功能化纸基微流控芯片检测试纸及基于该检测试纸快速检测蔬菜中农药残留的方法及其应用与流程

专利2022-05-10  1



1.本发明涉及检测技术领域,具体地来说,是涉及一种功能化纸基微流控芯片检测试纸及基于该检测试纸快速检测蔬菜中农药残留的方法及其应用。


背景技术:

2.近年来,随着人们对农产品需求的不断增大,我国农业生产力得到了充分释放,农药作为防止病虫侵害、调节植物生长的重要化学品,按照化学结构可将农药分为有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类、新烟碱类等类型,正广泛应用在农产品生产当中。为提高蔬菜等农作物产量和经济效益,农药常常被过量使用,农药的滥用和不科学使用不仅直接对农产品、土壤、水源和空气等造成极大污染,更对人类的健康产生严重威胁。长期暴露在有机磷农药污染的环境中极大程度的危害人体健康,严重时会引起中枢神经系统疾病,甚至死亡。目前,农药残留超标给农产品的质量安全带来了巨大的挑战,人们越来越重视农产品中农药残留的检测,其检测技术更是日益受到人们的广泛关注。按照我国目前现有的检验标准,食品安全检测需在有资质的实验室采用传统检测技术进行检测,如高效液相色谱法(hplc),气相色谱法(gc),液相色谱

质谱法(hplc

ms),气相色谱

串联质谱法(gc

ms/ms)等大型仪器分析方法,这些技术虽然具高灵敏度、准确性,但它们前处理复杂,仪器昂贵且需要专业的操作人员进行分析检测,难以满足对食品进行现场、实时、快速、便携化的检测需要。因此,在面对大量产品检测需求和食品安全的严峻挑战下。研制出对农产品种农药残留快速无损、可在线检测的技术和方法具有重要意义。
3.微流控芯片(microfludic chip),又称微全分析系统(miniaturized total analysis systems,μtas),是以分析化学为基础,微机电系统(micro electromechanical systems,mems)为依托,将样品预处理、分离、检测等过程集成在几平方厘米的芯片上,依靠表面张力、流体阻力、能量耗散等一系列特殊效果来控制流体流向、缩短反应时间的微型实验室。相对于现有检测技术的缺陷,微流控技术具有的高密度微观结构,实现了样品预处理和后续分析的小型化、自动化、集成化。与传统方法相比,微流控技术满足了即时检测的需求,且在一定程度克服了培养时间长、前处理复杂的缺点,其具有的小型化、高通量、快速、集成化和消耗少等优点,其主要是由硅、玻璃、石英、有机聚合物和复合材料通过微加工技术制成的,但由于这些材料成本高,对洁净室设备的严格要求,使微流控芯片在生物、化学、医学等领域的产业化形成了阻碍。
4.2007年由whitesides实验室首次提出了纸基微流控分析体系(microfluidic paper

based analytical devices,μpads),即“纸上微型实验室”(lab

on

paper),一经现世就兴起了微分析领域的研究热潮。作为近几年飞速发展的一种新型微流控平台,纸基微流控芯片是以滤纸为基底代替硅、玻璃、高聚物等材料,克服了传统微流控芯片成本高、无污染的困难,并采用一定的加工技术,在纸基上制备出具有一定结构的亲/疏水微细通道网络及相关分析器件,形成的微流通道通过滤纸本身的毛细作用来控制液体的输送,进行一
步或多步生物化学反应过程,进而完成整个检测诊断的过程。这种高通量小型化装置成功将滤纸具有的廉价易得、生物相容性强、制备简单特点与传统微流控芯片自动化、集成化的优点相结合,向检测领域展现出了强大的发展活力,目前已被广泛的应用于疾病诊断、食品质量安全检测、环境分析等领域。
5.除此之外,基于比色法具有成本效益高、使用简便、快速检测等优点,成为了纸张诊断中最常用的检测技术,其利用分析物与检测区域内的固定比色试剂发生生物化学反应的特性,获取裸眼可直观读取显色结果进行半定量分析,继而通过简易的扫描成像原理,对图像进行灰度处理,根据灰度值与待测物浓度间的关系进行定量分析。例如,ornatska等人通过氨丙基三甲氧基硅烷(apts)将纸基硅烷化后,将二氧化铈纳米颗粒和葡萄糖氧化酶固定在纸张检测区,进行葡萄糖的检测。检测区域发生明显的颜色变化,其检测限(lod)为0.5mm。因此,制备基于比色法的纸基微流控芯片用于检测农药快速残留是一条可行途径。


技术实现要素:

6.本发明提供了一种功能化纸基微流控芯片检测试纸及基于该检测试纸快速检测蔬菜中农药残留的方法及其应用,主要目的在于,将基于比色检测农药残留的方法与试纸相结合,构建出一种能简单快速的比色检测毒死蜱、丙溴磷、氯氰菊酯和溴氰菊酯的试纸,具体来说包括以下四个目的:
7.本发明的第一个目的是:提供一种比色检测试纸,制备好的显色剂滴加在所述试纸的各检测区域;所述试纸形状为树杈状。
8.本发明的第二个目的是:提供一种比色检测试纸的制备方法,所述方法包括以下步骤:
9.(1)试纸的预处理:将autocad软件绘制的树枝状经激光切割机切割成目标形状,进行洗涤、干燥后待用
10.(2)比色检测试纸的制备:在待用的试纸上滴加pvp溶液将试纸润湿,在试纸的检测区域滴加显色剂,得到负载显色剂的比色检测试纸。
11.在本发明的一种实施方式中,所述树杈形检测区域的直径为5mm
×
5mm,进样区的直通道为宽4mm,长6mm。
12.在本发明的一种实施方式中,所述natpp溶液浓度为1%

1.5%(m/v);natpp溶液滴加量为5

10μl。
13.在本发明的一种实施方式中,所述方法具体包括以下步骤:
14.(1)使用激光雕刻机切割whatman 1号定性滤纸,将切好的滤纸在超纯水中浸泡后,再在无水乙醇中浸泡,在烘箱中烘干;
15.(2)滴加natpp溶液将试纸润湿,在试纸的检测区域滴加显色剂,室温下放置至完全干燥;所述natpp溶液的浓度(m/v)为1%

1.5%,碘代硫代乙酰胆碱为2mmol/l,5,5'

二硫代双(2

硝基苯甲酸)为2mmol/l,乙酰胆碱酯酶6μg/ml,4

氨基安替比林1.5%,铁氰化钾2%,乙酸铵3%,茚三酮3.5%,aunps的粒径为12

25nm。
16.本发明的第三个目的是:提供一种上述比色检测试纸在检测农药残留面的应用。
17.本发明的第四个目的是:提供一种快速检测毒死蜱、丙溴磷、溴氰菊酯和氯氰菊酯的方法,所述方法是采用上述比色检测试纸进行检测,将待测溶液滴加到试纸的样品溶液
滴加区域,反应15

20min,通过手机app和电脑软件直接识别颜色。
18.(1)毒死蜱:在碘代硫代乙酰胆碱存在的情况下,乙酰胆碱酯酶催化碘代硫代乙酰胆碱水解产生硫代胆碱,硫代胆碱与显色剂反应,形成黄色。毒死蜱对乙酰胆碱酯酶活性具有强烈的抑制作用,导致硫代胆碱产量减少,黄色强度降低。
19.(2)丙溴磷:丙溴磷在碱性条件下水解生成2


‑4‑
溴苯酚,2


‑4‑
溴苯酚进一步与铁氰化钾和4

氨基安替比林反应生成一种特殊的红色螯合物。
20.(3)氯氰菊酯在碱性条件下水解为氰化物,氰化物进一步分解为游离氰化物离子,然后氰化物与茚三酮和醋酸铵反应形成紫色化合物。
21.(4)利用2

巯基
‑6‑
硝基苯并噻唑(2

mercapto
‑6‑
nitrobenzothiazole,mnbt),作为配体合成aunps

mnbt,通过自组装的方法与aunps形成强au

s键。加入溴氰菊酯后,mnbt上的苯环与溴氰菊酯上的苯环通过π

π堆积效应形成核

壳结构。该反应改变了aunps的表面等离子体效应,溶液的颜色由红色变为紫色。
22.本发明的有益效果:
23.(1)本发明将试纸与比色法结合,实现4种农药的快速检测,20min即可完成检测
24.(2)本发明可直接通过手机app和电脑软件实现四种农药的定性和半定量检测,其最低检测限的浓度为毒死蜱:0.042mg/kg;丙溴磷:0.519mg/kg,氯氰菊酯:0.674mg/kg;溴氰菊酯:0.173mg/kg。
附图说明
25.图1为试纸的设计图案;
26.图2为四种农药的检测机理;
27.图3为纸基改性前后的显色程度;
28.图4为加入农药前后纸基的颜色变化;
29.图5为不同丙溴磷浓度对灰度值检测结果的影响。
具体实施方式
30.下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
31.实施例1:修饰显色剂的比色检测试纸
32.一种修饰显色剂的比色检测的试纸,包括如下步骤:
33.(1)树枝状试纸的制备
34.首先用软件autocad制作出图形(如图1所示),然后用激光雕刻机按照图形切割whatman 1号定性滤纸。将切割好的纸片在超纯水中浸泡12h后捞出,于37℃烘箱中烘干,获得待用的试纸。
35.(2)功能化金纳米粒子的制备
36.将20m l浓度为5m m的hau cl4水溶液与200ml milli

q水混合。然后,在室温下剧烈搅拌下,加入5.0m l新制备0.1m的na bh4溶液逐滴加入混合溶液中。该反应持续30分钟并且在搅拌过程中颜色从粉红色变为酒红色。最后,将au nps溶液储存在4℃的冰箱中。将
40μl浓度为1m m的与40m l的au nps胶体混合快速搅拌约2小时后,获得功能化au nps

mnbt。
37.(3)显色剂的制备
38.如图2所示,采用四种不同的显色机理对对应的农药进行独立检测,当显色剂与农药发生完全反应后,能明显观察到纸基颜色的变化。其中,毒死蜱检测用atch溶液与dtnb溶液混合配制,丙溴磷检测用铁氰化钾溶液与4

氨基安替比林溶液混合配制,氯氰菊酯检测用茚三酮溶液与乙酸铵溶液混合配制,溴氰菊酯的检测用制备的aunps

mnbt。
39.(4)显色剂修饰的比色检测的农药残留试纸的制备
40.滴加10μl natpp溶液将试纸润湿,在试纸的检测区域滴加2μl显色剂,室温下放置至完全干燥得到负载显色剂的农药比色检测的试纸,其中,natpp溶液的浓度(m/v)为1%,碘代硫代乙酰胆碱为2mmol/l,5,5'

二硫代双(2

硝基苯甲酸)为2mmol/l,乙酰胆碱酯酶6μg/ml,4

氨基安替比林1.5%,铁氰化钾2%,乙酸铵3%,茚三酮3.5%,aunps的粒径为12

25nm。
41.实施例2:滤纸的预处理的优化
42.参照实施例1的方法制备试纸,区别仅在于,分别采用超纯水和1%natpp溶液润湿试纸。具体操作:取洗涤后干燥的试纸,取10μl溶液润湿试纸后再在试纸的检测区域滴加2μl显色剂溶液,然后室温下放置至完全干燥;处理前后对比见图3,由图3可知,未处理的滤纸会发生咖啡碱反应,而处理后的滤纸可降低滤纸的毛细管运输作用,且对酶产生保护,使亲水性提高可以颜色在试纸上均匀分布。
43.实施例3:功能化纸基对于四种农药的检测
44.利用实例2制备的功能化纸基,将各农药检测的所需显色剂配制成功滴加在反应区,毒死蜱检测用atch溶液与dtnb溶液混合配制,丙溴磷检测用铁氰化钾溶液与4

氨基安替比林溶液混合配制,氯氰菊酯检测用茚三酮溶液与乙酸铵溶液混合配制,溴氰菊酯的检测用制备的aunps

mnbt,其中碘代硫代乙酰胆碱为2mmol/l,5,5'

二硫代双(2

硝基苯甲酸)为2mmol/l,乙酰胆碱酯酶6μg/ml,4

氨基安替比林1.5%,铁氰化钾2%,乙酸铵3%,茚三酮3.5%,aunps的粒径为12

25nm。静置一待其自然风干,取农药的不同浓度滴加到功能化纸基微流控芯片直通道上,待液体流入检测区域,发生颜色反应。如图4所示,分别对比了加入农药前后颜色的变化,且农药加入量为从低到高,颜色也发生了阶段性变化。
45.实施例4:丙溴磷标准曲线绘制
46.将不同浓度的丙溴磷标品加入到实例2制备的功能化纸基微流控芯片上进行,将铁氰化钾和4

氨基安替比林两种溶液进行混合,取2μl混合液加到微流控反应孔中进行显色,显色后及时用手机拍照。用excel和image j软件进行数据处理和灰度分析,绘制标准曲线。显然不同浓度的标品对应的颜色也不同,由图5可见,标品浓度与灰度值呈一定相关性,且拟合度较高。依据此方法,可以建立相对灰度值与丙溴磷浓度一一对应的标准库,从而可以检测未知样品的浓度。
47.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其
等效物界定。
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