1.本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种提高灵菌红素发酵水平的方法及其应用。
背景技术：
2.灵菌红素(prodigiosin)是一类以三吡咯环结构为主的红色色素，主要通过微生物发酵法而获得。研究表明，灵菌红素具有抗细菌、抗真菌、抗原生动物、抗癌和免疫抑制等生物活性。癌症是当前严重危害人类生命的疾病，而灵菌红素类化合物能够触发恶性癌细胞的凋亡，已显现出良好的抗癌活性，故被视为极具开发潜力的抗癌药物。灵菌红素最早从沙雷氏菌属(serratia)发酵产物中提取得到，随后研究人员发现链霉菌属(streptomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)、河氏菌属(hahella)、弧菌属(vibrio)等微生物也能够代谢产生灵菌红素。近年来，为了提高灵菌红素发酵水平，研究人员采用诱变、基因工程等技术手段在菌种选育方面进行了大量工作，也在培养基优化、发酵工艺优化等方面进行了不懈努力。但是，灵菌红素生产仍然存在产率低、价格昂贵等不足，优化发酵工艺仍是提高灵菌红素发酵水平的重要途径。
技术实现要素：
3.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高灵菌红素发酵水平的方法。
4.本发明的另一目的在于提供上述提高灵菌红素发酵水平的方法的应用。
5.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高灵菌红素发酵水平的方法，包括如下步骤：将粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)菌液接种于发酵培养基中进行发酵；其中，发酵培养基的碳源为植物油脂。
6.所述的粘质沙雷氏菌优选为粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)pg
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04、粘质沙雷氏菌cicc10370或粘质沙雷氏菌cicc20055，但不仅限于所述优选菌种。
7.所述的接种的接种量优选为体积百分比5％～10％。
8.所述的植物油脂优选为大豆油和玉米油中的一种或两种；更优选为玉米油。
9.所述的发酵培养基的组成优选如下：玉米油30～40g/l、蛋白胨10～14g/l、k2hpo45.0～5.4g/l、mgso4·
7h2o 0.4～0.5g/l，ph7.4～7.6；溶剂为水。
10.所述的水优选为纯净水。
11.所述的发酵培养基的灭菌条件优选为：121℃灭菌16～20min。
12.所述的发酵的条件优选为：搅拌转速为400～500r/min，发酵温度为25～27℃，发酵时间为16～18h，在发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.34～0.38vvm，发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.30～0.34vvm。
13.所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，优选包括如下步骤：将粘质沙雷氏菌菌液接种于发酵培养基中进行发酵，在粘质沙雷氏菌发酵的对数生长期的中后期或是稳定期，
加入庆大霉素硫酸盐或多黏菌素b硫酸盐；当灵菌红素产量达到最高时，结束发酵。
14.所述的庆大霉素硫酸盐的添加时间优选为发酵第10～12h。
15.所述的庆大霉素硫酸盐的添加量按其在发酵体系中的浓度为320～480u/l计算。
16.所述的多黏菌素b硫酸盐的添加时间优选为发酵第10～12h。
17.所述的多黏菌素b硫酸盐的添加量按其在发酵体系中的浓度为1100～2400u/l计算。
18.所述的粘质沙雷氏菌菌液优选通过如下步骤获得：将粘质沙雷氏菌划线于斜面或平板上，得到活化的菌种；将活化的菌种接种入摇瓶培养基中，振荡培养至对数生长期，得到粘质沙雷氏菌菌液。
19.所述的摇瓶培养基的组成优选如下：葡萄糖26～30g/l、蛋白胨10～14g/l、酵母膏5～7g/l、k2hpo
4 3.2～3.6g/l、mgso4·
7h2o 0.4～0.5g/l，溶剂为水，ph值为6.8～7.2；更优选为：葡萄糖28g/l、蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、k2hpo
4 3.4g/l、mgso4·
7h2o 0.45g/l，溶剂为水，ph值为7.0。
20.所述的水优选为纯净水。
21.所述的摇瓶培养基的灭菌条件优选为：121℃灭菌16～20min。
22.所述的振荡培养的条件优选为：温度25～27℃，转速180～220r/min，培养时间10～12h。
23.上述提高灵菌红素发酵水平的方法在制备灵菌红素中的应用。
24.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
25.(1)本发明发现玉米油相对于大豆油，更有利于粘质沙雷氏菌合成得到灵菌红素，提高幅度达到29％。
26.(2)本发明首次发现，通过添加适量的庆大霉素硫酸盐或多黏菌素b硫酸盐能有效提高灵菌红素的发酵水平。与不添加庆大霉素硫酸盐或多黏菌素b硫酸盐的批次相比，添加适量庆大霉素硫酸盐的产量提高幅度为10.8％～20.4％，添加适量多黏菌素b硫酸盐的产量提高幅度为10.4％～23.2％。
具体实施方式
27.下面对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。
28.实施例1
29.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)pg
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04(保藏编号为gdmcc no:61190，于2020年9月16日保藏位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心)斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
30.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃
灭菌18min，冷却至室温，备用。
31.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm；在发酵11h，将庆大霉素硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的庆大霉素硫酸盐浓度达到400u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1902.5mg/l。
32.实施例2
33.(1)摇瓶种子的培养(同实施例1)：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
34.(2)发酵培养基的准备(同实施例1)：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
35.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm；在发酵11h，将多黏菌素b硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的多黏菌素b硫酸盐浓度达到1800u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1946.6mg/l。
36.实施例3
37.(1)摇瓶种子的培养：称取1.56g葡萄糖、0.6g蛋白胨、0.3g酵母膏、0.192g k2hpo4、0.024g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至60ml，调节ph6.8，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌16min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于25℃、180r/min的条件下培养10h，备用。
38.(2)发酵培养基的准备：称取36g玉米油、12g蛋白胨、6g k2hpo4、0.48g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.4，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌16min，冷却至室温，备用。
39.(3)发酵过程的控制：将60ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为400r/min，发酵温度控制为25～26℃，发酵
ph控制为7.4～7.5；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.34vvm；在发酵10h，将庆大霉素硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的庆大霉素硫酸盐浓度达到320u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.30vvm，于18h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1832.6mg/l。
40.实施例4
41.(1)摇瓶种子的培养(同实施例3)：称取1.56g葡萄糖、0.6g蛋白胨、0.3g酵母膏、0.192g k2hpo4、0.024g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至60ml，调节ph6.8，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌16min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于25℃、180r/min的条件下培养10h，备用。
42.(2)发酵培养基的准备(同实施例3)：称取36g玉米油、12g蛋白胨、6g k2hpo4、0.48g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.4，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌16min，冷却至室温，备用。
43.(3)发酵过程的控制：将60ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为400r/min，发酵温度控制为25～26℃，发酵ph控制为7.4～7.5；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.34vvm；在发酵10h，将多黏菌素硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的多黏菌素b硫酸盐浓度达到1100u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.30vvm，于18h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1802.8mg/l。
44.实施例5
45.(1)摇瓶种子的培养：称取2.7g葡萄糖、1.26g蛋白胨、0.63g酵母膏、0.324g k2hpo4、0.045g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至90ml，调节ph6.8，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌20min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于27℃、220r/min的条件下培养12h，备用。
46.(2)发酵培养基的准备：称取48g玉米油、16.8g蛋白胨、6.48g k2hpo4、0.6gmgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.6，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌20min，冷却至室温，备用。
47.(3)发酵过程的控制：将90ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为500r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.36vvm；在发酵12h，将庆大霉素硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的庆大霉素硫酸盐浓度达到480u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.32vvm，于17h结束发酵。将发酵液于冰浴条件
下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1750.6mg/l。
48.实施例6
49.(1)摇瓶种子的培养(同实施例5)：称取2.7g葡萄糖、1.26g蛋白胨、0.63g酵母膏、0.324g k2hpo4、0.045g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至90ml，调节ph6.8，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌20min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于27℃、220r/min的条件下培养12h，备用。
50.(2)发酵培养基的准备(同实施例5)：称取48g玉米油、16.8g蛋白胨、6.48g k2hpo4、0.6g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.6，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌20min，冷却至室温，备用。
51.(3)发酵过程的控制：将90ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为500r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.36vvm；在发酵12h，将多黏菌素b硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的多黏菌素b硫酸盐浓度达到2400u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.32vvm，于17h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1741.2mg/l。
52.实施例7
53.实施例7基本同实施例1，区别仅在于：所用的粘质沙雷氏菌菌种不同。
54.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌cicc10370(中国工业微生物菌种保藏中心)斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
55.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
56.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm；在发酵11h，将庆大霉素硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的庆大霉素硫酸盐浓度达到400u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇
溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1508mg/l。
57.实施例8
58.实施例8基本同实施例2，区别仅在于：所用的粘质沙雷氏菌菌种不同。
59.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌cicc10370斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
60.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54gmgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
61.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm；在发酵11h，将多黏菌素b硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的多黏菌素b硫酸盐浓度达到1800u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1547mg/l。
62.实施例9
63.实施例9基本同实施例1，区别仅在于：所用的粘质沙雷氏菌菌种不同，以及摇瓶种子的温度不同。
64.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌cicc20055(中国工业微生物菌种保藏中心)斜面菌种的菌苔，置于27℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
65.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
66.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm；在发酵11h，将庆大霉素硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的庆大霉素硫酸盐浓度达到400u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇
溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1288mg/l。
67.实施例10
68.实施例10基本同实施例2，区别仅在于：所用的粘质沙雷氏菌菌种不同，以及摇瓶种子的温度不同。
69.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌cicc 20055斜面菌种的菌苔，置于27℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
70.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
71.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm；在发酵11h，将多黏菌素b硫酸盐溶液加入发酵罐内，使发酵液中的多黏菌素b硫酸盐浓度达到1800u/l；发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1325mg/l。
72.对比例1
73.对比例1与实施例1的区别在于：本对比例的发酵培养基使用大豆油，且发酵时不加入庆大霉素硫酸盐。
74.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
75.(2)发酵培养基的准备：称取42g大豆油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
76.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm，发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色
素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1224mg/l。
77.对比例2
78.对比例2与实施例1的区别在于：本对比例发酵时不加入庆大霉素硫酸盐。
79.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌gdmcc no.61190斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
80.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
81.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm，发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1580mg/l。
82.对比例3
83.对比例3与实施例7的区别在于：本对比例发酵时不加入庆大霉素硫酸盐。
84.(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌cicc10370斜面菌种的菌苔，置于26℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
85.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
86.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为26～27℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm，发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1264mg/l。
87.对比例4
88.对比例4与实施例9的区别在于：本对比例发酵时不加入庆大霉素硫酸盐。(1)摇瓶种子的培养：称取3.36g葡萄糖、1.44g蛋白胨、0.72g酵母膏、0.408g k2hpo4、0.054g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至120ml，调节ph7.0，放入500ml锥形瓶，经121℃灭菌18min，冷却后，用接种环接入1环粘质沙雷氏菌cicc20055斜面菌种的菌苔，置于27℃、200r/min的条件下培养11h，备用。
89.(2)发酵培养基的准备：称取42g玉米油、14.4g蛋白胨、6.24g k2hpo4、0.54g mgso4·
7h2o，加入纯净水定容至1200ml，调节ph7.5，放入1.5l全自动控制发酵罐，经121℃灭菌18min，冷却至室温，备用。
90.(3)发酵过程的控制：将120ml摇瓶种子接入发酵罐，通入无菌空气，启动搅拌，进行灵菌红素发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为450r/min，发酵温度控制为27～28℃，发酵ph控制为7.5～7.6；发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.38vvm，发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.34vvm，于16h结束发酵。将发酵液于冰浴条件下进行超声波破碎(分批在冰水浴中进行超声波破碎，每批100ml，超声波处理功率150w、超声处理5s、间歇5s，总时间10min)，利用旋转蒸发仪在50℃下蒸发去除水分，用ph3.0的甲醇溶解色素，于14000rpm的条件下离心20min，收集上清液，即为粗提取液。以灵菌红素标准品为参照，采用吸光度法在535nm波长处测定粗提取液中的灵菌红素含量，测得发酵液中灵菌红素含量为1082mg/l。
91.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于包括如下步骤：将粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)菌液接种于发酵培养基中进行发酵；其中，发酵培养基的碳源为植物油脂。2.根据权利要求1所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌pg
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04、粘质沙雷氏菌cicc10370和粘质沙雷氏菌cicc20055中的至少一种。3.根据权利要求1所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的植物油脂为大豆油和玉米油中的一种或两种；进一步为玉米油。4.根据权利要求3所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的组成如下：玉米油30～40g/l、蛋白胨10～14g/l、k2hpo
4 5.0～5.4g/l、mgso4·
7h2o 0.4～0.5g/l，ph7.4～7.6；溶剂为水。5.根据权利要求1所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的接种的接种量为体积百分比5％～10％；所述的发酵的条件为：搅拌转速为400～500r/min，发酵温度为25～27℃，发酵时间为16～18h，在发酵过程的第0～12h，发酵的通气比由0.24vvm逐步增加至0.34～0.38vvm，发酵12h以后，发酵的通气比控制为0.30～0.34vvm。6.根据权利要求1～5任一项所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于包括如下步骤：将粘质沙雷氏菌菌液接种于发酵培养基中进行发酵，在粘质沙雷氏菌发酵的对数生长期的中后期或是稳定期，加入庆大霉素硫酸盐或多黏菌素b硫酸盐；当灵菌红素产量达到最高时，结束发酵。7.根据权利要求6所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的庆大霉素硫酸盐的添加时间为发酵第10～12h；所述的庆大霉素硫酸盐的添加量按其在发酵体系中的浓度为320～480u/l计算；所述的多黏菌素b硫酸盐的添加时间为发酵第10～12h；所述的多黏菌素b硫酸盐的添加量按其在发酵体系中的浓度为1100～2400u/l计算。8.根据权利要求6所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的粘质沙雷氏菌菌液通过如下步骤获得：将粘质沙雷氏菌划线于斜面或平板上，得到活化的菌种；将活化的菌种接种入摇瓶培养基中，振荡培养至对数生长期，得到粘质沙雷氏菌菌液。9.根据权利要求8所述的提高灵菌红素发酵水平的方法，其特征在于：所述的摇瓶培养基的组成如下：葡萄糖26～30g/l、蛋白胨10～14g/l、酵母膏5～7g/l、k2hpo
4 3.2～3.6g/l、mgso4·
7h2o 0.4～0.5g/l，溶剂为水，ph值为6.8～7.2；所述的振荡培养的条件为：温度25～27℃，转速180～220r/min，培养时间10～12h。10.权利要求1～9任一项所述的提高灵菌红素发酵水平的方法在制备灵菌红素中的应用。
技术总结
本发明公开了一种提高灵菌红素发酵水平的方法及其应用。本发明通过将粘质沙雷氏菌菌液接种于发酵培养基中进行发酵；其中，发酵培养基的碳源为植物油脂。本发明发现玉米油相对于大豆油，更有利于粘质沙雷氏菌合成得到灵菌红素，提高幅度达到29％；本发明首次发现，通过添加适量的庆大霉素硫酸盐或多黏菌素B硫酸盐能有效提高灵菌红素的发酵水平，与不添加庆大霉素硫酸盐或多黏菌素B硫酸盐的批次相比，添加适量庆大霉素硫酸盐的产量提高幅度为10.8％～20.4％，添加适量多黏菌素B硫酸盐的产量提高幅度为10.4％～23.2％。产量提高幅度为10.4％～23.2％。
技术研发人员：邓毛程 李静 王瑶 刘慧平 吴林杰 叶茂 张晓涛 江梓妮 林群珊 林浩涛
受保护的技术使用者：邓毛程 李静
技术研发日：2021.04.06
技术公布日：2021/6/29
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