基于表面生长ZnO纳米线玻璃微球的微流控芯片及应用的制作方法

专利2022-05-10  2


基于表面生长zno纳米线玻璃微球的微流控芯片及应用
技术领域
1.本发明属于生物芯片技术领域,涉及一种基于表面生长zno纳米线的玻璃微球的微流控芯片及其在外泌体捕获中的应用。


背景技术:

2.外泌体是直径30nm

150nm的双层膜性囊泡小体,多由细胞经“内吞

融合

外排”过程分泌至血液、尿液、乳汁、脑脊液等各种体液中。外泌体携带多种蛋白、脂质和核酸等生物信息分子,并通过将这些生物信息分子靶向递送至受体细胞而调控受体细胞的生物学行为,在细胞间信息传递中扮演着重要角色。研究证实,人体几乎所用类型的细胞均能产生外泌体,且不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分及功能,因此外泌体有望成为临床疾病诊断、病情监测和预后判断的新型生物标志物。
3.近年来,纳米技术和微流控技术分别因其在微纳米尺度的可操控性、良好的生物相容性以及检测通量高、可集成等优点,逐渐成为外泌体捕获检测中最具发展前景的技术。纳米材料由于其独特性能,已被广泛应用于光学、电化学和生物医学等研究领域。常见的一维纳米结构包括碳纳米管、硅纳米线和zno纳米线。其中,zno作为一种宽禁带半导体材料,长径比高、比表面积大、具有良好的机械和化学稳定性以及丰富的纳米形貌,在紫外激光器、纳米/气敏传感器、场致电子发射器件、分子水平纳米光电子器件等方面表现出比体相材料更为优异的性能,被广泛应用于生物化学传感器等领域。同时,zno纳米线表面富含各类官能团,可以嫁接上具有特异性识别能力的生物分子,因而被认为是提高外泌体捕获特异性的最佳工具之一。
4.微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统,将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上,加载生物样品和反应液后,采用微机械泵等方法驱动芯片中缓冲液的流动并形成微流路,最终实现在芯片上进行自动、连续性反应。近年来,基于微流控芯片的外泌体捕获分析技术倍受关注。如何将zno纳米线和微流控芯片进行有机整合,充分利用两者在外泌体捕获的优势,实现复杂样本中外泌体的高特异性与高效捕获已成为医工领域关注的热点和难点。


技术实现要素:

5.本发明针对传统芯片外泌体捕获中存在的问题提出一种新型的基于表面生长zno纳米线玻璃微球的微流控芯片及应用。
6.为了达到上述目的,本发明是采用下述的技术方案实现的:一种基于表面生长zno纳米线的玻璃微球的微流控芯片,所述芯片以玻璃载玻片为基底,以聚二甲基硅氧烷为主体,聚二甲基硅氧烷上蚀刻有功能性的微通道,通过光刻技术与等离子刻蚀等方法构筑微通道(不局限于这种方法),微通道内填充玻璃微球组成的微混合器,玻璃微球表面设置采用化学浴沉积法原位生长的zno纳米线,并针对纳米线进行表面抗体修饰,以特异性捕获外泌体。检测样本可以是细胞培养液上清,也可以是临床患者的
各类体液样本。
7.作为优选,玻璃微球直径为540

960mm;所述玻璃微球是面心立方体结构。
8.作为优选,zno纳米线长度为0.5

1um,直径为50

100nm,长径比高达20。
9.作为优选,玻璃载玻片长度为6.5

7.6 cm,宽度为2.0

2.5 cm,厚度为2 mm;聚二甲基硅氧烷长度为3.5

4.6 cm,宽度为1.0

1.5 cm;微通道总体长度为1.2

1.5 cm,微通道最宽处约为0.3

0.5cm,最窄处约为0.8

1.2mm;进样孔和出样孔直径为0.8

1.2 mm。
10.作为优选,zno纳米线表面修饰的抗体为cd63、cd9、cd81、tsg101、gpc

1中的任意一种。
11.基于表面生长zno纳米线的玻璃微球的微流控芯片制备方法,步骤如下:(1)准备玻璃载玻片和聚二甲基硅氧烷,在聚二甲基硅氧烷上蚀刻进样通道、出样通道和与两者相连的微通道;(2)聚二甲基硅氧烷进行表面硅烷化修饰,将紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球填充微通道中;(3)使用化学浴沉积法制备择优取向生长的zno纳米线:采用激光分子束外延法预先在玻璃微球上制备zno种子层,为化学浴沉积过程中zno的沉积提供形核点,有效降低形核功;利用具有均匀分布极性基团的高分子材料结合六亚甲基四胺溶液与锌盐溶液发生反应,使zno晶核在种子层上定向生长出一维结构的zno纳米线;(4)在玻璃微球表面zno纳米线上修饰有特定抗体,所用的抗体可特异性针对不同疾病的外泌体,可以是cd63、cd9、cd81、tsg101、gpc

1等。
12.作为优选,步骤(3)具体操作为:采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水各超声清洗玻璃微球2

3次,每次5

10min,然后用氮气吹干;利用激光分子束外延沉积系统将zno融化,使其以等离子羽辉的形式运送到玻璃微球表面完成种子层的沉积制备,沉积温度为150

300℃,沉积时间为20

40min;用丙酮、无水乙醇和蒸馏水各超声清洗种子层5

10min,用氮气吹干,待用;将制备好的含种子层的玻璃微球置于含有3
ꢀ‑
5mol/l聚乙烯亚胺、0.05
ꢀ‑
1mol/l zn(no3)2和0.05
ꢀ‑
1mol/l六亚甲基四胺的混匀混合溶液中,85
‑ꢀ
95 ℃孵育反应6

12 h,待生长完成后,洗净、风干并200

400℃烘烤20

40 min,待用;步骤(4)具体操作为:将生长zno纳米线的玻璃微球的芯片浸入3

巯基丙基三甲氧基硅烷溶液中,室温反应1 h;多余的3

mps用70%的乙醇洗涤3次;然后将上述芯片浸入n

(4

马来酰亚胺丁酰基)琥珀酸亚胺溶液中,室温反应30 min;用pbs洗涤后,浸入外泌体膜特异性蛋白抗体溶液中,室温下反应1
ꢀ‑
2h,随后使用注射泵以1
ꢀ‑
2.5 μl/min 的流速用pbs冲洗芯片微通道40
ꢀ‑
60min,完成抗体包被。
13.作为优选,将细胞培养液上清或体液样本注入芯片中进行外泌体捕获,然后用tris

hcl缓冲液以1
ꢀ‑
2.5 μl/min的流速洗脱,收集洗脱液。
14.与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:本发明通过对玻璃微球上原位生长的zno纳米线进行外泌体特异性膜蛋白抗体修饰,通过抗原抗体免疫识别特异性捕获样本中的外泌体,并将微球与微流控芯片进行系统整合,发明出基于表面生长zno纳米线的玻璃微球的微流控芯片,优点如下:1.样本消耗少:由于反应只在微通道进行,样本充满微通道只需要20 μl,避免了外接管路产生的样本死体积,有效减少了样本上样量。
15.2.准确度高:本发明采用玻璃微球填充微通道中各微混合器,由于玻璃微球不具有磁性,因此该芯片克服了磁性微球因团聚而使信号相互干扰的局限,极大提高检测的准确度。
16.3.捕获效率高:本发明在玻璃微球表面原位生长上zno纳米线,有效增大了玻璃微球的表面积,提高外泌体的捕获效率。
17.4.可扩展性高:本发明由于采用微流控芯片的形式,因此可以将该外泌体捕获系统与样本预处理等微流控芯片集成,推动外泌体分离

检测

分析系统的微型化发展。
18.5.操作简便:本发明的微流控芯片靶向外泌体特异性膜蛋白如如cd9、cd63、cd81、gpc

1等,可直接将外泌体从样本中分离出来,较目前外泌体分离的金标准(超速离心法)操作步骤简便且耗时短。
附图说明
19.图1为外泌体捕获微流控芯片实物图。
20.图2

3为外泌体捕获微流控芯片示意图。
21.图4为洗脱液中粒子的粒径分布图。
22.图5为初始溶液和洗脱液中物质含量对比图。图6为洗脱液western blot图。
23.各附图标记为:1玻璃载玻片,2聚二甲基硅氧烷,3进样孔,4出样孔,5微通道,6微混合器,7玻璃微球。
具体实施方式
24.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
25.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
26.如图1

3所示,本发明的微流控芯片由三部分组成,包括下层的玻璃载玻片1和上层的聚二甲基硅氧烷2;在所述上层聚二甲基硅氧烷2上蚀刻有进样孔3、出样孔4和与两者相连的微通道5;所述微通道5内为微混合器6,在所述微混合器的内部设有呈面心立方体的玻璃微球7,所述玻璃微球7的表面原位生长有zno纳米线8,zno纳米线上修饰修饰有特异性识别分子。
27.所述微流控芯片体积大小为7.6 cm*2.5 cm*2 mm,所述上层聚二甲基硅氧烷2长度为4.6 cm,宽度为1.5 cm,所述进样孔3和出样孔4直径为1.2 mm;所述微通道5总体长度为1.5 cm,微通道最宽处约为0.5cm,最窄处约1.2mm;所述玻璃微球7直径960 mm;所述zno纳米线8长度为0.5

1 μm,直径为50

100 nm,长径比为20;述的特异性识别分子为特异性识别外泌体膜表面标记的抗体的一种。
28.实施例11. 表面生长zno纳米线的玻璃微球的微流控芯片:

所述芯片是由下半部分的玻璃载玻片和上半部分的聚二甲基硅氧烷组成。具体为:玻璃载玻片长度为6.5cm

7.6cm,宽度为2.0cm

2.5cm,厚度为2mm左右;聚二甲基硅氧烷长度为3.5cm

4.6cm,宽度为1.0cm

1.5cm。
29.②
在聚二甲基硅氧烷上蚀刻一个进样通道、一个出样通道和与两者相连的微通道。具体为:通过光刻技术与等离子刻蚀方法(可以是但不局限于这一种方法)构筑微通道,进样孔和出样孔直径为0.8mm

1.2mm;微通道总体长度为1.2cm

1.5cm,微通道最宽处约为0.3cm

0.5cm,最窄处约为0.8mm

1.2mm。
30.③
微通道内由紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球填充组成微混合器。
31.④
在玻璃微球上原位生长zno纳米线,具体为:首先采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水各超声清洗玻璃微球2

3次,每次5min

10min,然后用氮气吹干;随后利用激光分子束外延沉积系统将zno融化,使其以等离子羽辉的形式运送到玻璃微球表面完成种子层的沉积制备(沉积温度为150℃

300℃,沉积时间为20min

40min);最后用丙酮、无水乙醇和蒸馏水各超声清洗种子层5min

10min,用氮气吹干,待用。其次,将制备好的含种子层的玻璃微球置于含有3mol/l

5mol/l聚乙烯亚胺(pei)、0.05mol/l

1mol/l zn(no3)2和0.05mol/l

1mol/l六亚甲基四胺的混匀混合溶液中,85℃
‑ꢀ
95 ℃孵育反应6h

12 h,待生长完成后,洗净、风干并200℃

400℃烘烤20min

40 min,待用。
32.⑤
zno纳米线上修饰抗体,具体为:将生长zno纳米线的玻璃微球的芯片浸入3

巯基丙基三甲氧基硅烷(3

mps)(5%,无水乙醇)溶液中,室温反应1 h左右;多余的3

mps用70%的乙醇洗涤3次;然后将上述芯片浸入n

(4

马来酰亚胺丁酰基)琥珀酸亚胺(gmbs)(0.25 mg/ml,二甲亚砜)溶液中,室温反应30 min左右;用pbs洗涤后,将上述芯片浸入外泌体膜特异性蛋白抗体溶液(20ug/ml

100ug/ml,pbs)中,室温下反应1 h

2h,随后使用注射泵以1ul/min

2.5 μl/min的流速用pbs冲洗芯片微通道40 min

60min,完成抗体包被。
33.2.基于表面生长zno纳米线的玻璃微球的微流控芯片在外泌体捕获中的应用:利用上述修饰特定抗体的微流控芯片捕获外泌体的方法。具体为:以0.5ul/min

1 μl/min流速将细胞培养液上清或体液样本注入芯片中进行外泌体捕获,然后用10 mm tris

hcl缓冲液(ph 8.8)以1ul/min

2.5 μl/min的流速洗脱,收集洗脱液。
34.实施例21.微流控芯片的制备:利用光刻技术与等离子刻蚀方法在聚二甲基硅氧烷上蚀刻出进样孔、出样孔和与两者相连的微通道。
35.具体过程如下:

模具制备:准备一块玻璃载玻片和一片硅片,经清洗硅片、烘干、匀胶(su

8光刻胶)、甩胶、前烘、曝光、厚烘和显影等步骤制作模具(制作微通道)。
36.②
按聚二甲基硅氧烷:固化剂(医用液体硅胶灌封胶rtv615)=10:1的质量比混合均匀,除去混合物中气泡后浇注在模具上,80℃

90 ℃加热固化1小时,无需冷却,小心剥离模具与固化物,所得即为微流控芯片的上层聚二甲基硅氧烷。
37.③
等离子体处理微流控芯片的上层聚二甲基硅氧烷(仪器内压强为-98kpa,紫外灯射频功率90w,处理15s),gptms(5%,无水乙醇)无水乙醇溶液室温反应1 h对微流控芯片的上层聚二甲基硅氧烷进行表面硅烷化修饰,将紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球填充微通道中,用打孔针在上层盖片上打进样孔和出样孔。
38.2.在玻璃微球表面生长zno纳米线的方法:利用化学浴沉积法在玻璃微球表面原位生长垂于c轴生长的zno纳米线。
39.具体过程如下:

种子层制备:首先采用丙酮、无水乙醇和蒸馏水各超声清洗玻璃微球3次,每次10min,然后用氮气吹干;随后用激光分子束外延沉积系统将zno融化,使其以等离子羽辉的形式运送到玻璃微球表面完成种子层的沉积制备(沉积温度为200℃,沉积时间为25min);最后用丙酮、无水乙醇和蒸馏水各超声清洗种子层10min,用氮气吹干,待用。
40.②
在含种子层的玻璃微球上生长zno纳米线:将pei溶液(5 mmol/l)、zn(no3)2溶液(0.05 mol/l)和六亚甲基四胺溶液(0.05 mol/l)在烧杯中混合均匀,把预先沉积好种子层的玻璃微球置于上述溶液中,90 ℃孵育9 h,待生长完成后,洗净,风干,300 ℃烘烤25min,以去除zno纳米线表面的有机残留物。
41.3.胰腺癌细胞培养上清中外泌体的捕获微流控芯片进行外泌体捕获,具体步骤如下:

zno纳米线上包被bsa或修饰特异性gpc

1抗体:将生长zno纳米线的玻璃微球的芯片浸入3

巯基丙基三甲氧基硅烷(3

mps)(5%,无水乙醇)溶液中,室温反应1 h左右,多余的3

mps用70%的乙醇洗涤3次;然后将上述芯片浸入n

(4

马来酰亚胺丁酰基)琥珀酸亚胺(gmbs)(0.25 mg/ml,二甲亚砜)溶液中,室温反应30 min左右;用pbs洗涤后,将上述芯片浸入gpc

1抗体溶液( 100ug/ml,pbs)中,室温下反应2h,随后使用注射泵以2.5 μl/min的流速用pbs冲洗芯片微通道40 min,完成gpc

1抗体包被。
42.相应地,将生长zno纳米线的玻璃微球的芯片浸入3

巯基丙基三甲氧基硅烷(3

mps)(5%,无水乙醇)溶液中,室温反应1 h左右,多余的3

mps用70%的乙醇洗涤3次;然后将上述芯片浸入n

(4

马来酰亚胺丁酰基)琥珀酸亚胺(gmbs)(0.25 mg/ml,二甲亚砜)溶液中,室温反应30 min左右;用pbs洗涤后,将上述芯片浸入bsa溶液( 100ug/ml,pbs)中,室温下反应2h,随后使用注射泵以2.5 μl/min的流速用pbs冲洗芯片微通道40 min,完成bsa包被。
43.ꢀ②
样本外泌体检测:以1 μl/min流速将胰腺癌panc

1细胞系培养液上清(原始溶液)分别注入gpc

1抗体及bsa包被的芯片中进行外泌体捕获,然后用10 mm tris

hcl缓冲液(ph 8.8)以2.5 μl/min的流速洗脱,收集各自洗脱液。纳米颗粒跟踪技术分析外泌体分离效果,免疫印迹实验对洗脱液中的外泌体进行表征,纳米颗粒跟踪技术分析gpc

1包被组及bsa包被组原始溶液及洗脱液中粒子数,检测芯片捕获效率。
44.从图4可以看出,纳米颗粒跟踪分析发现洗脱液中粒子平均粒径及其主峰均在外泌体的粒径范围内。从图5可以看出,纳米颗粒跟踪分析发现gpc

1抗体包被组洗脱液中外泌体粒子数大约占初始溶液的90%左右,表明外泌体捕获效率可达90%,而bsa包被组洗脱液中外泌体粒子数不足5%,表明该芯片的非特异性捕获率极低。图6为洗脱液western blot图,western blot结果表明洗脱液中含有gpc

1、cd9、和tsg101等外泌体特异性标志物,证明使用该种芯片分离捕获的粒子确为外泌体。本发明微流控芯片包括玻璃载玻片、微通道和聚二甲基硅氧烷,在聚二甲基硅氧烷上蚀刻进样通道、出样通道和与两者相连微通道,微通道内设有微混合器,微混合器由紧密排列成面心立方体的玻璃微球组成,采用化学浴沉积法在玻璃微球表面生长zno纳米线,进一步针对玻璃微球上生长的纳米线上修饰外泌体
特异性膜蛋白抗体,实现细胞培养上清或体液样本中外泌体的高效捕获。该发明制备简单,成本低,能耗小,在基础研究和临床疾病诊断、监测、预后判断及治疗等方面具有广泛的应用前景。
45.以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域,但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
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