一种倍半萜苷单体化合物在制备降脂药方面的应用的制作方法

1.本发明涉及一种天然提取单体化合物的制药用途。


背景技术：

2.肥胖是一种以胰岛素抵抗为主要病因的慢性代谢性疾病，其特征是胰岛β细胞功能受损以及由于胰岛素信号通路受损而导致的周围组织(例如骨骼肌，脂肪组织和肝脏)对胰岛素敏感性减弱。因此，提高胰岛素敏感性，促进器官组织对脂质的摄取及代谢是治疗肥胖的重要的切入点。
3.枇杷叶为蔷薇科植物枇杷〔eriobotrya japonica(thunb.)lindl.〕的干燥叶，在中国分布广泛，是一味常用中药，味苦，性微寒，具有清肺止咳，降逆止呕，抗氧化，抗炎和保肝护肝的功效。用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆、烦热口渴等症状，符合中医治疗糖尿病“消渴”的范畴。已有的文献报道显示，枇杷叶中含有丰富的具有良好生物活性的化合物，包括多糖、黄酮、多酚、萜类以及其它类型化合物。现有技术从枇杷叶中分别提取了具有降脂作用的枇杷叶总三萜酸、总黄酮和总倍半萜苷粗提物，但对于其中起效的单体成分的研究相对较少，未能有效利用天然药物资源，同时仅针对总提取物的研究，也不利于药理的基础研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，扩大降脂药物的来源。
5.为了达到上述目的，本发明从枇杷叶中提取、分离、纯化一种天然药物单体成分——倍半萜苷单体化合物，用于降脂药的制备。
6.本发明倍半萜苷单体化合物为nerolidol
‑3‑
o
‑
α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
2)
‑
[α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
6)]
‑
β
‑
d
‑
glucopyranoside，其化学结构式如下：
[0007][0008]
可用于制备降血脂药物或保健品。
[0009]
本发明倍半萜苷单体化合物具有降低血脂、治疗肥胖的功效，尤其适用于制备治疗胰岛素抵抗导致肥胖的药物。
[0010]
本发明倍半萜苷单体化合物的制备方法如下：
[0011]
(1)提取：将枇杷叶干燥和粉碎后，按料液比(kg/l)1:6～1:10加入质量百分比浓
度为80％乙醇进行提取(室温浸泡提取3次，或者回流提取2次)，合并提取液，减压浓缩至有沉淀析出，浓缩液分次离心，速率为2000～4000转/分钟；得上清液。
[0012]
(2)分离：取上清液，经xad16大孔树脂吸附，依次以质量百分比为0％、40％、60％、80％的乙醇溶液进行水
‑
乙醇梯度洗脱，合并乙醇浓度为60％的流分，减压浓缩；浓缩液进一步经聚酰胺柱层析，水
‑
甲醇梯度洗脱，合并水部分的流分，减压浓缩；浓缩液进一步经反向ods柱层析，依次以质量百分比为50％、100％的甲醇溶液进行水
‑
甲醇梯度洗脱，合并甲醇浓度为100％部分的流分，减压浓缩得到总倍半萜苷提取物。
[0013]
(3)纯化：经步骤(2)中得到的总倍半萜苷提取物经制备型高效液相色谱柱层析进行纯化，得到本发明倍半萜苷单体化合物。
[0014]
其中，步骤(3)制备型高效液相色谱柱层析纯化的色谱条件：rp
‑
c18柱，规格为5μm,9.4
×
250mm，流动相a相为甲醇，b相为水，采用等度洗脱程序：0
‑
40min，65％a，流速为8ml/min，柱温为25℃，检测波长为210nm。
[0015]
本发明相比现有技术具有以下优点：
[0016]
1、本发明首次从天然药物中提纯得到该倍半萜苷单体化合物，并通过药理研究获得其在改善胰岛素抵抗、治疗肝脏脂质堆积的药效活性。
[0017]
2、本发明获得了一种新型具有良好降血脂活性的天然药物，为后续进一步药效研究、及临床研究及指导用药奠定了基础，拓展了肥胖症治疗用药的种类及来源。
[0018]
3、本发明同时对该倍半萜苷单体化合物的天然提纯方法进行了研究，以简单的步骤、较大的产率以及制备操作可重复性，对该化合物的制备方法进行了优化，获得了最佳的提纯方法。
附图说明
[0019]
图1为本发明倍半萜苷单体化合物的化学结构式；
[0020]
图2为本发明倍半萜苷单体化合物的制备流程图；
[0021]
图3为本发明倍半萜苷单体化合物的质谱图；
[0022]
图4为本发明倍半萜苷单体化合物的氢谱图；
[0023]
图5为本发明倍半萜苷单体化合物的碳谱图；
[0024]
图6为本发明倍半萜苷单体化合物的hmbc谱图；
[0025]
图7为本发明倍半萜苷单体化合物的hmqc谱图；
[0026]
图8为本发明倍半萜苷单体化合物对自发性肥胖小鼠tc的影响；
[0027]
图9为本发明倍半萜苷单体化合物对自发性肥胖小鼠tg的影响；
[0028]
图10为自发性肥胖小鼠经本发明倍半萜苷单体化合物给药后的肝脏病理切片对比图。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0030]
实施例1
[0031]
倍半萜苷单体化合物制备实施例
[0032]
如图2所示，取干燥枇杷叶10kg粉碎，80％乙醇(按料液比(kg/l)1:6～1:10加入即
可)回流提取2次(或室温浸泡提取3次)，合并提取液，过滤，减压浓缩至有沉淀析出，3000转/分钟离心15分钟，取上清液备用。
[0033]
将上清液缓缓流过xad16大孔吸附树脂柱，依次用水、40％、60％、80％乙醇梯度洗脱。经高效液相检测分析后合并60％乙醇洗脱部分，减压浓缩，备用。
[0034]
将浓缩液进一步流经处理后的聚酰胺柱色谱(200目)，水
‑
乙醇梯度洗脱。经高效液相检测分析合并水洗部分，减压浓缩后，进一步经rp
‑
18反向ods柱色谱，依次用50％、100％甲醇梯度洗脱，经高效液相检测分析后合并100％甲醇洗脱部分，最后经制备液相色谱(岛津lc
‑
6ad)纯化(制备型高效液相色谱条件如下：agilent rp
‑
c18柱，规格为5μm,9.4
×
250mm，流动相a相为甲醇，b相为水，采用等度洗脱程序：0
‑
40min，65％a，流速为8ml/min，柱温为25℃，检测波长为210nm)，得到本发明目标化合物—倍半萜苷单体化合物158.6mg。
[0035]
对所得化合物进行结构鉴定：
[0036]
白色粉末(甲醇)。hr
‑
esi
‑
ms:m/z 675.3548[m
‑
h]
‑
。1h nmrδppm(dmso
‑
d6,400mhz):5.20(1h,h
‑
1a),5.16(1h,h
‑
1b),5.82(1h,dd,j＝17,10hz,h
‑
2),1.49(2h,m,h
‑
4),1.92(2h,m,h
‑
5),5.06(1h,submerged,h
‑
6),1.95(2h,m,h
‑
8),2.00(2h,m,h
‑
9),5.06(1h,submerged,h
‑
10),1.63(3h,s,h
‑
12),1.27(3h,s,h
‑
13),1.54(3h,s,h
‑
14),1.56(3h,s,h
‑
15),4.23(1h,d,j＝7.8hz,h
‑
1'),3.16
‑
3.29(4h,m,h
‑
2',3',4'and 5'),3.76(1h,m,h
‑
6'a),3.33(1h,m,h
‑
6'b),5.14(1h,brs,h
‑
1”),3.18
‑
3.92(4h,m,h
‑
2”,h
‑
3”,h
‑
4”and h
‑
5”),1.07(3h,d,j＝6.5hz,h
‑
6”),4.57(1h,s,h
‑
1”'),3.18
‑
3.60(4h,m,h
‑
2”',h
‑
3”',h
‑
4”'and h
‑
5”'),1.13(3h,d,j＝6.5hz,h
‑
6”')；
13
c nmrδppm(dmso
‑
d6,100mhz):115.84(c
‑
1),143.71(c
‑
2),79.97(c
‑
3),41.51(c
‑
4),22.54(c
‑
5),124.58(c
‑
6),134.72(c
‑
7),39.72(c
‑
8),26.65(c
‑
9),124.66(c
‑
10),131.10(c
‑
11),25.95(c
‑
12),22.19(c
‑
13),16.23(c
‑
14),18.03(c
‑
15),96.98(c
‑
1'),76.28(c
‑
2'),78.64(c
‑
3'),70.84(c
‑
4'),75.63(c
‑
5'),67.40(c
‑
6'),100.39(c
‑
1”),71.16(c
‑
2”),70.95(c
‑
3”),72.49(c
‑
4”),68.45(c
‑
5”),18.26(c
‑
6”),101.26(c
‑
1”'),71.25(c
‑
2”'),71.07(c
‑
3”'),72.49(c
‑
4”'),68.78(c
‑
5”'),18.36(c
‑
6”')。如下表及图3至图7的谱图数据所示。
[0037]
以上数据与文献报道的nerolidol
‑3‑
o
‑
α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
2)
‑
[α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
6)]
‑
β
‑
d
‑
glucopyranoside的波谱数据一致。化合物结构见图1。
[0038][0039][0040]
应用实施例1
[0041]
降低血脂药效研究
[0042]
实验动物：本研究选用南京大学模型动物研究中心6周龄雄性c57bl/ksj背景leprdb/leprdb(db/db)小鼠40只(30
‑
35g)，雄性野生型c57bl/ksj leprdb/ (db/m)小鼠10只(18
‑
22g)。在南京中医药大学(中国南京)动物实验中心的spf屏障环境中，在22
±
2℃的温度、45
‑
75％的相对湿度和12小时的明暗交替周期下，每笼5只动物一组进行饲养和试验。实验期间自由饮水进食。本研究根据美国nih出版的《实验动物管理与使用指南》(nih出版
物8023号，1978年修订)进行，并经南京中医药大学动物管理与使用委员会(中国南京)批准。
[0043]
分组及给药：在对照条件下驯化1周后，将db/db小鼠随机分为4组(每组10只)，分别给予生理盐水(db/db组)、低剂量组sg3
25
组(给予本发明倍半萜苷单体化合物25mg/kg/天、高剂量组sg3
50
组(给予本发明倍半萜苷单体化合物50mg/kg/天)、阳性药met组(给予二甲双胍150mg/kg/天)，灌胃8周。10只db/m小鼠作为正常对照组db/m组，口服相同剂量的溶媒。灌胃期间，饮食进水不限制。实验结束时，小鼠禁食12小时(自由饮水)，然后在麻醉下处死。采集血样进行检测。
[0044]
实验结果：如图8、9所示，灌胃8周后，本发明倍半萜苷化合物在一定剂量下(sg3
25
组25mg/kg/天或sg3
50
组50mg/kg/天)可显著降低db/db肥胖小鼠升高的血脂，(sg3
25
组、sg3
50
组)与模型组(db/db组)相比有显著性差异(p<0.001)。该结果显示该倍半萜苷化合物具有降低血脂，治疗肥胖的功能。
[0045]
应用实施例2
[0046]
治疗肥胖小鼠肝脏脂质堆积药效研究
[0047]
实验动物：本研究选用南京大学模型动物研究中心6周龄雄性c57bl/ksj背景leprdb/leprdb(db/db)小鼠40只(30
‑
35g)，雄性野生型c57bl/ksj leprdb/ (db/m)小鼠10只(18
‑
22g)。在南京中医药大学(中国南京)动物实验中心的spf屏障环境中，在22
±
2℃的温度、45
‑
75％的相对湿度和12小时的明暗交替周期下，每笼5只动物一组进行饲养和试验。实验期间自由饮水进食。本研究根据美国nih出版的《实验动物管理与使用指南》(nih出版物8023号，1978年修订)进行，并经南京中医药大学动物管理与使用委员会(中国南京)批准。
[0048]
分组及给药：在对照条件下驯化1周后，将db/db小鼠随机分为4组(每组10只)，分别给予生理盐水(db/db组)、db/db sg 25mg/kg组(给予本发明倍半萜苷单体化合物25mg/kg/天)、db/db sg 50mg/kg组(给予本发明倍半萜苷单体化合物50mg/kg/天)、db/db met 150mg/kg组(给予二甲双胍150mg/kg/天)，灌胃8周。10只db/m小鼠作为正常对照组db/m组，口服相同剂量的溶媒。灌胃期间，饮食进水不限制。实验结束时，小鼠禁食12小时(自由饮水)，然后在麻醉下处死。采集肝脏进行病理切片，及he染色。
[0049]
实验结果：如图10所示，灌胃8周后，本发明倍半萜苷化合物在一定剂量下(db/db sg 25mg/kg组和db/db sg 50mg/kg组)可显著减少db/db肥胖小鼠肝脏脂质堆积。该结果显示该倍半萜苷化合物具有降低血脂治疗肥胖的功能。

技术特征：
1.一种倍半萜苷单体化合物在制备降脂药或保健品方面的应用，该倍半萜苷单体化合物的化学式为nerolidol
‑3‑
o
‑
α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
2)
‑
[α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
6)]
‑
β
‑
d
‑
glucopyranoside。2.一种倍半萜苷单体化合物在制备治疗肥胖症药物方面的应用，该倍半萜苷单体化合物的化学式为nerolidol
‑3‑
o
‑
α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
2)
‑
[α
‑
l
‑
rhamnopyranosyl
‑
(1
→
6)]
‑
β
‑
d
‑
glucopyranoside。
技术总结
本发明公开了一种倍半萜苷单体化合物在制备降脂药或保健品方面的应用，该倍半萜苷单体化合物的化学式为nerolidol


技术研发人员：简暾昱 丁晓琴 陈剑 吕寒 牛冠婷 童贝 赵磊 刘艳 任冰如 李维林
受保护的技术使用者：江苏省中国科学院植物研究所
技术研发日：2021.03.25
技术公布日：2021/6/29