一种皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在过去的几十年，美容医学中微创手术的需求呈现指数增长。皮内注射填充剂已经成为替代软组织填充整形手术最常用的方法。填充剂被注入到皮肤中从而来补充缺失的皮肤体积或者增加现有的皮肤体积。填充剂与植入设备相比，填充剂具有更小的侵入性，而且会立即产生效果，因此注入填充剂具有更加自然的感觉。
3.然而，注射填充剂最大的缺点就是它们的效果通常都是暂时的。因此，理想情况下，医美整形领域对填充剂的要求主要是安全性(即生物相容性、非免疫原性)、有效性(组织增强效果好、效果时间长、易于注射、且具有不迁移性)和实用性(成本效益高、易于使用和保存)。
4.现在医美领域含有许多不同种类的皮下填充剂。其中，以透明质酸(ha)为基础原料构建的填充剂是目前医美领域最佳的填充剂。根据美国美容整形外科学会的数据，在进行所有皮下填充手术中有85％的手术使用了基于透明质酸的产品。
5.透明质酸是由d
‑
葡萄糖醛酸和n
‑
乙酰基葡萄糖胺二糖重复单元组成的线性聚阴离子多糖。透明质酸被认为是唯一几乎存在于从细菌到人类所有动物体之中的粘多糖。人体细胞外基质以及细胞表面均含有一定量的透明质酸。透明质酸是增加皮肤体积的理想材料，它的优点是具有高度生物相容性、非免疫原性，并且能够结合大量的水。然而，如果直接注射透明质酸到真皮组织，它会通过酶和氧化机理迅速降解(12
‑
24小时)。为了避免透明质酸本身的缺点，现有的策略是通过化学交联透明质酸，提高聚合物网络的粘弹性从而提高透明质酸的抗降解性能并且提高其粘弹性。
6.透明质酸填充剂具有巨大的临床和商业价值，因此自从第一个基于透明质酸的填充剂获得批准后，许多公司推出了类似的产品。透明质酸水凝胶主要是通过将透明质酸与1,4丁二醇二缩水甘油醚(bdde)交联而获得的，现在是面部年轻化医美中最常用的皮下填充剂。现在已经开发了多种制造技术(即vycross、nasha、cmp等)用于生产透明质酸水凝胶填充剂。最近随着对控制面部衰老过程的理解不断提高，透明质酸水凝胶设计正在升级，从而满足特定的临床需求。因此，现在很多公司销售一系列配方，这些配方可能基于相同的技术，但经过调整后可以满足脸部修复的特定需求。尽管透明质酸水凝胶填充剂在医美领域得到了大量应用，但是化学凝胶残余的交联剂易会导致皮肤发生炎症反应。
7.因此，寻找高度生物相容、高抗降解性能、和长效皮下填充赋型效果的透明质酸水凝胶作为医美整形填充剂显得尤为迫切，而且市场前景及商业价值非常巨大。


技术实现要素：

8.本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高度生物相容、高抗降解性能、和长效皮下填充赋型效果的皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶及其制备方法和应用。
9.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
10.本发明致力于开发一种新型的具有完全生物相溶性、抗降解特性和长效皮下填充赋型效果的透明质酸水凝胶作为新型的皮下填充剂。在利用冷冻解冻方法基础上，进一步利用冷冻解冻技术和点击化学共价交联技术制备新型的透明质酸水凝胶作为皮下填充剂，此凝胶具有高度的生物相容性和抗降解特性，且具有长效皮下填充赋型效果，具体方案如下：
11.一种皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：
12.(1)将透明质酸溶于去离子水中，形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)到透明质酸溶液中并搅拌，随后再加入糠胺，反应后，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
13.(2)将糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中，形成糠胺改性的透明质酸溶液，然后调节溶液的ph至酸性，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg)作为交联剂至上述酸性混合溶液，将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻，然后取出所述的容器进行解冻，重复冷冻解冻次数，形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶。
14.混合的酸性溶液经过冷冻后，再在一定的温度条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生d
‑
a点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶。
15.进一步地，所述的透明质酸为生物发酵获得或者从鸡冠等动物组织提取得到；所述的透明质酸的分子量为5
‑
2000kda，透明质酸溶液质量浓度为0.5
‑
10％。
16.进一步地，所述的糠胺与透明质酸重复单元之间的摩尔比为(0.05
‑
1):1；所述的催化剂edc和nhs的质量之和为透明质酸质量的10
‑
100％。
17.进一步地，所述的糠胺改性的透明质酸提纯方法为醇沉法或者透析冷冻干燥法。
18.进一步地，所述的糠胺改性的透明质酸溶液的质量浓度为1
‑
10％，优选1
‑
5％；所述的糠胺改性的透明质酸形成的溶液ph为0
‑
5，优选1
‑
3。
19.进一步地，所述的交联剂马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg)的添加量为糠胺改性的透明质酸质量的1
‑
50％，优选5
‑
20％。
20.进一步地，所述的酸性混合溶液冷冻温度为
‑
80～
‑
20℃，优选
‑
30～
‑
20℃，时间为12
‑
168h，优选48
‑
72h；所述的解冻温度为4
‑
70℃，优选4
‑
30℃，时间为1
‑
20h，优选3
‑
5h；所述的冷冻解冻次数为1
‑
10次，优选2
‑
4次。
21.进一步地，所述的解冻温度为梯度升温解冻，升温速率为0.1
‑
10℃/min。
22.进一步地，所述的酸性混合溶液中还包含化妆品活性分子，具体包括γ
‑
氨基丁酸、葡萄糖、琥珀酸、n
‑
乙酰
‑
d
‑
葡糖胺、d
‑
葡糖醛酸、硫酸软骨素a、硫酸软骨素c或氨基葡萄糖中的一种或多种。
23.一种如上所述方法制备的皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶。
24.一种如上所述的皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶的应用，该双网络水凝胶应用于制备皮下填充剂，具体方法为：将物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并进行透析，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。
25.进一步地，可以先后浸没于磷酸盐缓冲液和离子水中进行透析，也可以用水或者磷酸盐缓冲液洗涤酸性透明质酸双网络水凝胶。
26.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
27.(1)本发明制备的物理和化学双网络透明质酸凝胶具有易制备特性、良好的组织粘附性，而且与商品化的皮下填充剂(效果维持6个月左右)相比，具有更好的抗降解特性(12个月左右)，制备的透明质酸双网络凝胶可以提高透明质酸的作用时间(时间长达12个月以上)；
28.(2)本发明是使用冷冻解冻物理交联方法和点击化学方法制备的透明质酸凝胶，此凝胶交联剂为马来酰亚胺聚乙二醇(peg)，具有很好的生物相容性和长效皮下填充赋型效果，可以用作皮下填充剂。
附图说明
29.图1为实施例1、3透析后形成的透明质酸双网络凝胶的储能模量(g’)和损耗模量(g”)与应变扫描关系图；
30.图2为实施例3
‑
5透析后形成的透明质酸双网络凝胶的储能模量(g’)和损耗模量(g”)与应变扫描关系图；
31.图3为实施例3
‑
5透析后形成的透明质酸双网络凝胶的生物相容性表征图。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
33.一种皮下填充剂用物理和化学双网络水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：
34.(1)将透明质酸溶于去离子水中，形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)到透明质酸溶液中并搅拌，随后再加入糠胺，反应后，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；其中，透明质酸为生物发酵获得或者从鸡冠等动物组织提取得到；所述的透明质酸的分子量为5
‑
2000kda，透明质酸溶液质量浓度为0.5
‑
10％。糠胺与透明质酸重复单元之间的摩尔比为(0.05
‑
1):1；所述的催化剂edc和nhs的质量之和为透明质酸质量的10
‑
100％；
35.(2)将糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中，形成糠胺改性的透明质酸溶液，然后调节溶液的ph至酸性，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg)作为交联剂至上述酸性混合溶液，将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻，然后取出所述的容器进行解冻，重复冷冻解冻次数，形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶。
36.混合的酸性溶液经过冷冻后，再在一定的温度条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上
的马来酰亚胺基团发生d
‑
a点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶。
37.其中，糠胺改性的透明质酸溶液的质量浓度为1
‑
10％，优选1
‑
5％；所述的糠胺改性的透明质酸形成的溶液ph为0
‑
5，优选1
‑
3。交联剂马来酰亚胺聚乙二醇(mal
‑
peg)的添加量为糠胺改性的透明质酸质量的1
‑
50％，优选5
‑
20％。酸性混合溶液冷冻温度为
‑
80～
‑
20℃，优选
‑
30～
‑
20℃，时间为12
‑
168h，优选48
‑
72h；所述的解冻温度为4
‑
70℃，优选4
‑
30℃，时间为1
‑
20h，优选3
‑
5h；所述的冷冻解冻次数为1
‑
10次，优选2
‑
4次。解冻温度为梯度升温解冻，升温速率为0.1
‑
10℃/min。
38.酸性混合溶液中还可以包含化妆品活性分子，具体包括γ
‑
氨基丁酸、葡萄糖、琥珀酸、n
‑
乙酰
‑
d
‑
葡糖胺、d
‑
葡糖醛酸、硫酸软骨素a、硫酸软骨素c或氨基葡萄糖中的一种或多种。
39.接着，该双网络水凝胶可应用于制备皮下填充剂，具体方法为：将物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并进行透析，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。
40.实施例1
41.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
42.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻1次；
43.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在4℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
44.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达12个月。
45.实施例2
46.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，2.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，1.0g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(1.0g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
47.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，1.0g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并
密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻1次；
48.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在4℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
49.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达13个月。
50.实施例3
51.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，4.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，2.0g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(2.0g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
52.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，2.0g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻1次；
53.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在4℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
54.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达15个月。
55.从实施例1
‑
3可以看出，如图1，随着糠胺的加入量增加，凝胶的交联度提升，进而导致力学性能提升，以及作用效果延长，可以进一步拓宽此凝胶的应用潜力。
56.实施例4
57.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
58.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻2次；
59.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在4℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马
来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
60.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达13个月。
61.实施例5
62.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
63.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻3次；
64.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在4℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
65.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达14个月。
66.从实施例1、4、5可以看出，如图1
‑
2，随着重复解冻次数的增加，力学性能提升，以及作用效果延长，可以进一步拓宽此凝胶的应用潜力。
67.这是因为，透明质酸双网络凝胶的降解时间随着冷冻解冻次数增加而逐渐延长。主要是因为冷冻解冻过程中透明质酸网络中形成氢键，冷冻解冻次数越多透明质酸网络中形成的氢键越多，从而导致透明质酸双网络凝胶抗降解能力增强。
68.如图3，可以看出，凝胶具有很好的生物相容性，细胞随着培育时间增加而增殖，这一点可以从光密度值逐渐增大看出，而生物相容性并不受重复冷冻解冻次数的增加的影响。
69.实施例6
70.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
71.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并
密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻3次；
72.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在20℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
73.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达13个月。
74.实施例7
75.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
76.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻3次；
77.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在4
‑
70℃条件下逐渐升温解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
78.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。
79.实施例8
80.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
81.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝2.0)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
‑
peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻72小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻3次；
82.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在20℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
83.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没
于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达12个月。
84.实施例9
85.步骤1：首先将透明质酸(5g)溶于去离子水中(500ml)形成澄清透明的透明质酸溶液，然后加入1
‑
(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，1.0g)和n
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羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.5g)到上述透明质酸溶液中并搅拌一定的时间，随后再加入糠胺(0.5g)并反应24小时，将上述溶液透析冷冻干燥，获得糠胺改性的透明质酸；
86.步骤2：将步骤1获得的糠胺改性的透明质酸溶于去离子水中形成糠胺改性的透明质酸溶液(1％)，然后调节溶液的ph至酸性(ph＝1.5)，再加入马来酰亚胺改性的聚乙二醇(mal
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peg，0.5g)作为交联剂至上述酸性混合溶液。将所得的酸性混合溶液分装至容器中并密封冷冻96小时，然后取出所述的容器进行解冻10小时，重复冷冻解冻3次；
87.步骤3：混合的酸性溶液经过冷冻后，在20℃条件下进行解冻，糠胺化改性的透明质酸形成物理交联的凝胶网络。而在解冻的过程中，透明质酸上的糠胺基团与交联剂上的马来酰亚胺基团发生点击化学反应，形成化学交联的透明质酸凝胶网络，最终形成物理和化学双交联的透明质酸水凝胶；
88.步骤4：将上述的物理和化学双交联的透明质酸水凝胶置于透析袋中，并先后浸没于缓冲液和离子水中进行透析72小时，直至透明质酸双网络水凝胶的ph至中性，然后从透析袋中取出透明质酸凝胶，最终用作皮下填充剂。此凝胶作为皮下填充剂作用效果长达12个月。
89.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。