马铃薯发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种马铃薯发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.马铃薯作为世界第四大粮食作物，其在中国主要用于食用、食品加工、饲料工业和作为发酵培养基等各个方面，在化妆品领域的应用较为罕见。马铃薯中含有丰富的碳水化合物、膳食纤维、维生素、多酚类化合物和类胡萝卜素等多种有益营养物质，如何从营养丰富的马铃薯中提取适用于化妆品领域的活性物质是本领域亟待解决的问题。
3.目前，化妆品领域常用的活性物质提取方法众多，例如水提取法、有机溶剂提取、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法和微生物发酵法等。面对如此众多的提取方法，如何筛选出更利于马铃薯中活性物质提取的方法，仍是本领域研发人员面临的技术难题。
4.因此，本领域亟需开发一种适用于从马铃薯中提取可用于化妆品领域的活性成分的提取方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中没有可从马铃薯中提取活性成分，并用于化妆品领域的方法的缺陷，而提供一种马铃薯发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本发明制得的马铃薯发酵物具有良好的抗氧化功效和抗衰老功效，使用安全性高，无细胞毒副作用，可被广泛应用于化妆品领域，原料来源广泛，制备成本优势高。
6.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
7.本发明提供一种马铃薯发酵物的制备方法，具体包括如下步骤：酵母菌接种到发酵底物中，经发酵培养、灭菌，即可；其中，所述发酵底物由马铃薯和溶剂组成。
8.本发明中，所述酵母菌较佳地为酿酒酵母菌株(saccharomyces cerevisiae)。
9.其中，所述酿酒酵母菌株(saccharomyces cerevisiae)可为保藏编号为cgmcc 17452的酿酒酵母菌株和/或购买于中国食品酿造研究所的产品编号为21392的黄酒酵母菌株。
10.本发明中，所述酵母菌可按照本领域常规以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度可为105‑
109cfu/ml，较佳地为106‑
107cfu/ml。
11.其中，所述酵母菌菌液与所述发酵底物的质量比可为本领域常规，较佳地为(1
‑
5)：100，更佳地为(3.3
‑
5)：100。
12.其中，所述酵母菌菌液的制备方法可为本领域常规，具体包括如下步骤：所述酵母菌接种于ypd液体培养基中，经发酵培养，即可。
13.所述酵母菌菌液的制备过程中，所述发酵培养可按照本领域常规在摇床上进行，所述摇床的转速可为本领域常规，一般可为150
‑
200rpm，较佳地为180
‑
200rpm。
14.所述酵母菌菌液的制备过程中，所述发酵培养的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为24
‑
60h，更佳地为48
‑
60h。
15.所述酵母菌菌液的制备过程中，所述发酵培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为5
‑
30℃，更佳地为28
‑
30℃。
16.本发明中，所述发酵底物在使用前还可进一步包括灭菌的操作。所述灭菌的条件和方法可为本领域常规。
17.其中，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90
‑
130℃，更佳地为110
‑
130℃。
18.其中，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为15
‑
30min，更佳地为20
‑
30min。
19.本发明中，所述马铃薯可为黄心马铃薯，例如，甘肃黄心马铃薯。
20.本发明中，所述溶剂可为本领域常规使用的溶剂，较佳地为水，例如，去离子水。
21.本发明中，所述马铃薯与所述溶剂的质量体积比可为0.01
‑
0.04g/ml，较佳地为0.02
‑
0.03g/ml。
22.本发明中，所述发酵培养的条件和方法可为本领域常规，一般在摇床上进行，所述摇床的转速可为150
‑
200rpm，较佳地为170
‑
180rpm。
23.本发明中，所述发酵培养的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为36
‑
60h，更佳地为36
‑
48h。
24.本发明中，所述发酵培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为25
‑
30℃，更佳地为25
‑
27℃。
25.本发明中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规。
26.本发明中，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为90
‑
110℃，更佳地为100
‑
110℃。
27.本发明中，所述灭菌时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20
‑
30min。
28.本发明中，所述发酵培养的操作后，还可进一步包括离心的操作。
29.其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，较佳地为4000
‑
4600rpm。
30.其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20
‑
40min。
31.本发明中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括与防腐剂混合的操作。
32.其中，与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为65
‑
75℃，更佳地为70
‑
75℃。
33.其中，所述防腐剂可按照本领域常规包括对羟基苯乙酮和/或1,2
‑
己二醇。当所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和1,2
‑
己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.3％
‑
0.5％，所述1,2
‑
己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.5％
‑
2％；较佳地，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，所述1,2
‑
己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％。
34.本发明还提供一种马铃薯发酵物，其由如上所述的马铃薯发酵物的制备方法制得。
35.本发明还提供一种如上所述的马铃薯发酵物在皮肤外用剂中的应用，所述马铃薯发酵物可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分和/或抗衰老活性成分。
36.本发明中，所述抗氧化活性成分可为具有dpph自由基清除作用的抗氧化活性成分。
37.本发明中，所述抗衰老活性成分可为具有提高人成纤维细胞透明质酸分泌量和/或提高人成纤维细胞col
‑
i蛋白分泌量的抗衰老活性成分。
38.本发明还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的马铃薯发酵物。
39.本发明中，所述可按照本领域常规包括且不限于面膜、精华或爽肤水。
40.本发明中，所述马铃薯发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比可为10％
‑
100％。
41.本发明中，按照本领域常规，所述皮肤外用剂中还可进一步包括增稠剂和/或中和剂。
42.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
43.本发明所用试剂和原料均市售可得。
44.本发明的积极进步效果在于：本发明通过选用合适的发酵底物马铃薯和发酵菌种制得马铃薯发酵物，马铃薯来源广泛，价格低廉。制备的马铃薯发酵物具有良好的抗氧化能力和抗衰老功效，使用安全性高，对细胞无毒副作用，制备成本低，可作为抗氧化活性成分或抗衰老活性成分被广泛应用于化妆品领域。
附图说明
45.本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
46.图1为本发明实施例1
‑
3制得的马铃薯发酵物和对比例1制得的马铃薯水提物的dpph自由基清除率的结果图；
47.图2为本发明实施例1制得的马铃薯发酵物对人成纤维细胞透明质酸分泌量的影响；
48.图3为本发明实施例1制得的马铃薯发酵物对人成纤维细胞col
‑
i蛋白分泌量的影响。
具体实施方式
49.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
50.在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。
51.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
52.下述实施例中的酵母菌c
‑
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‑
9具体为酿酒酵母菌株(saccharomyces cerevisiae)，已于2019年3月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：cgmcc 17452；
53.下述实施例中的酵母菌c
‑
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‑
10具体为购买于中国食品酿造研究所的产品编号为21392的黄酒酵母；
54.下述实施例中马铃薯为甘肃黄心马铃薯。
55.下述实施例中ypd液体培养基配方为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％；ypd固体培养基为ypd液体培养基中添加琼脂粉，琼脂粉占ypd液体培养基的质量百分比为1％。
56.下述实施例中酵母菌c
‑
sff
‑
9菌液的制备方法包括如下步骤：
57.(1)菌种的活化：将酵母菌c
‑
sff
‑
9接种于ypd固体培养基中进行划线活化，于28℃培养箱中培养48h，获得单菌落；
58.(2)菌种的扩大培养：将步骤(1)获得的单菌落接种至100ml ypd液体培养基中，在28℃、180rpm的摇床中培养48h，得到酵母菌c
‑
sff
‑
9菌液，浓度为106cfu/ml。
59.下述实施例中酵母菌c
‑
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‑
10菌液的制备方法与酵母菌c
‑
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‑
9菌液相比，区别仅在于将步骤(1)中接种的菌种替换为酵母菌c
‑
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‑
10，其他条件参数相同。
60.实施例1
61.发酵底物的制备方法包括如下步骤：取适量马铃薯加入水中，在110℃条件下灭菌20min，得到马铃薯发酵底物；马铃薯发酵底物中马铃薯和水的质量体积比为0.03g/ml；
62.以上述方法制得的浓度为106cfu/ml的酵母菌c
‑
sff
‑
9菌液和马铃薯发酵底物为原料，制备马铃薯发酵物，具体包括如下步骤：将10g酵母菌c
‑
sff
‑
9菌液接种到300g马铃薯发酵底物中，在温度为25℃，且搅拌的条件下发酵培养36小时，搅拌的转速为170rpm；制得的物料转移到离心机中，在转速为4000rpm的条件离心30min，收集上清液，上清液在90℃的条件下灭菌30min；灭菌后，降温，在70℃条件下与防腐剂混合，防腐剂中包括1，2
‑
己二醇和对羟基苯乙酮，对羟基苯乙酮占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，1,2
‑
己二醇占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，制得马铃薯发酵物。
63.实施例2
64.发酵底物的制备方法包括如下步骤：取适量马铃薯加入水中，在110℃条件下灭菌20min，得到马铃薯发酵底物；马铃薯发酵底物中马铃薯和水的质量体积比为0.03g/ml；
65.以上述方法制得的浓度为106cfu/ml的酵母菌c
‑
sff
‑
10菌液和马铃薯发酵底物为原料，制备马铃薯发酵物，具体包括如下步骤：将10g酵母菌c
‑
sff
‑
10菌液接种到300g马铃薯发酵底物中，在温度为25℃，且搅拌的条件下发酵培养36小时，搅拌的转速为170rpm；制得的物料转移到离心机中，在转速为4000rpm的条件离心30min，收集上清液，上清液在90℃的条件下灭菌30min；灭菌后，降温，在70℃条件下与防腐剂混合，防腐剂中包括1，2
‑
己二醇和对羟基苯乙酮，对羟基苯乙酮占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，1,2
‑
己二醇占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，制得马铃薯发酵物。
66.实施例3
67.发酵底物的制备方法包括如下步骤：取适量马铃薯加入水中，在110℃条件下灭菌20min，得到马铃薯发酵底物；马铃薯发酵底物中马铃薯和水的质量体积比为0.01g/ml；
68.以上述方法制得的浓度为106cfu/ml的酵母菌c
‑
sff
‑
9菌液和马铃薯发酵底物为原料，制备马铃薯发酵物，具体包括如下步骤：将3g酵母菌c
‑
sff
‑
9菌液接种到300g马铃薯发酵底物中，在温度为25℃，且搅拌的条件下发酵培养36小时，搅拌的转速为170rpm；制得的物料转移到离心机中，在转速为4000rpm的条件离心30min，收集上清液，上清液在90℃的条件下灭菌30min；灭菌后，降温，在70℃条件下与防腐剂混合，防腐剂中包括1，2
‑
己二醇和对羟基苯乙酮，对羟基苯乙酮占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，1,2
‑
己二醇占灭菌
后制得物料的质量百分数为0.5％，制得马铃薯发酵物。
69.对比例1
70.马铃薯水提物的制备方法包括如下步骤：将马铃薯加入水中，在温度为100℃，搅拌转速为400rpm/min的条件下搅拌提取20min；马铃薯和水的质量体积比为0.03g/ml；
71.提取后，在转速为4000rpm的条件离心30min，收集上清液，上清液在90℃的条件下灭菌30min；灭菌后，降温，在70℃条件下与防腐剂混合，防腐剂中包括1，2
‑
己二醇和对羟基苯乙酮，对羟基苯乙酮占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，1,2
‑
己二醇占灭菌后制得物料的质量百分数为0.5％，制得马铃薯水提物。
72.效果实施例1安全性检测
73.人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1
‑
2和对比例1制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其皮肤刺激性进行评估。
74.1、试验对象：
75.严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择选择合适的志愿者30人，年龄范围在18
‑
60岁随机选择。
76.2、实验方法
77.分别将0.02ml上述实施例1
‑
2和对比例1制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。样品均设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h后观察皮肤的反应。体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表1。
78.表1 皮肤不良反应分级标准
[0079][0080][0081]
3、试验结果
[0082]
参见表2，从表中可以看出；本发明实施例1
‑
2得到的马铃薯发酵物试敏结果都是阴性反应，说明本发明制得的马铃薯发酵物具有安全性，不会给人体带来不良反应，而志愿
者使用对比例1制得马铃薯水提物后，个别出现微弱红斑，表明对比例1制得马铃薯水提物的安全性相对较差。
[0083]
表2
[0084][0085][0086]
效果实施例2
[0087]
dpph自由基清除率的测试
[0088]
分别向试管中加入质量浓度为45.8mg/l的dpph测试液2.0ml和0.25ml待测样品(实施例1
‑
3和对比例1制得的产品)，用无水乙醇补充总体积至3ml，摇匀，避光反应30min后，用1cm比色皿在517nm波长处测定吸光度，记为a1；分别向试管中加入无水乙醇2ml和等量的待测样品，用无水乙醇补充总体积至3ml，在517nm波长处测定吸光度并记为a2；向试管中加入dpph测试液2ml和无水乙醇1ml，在517nm波长处测定吸光度并记为a3，按下述公式计算待样品的dpph自由基清除率，结果见表3和图1。
[0089]
dpph自由基清除率＝[1
‑
(a1‑
a2)/a3]
×
100％
[0090]
结果可看出对比例1制得的马铃薯水提物的dpph自由基清除能力几乎为零，而实施例1
‑
3制得的马铃薯发酵物的dpph自由基清除能力显著提升，且实施例1制得的马铃薯发酵物的dpph自由基清除能力远高于实施例2和实施例3，结果见表3和图1。
[0091]
表3
[0092]
编号dpph自由基清除率实施例166.0％
实施例243.5％实施例350.2％对比例11.2％
[0093]
效果实施例3
[0094]
通过效果实施例2的结果可以看出实施例1
‑
3制得的马铃薯发酵物对dpph自由基均有一定的清除作用，其中，实施例1制得的马铃薯发酵物的dpph自由基清除率高于实施例2
‑
3制得的马铃薯发酵物，本效果实施例对实施例1制得的马铃薯发酵物进行进一步抗氧化研究和透明质酸分泌量研究。并设置模型组、阳性对照组和空白对照组；
[0095]
取对数生长期状态良好的人成纤维细胞计数并接种于6cm培养皿中，控制每皿细胞数2
×
105个细胞。在37℃，5％co2环境下培养过夜，弃培养基；将实施例1制得的马铃薯发酵物分别配置成体积浓度为1％和5％的马铃薯发酵物稀释液，以体积浓度为1％的马铃薯发酵物稀释液为例，其中马铃薯发酵物占马铃薯发酵物稀释液的体积百分比为1％。
[0096]
实验组中，分别加入上述配置的体积浓度为1％和5％的马铃薯发酵物稀释液作用细胞6小时；模型组和空白对照组加入等量无血清dmem培养液；阳性对照组中添加等量浓度为0.1％的vc；再分别加入少量的pbs(ph＝7.4)以刚好覆盖细胞为宜。以uva刺激实验组、模型组和阳性对照组的细胞，uv辐射量为7j/cm2，照射时间2h，空白组不照射。每个样品做三个平行(每个平行样品检测三次结果)，取出，置于冰上，pbs洗涤2次；加入500μl裂解液裂解细胞，在转速为12000rmp，温度为4℃的条件下离心5min，取上清液即细胞裂解上清液，测试上清液中透明质酸和col
‑
i蛋白的含量，测试方法参考elisa试剂盒检测步骤，结果见表4和图2
‑
3；其中，透明质酸的含量结果需要bca含量校正。结果可看出实施例1制得的马铃薯发酵物可有效修复受损细胞，增加人成纤维细胞透明质酸和col
‑
i蛋白的分泌，其具有良好的抗衰老功效。
[0097]
表4
[0098][0099]
最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0100]
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该
理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。