋白酶k的浓度为20mg/ml，sds溶液的浓度为10％w/v。
54.所述步骤11)中醋酸钠的浓度为3～3.5mol/l，醋酸钠的ph为5.2。
55.所述步骤3)中取100mg的植物材料于液氮中研磨成粉末。
56.所述步骤7)中有机溶剂包括酚、氯仿与异戊醇，所述酚、氯仿与异戊醇的配制比例为24:25:1。
57.所述步骤11)中加入的醋酸钠体积为该步骤中上清液体积的三分之一，加入的无水乙醇体积为该步骤中上清液体积的两倍。
58.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
59.实施例1：制备预处理液
60.配制100ml预处液：提取液中包含：50mm三羟甲基氨基甲烷(trise)；10mm氯化钠(nacl)；100mm乙二胺四乙酸(edta)；0.2
‑
1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚(triton x
‑
100)；2～4％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，溶液ph＝8.0；磁力搅拌器上搅拌过夜，高压灭菌；得到预处理液待用。
61.实施例2：提取绿萝叶片总dna
62.1)往1.5ml rnase
‑
free离心管中加入400μl
‑
1ml的预处理液，加入终浓度为1％
‑
10％的巯基乙醇，混匀；
63.2)取100mg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混匀；
64.3)10000
‑
12000r/min，冷冻离心3
‑
5min；
65.4)取上清液，加入500
‑
800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ul rna酶，混匀，37℃孵育30min；
66.5)加入20ul蛋白酶k，加入25ul sds溶液，混匀，56℃孵育20min；
67.6)加入等体积的酚氯仿和异戊醇(比例：24：25：1)，上下颠倒混匀；
68.7)10000
‑
12000r/min,室温离心5min；
69.8)取上清液，往上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；
70.9)10000
‑
12000r/min,室温离心5min；
71.10)取上清液加入1/3体积的醋酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，
‑
20℃孵育30min；
72.11)10000
‑
12000r/min,室温离心10min；
73.12)弃上清液，重复清洗一次
74.13)控干乙醇，加入50ul dnase
‑
free水，得到植物组织内生菌总dna。
75.实施例3：常规ctab提取绿萝叶片总dna
76.1)取100mg植物材料于液氮中研磨成粉末，迅速转移至上述离心管中，震荡混匀；
77.2)10000
‑
12000r/min，冷冻离心3
‑
5min；
78.3)取上清液，加入500
‑
800ul裂解液，混匀，加入50μl溶菌酶，5ul rna酶，混匀，37℃孵育30min；
79.4)加入20ul蛋白酶k，加入25ul sds溶液，混匀，56℃孵育20min；
80.5)加入等体积的酚氯仿和异戊醇(比例：24：25：1)，上下颠倒混匀；
81.6)10000
‑
12000r/min,室温离心5min；
82.7)取上清液，加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；
83.8)10000
‑
12000r/min,室温离心5min；
84.9)取上清液加入1/3体积的醋酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，
‑
20℃孵育30min；
85.10)10000
‑
12000r/min,室温离心10min；
86.11)弃上清液，重复清洗一次
87.12)控干乙醇，加入50ul dnase
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free水，得到植物组织内生菌总dna。
88.实施例4：提取绿萝叶片总dna
89.按照商业提取试剂盒的操作步骤进行提取。
90.将实施例1
‑
4所得的产物利用紫外分光光度计检测浓度和纯度(表1)，表中1、2泳道为实施例4的商业试剂盒提取pcr扩增结果；3、4泳道为实施例3的ctab法提取扩增结果；5
‑
9为通过本发明实施例1～2的改良后ctab法提取扩增结果(5
‑
9：triton x
‑
100的浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％与1％)然后取适量dna进行pcr扩增(图1)；
91.扩增程序：98℃/5min；98℃/30s、53℃/30s、72℃/45s，28个循环；72℃/5min；12℃/∞；引物序列：link_799f25：ctacacgacgctcttccgatctcttgagtaacmggattagataccckg；link_226
‑
1193r：cagacgtgtgctcttccgatctacgtcatccccaccttcc；
92.扩增体系：(25ul)：5xbuffer 5ul；dntp 2ul；forwardprimer(5um)1ul；reverseprimer(5um)1ul；dna template 2ul；fast pfu dna polymerase 0.25ul；ddh2o 14.75ul；
93.表1紫外分光光度计检测结果
94.泳道序号浓度(ng/μl)260/280260/230体积(μl)总量(ng)16.32.280.165031527.41.980.1550370330.22.072.05501510428.22.031.9850141050.322.252.04501660.1282.142.08506.470.1262.092.01506.380.2062.021.885010.390.1401.992.10507
95.从表1可以看出，5～9泳道的260/280的od值与商业试剂盒相差不多，而260/230的od值要比实施例4中使用商业试剂盒好。
96.从图1中可以看出，实施例4中商业试剂盒提取的dna进行扩增后，目的片段较弱(目的片段430bp左右)；实施例3传统ctab法提取的dna进行扩增后，无目的片段；而采用本发明方法的实施例1～2提取的dna进行扩增后，目的片段明显。
97.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。