印楝组合物和治疗癌症的方法与流程

印楝组合物和治疗癌症的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2018年8月31日提交的美国临时申请号62/725,484和2019年9月6日提交的印度申请号201821021206的提交日期的权益。这些较早提交的申请的内容特此以引用的方式整体并入本文。


背景技术：

3.随着全球吸烟、饮酒和hpv暴露持续上升，发展口腔癌的风险在全球范围内日益增加。常规治疗提高了早期疾病患者的5年存活率，而晚期疾病患者的5年存活率低至34％，近40年没有变化。
4.结肠直肠癌(crc)是第三最常见诊断的癌症，并且在美国男性和女性中癌症死亡的第二主要原因。抗炎性阻断剂已被证明是结肠直肠癌预防的有前景的途径。然而，nsaid虽然可有效遏制crc风险，但对于癌症预防中的长期使用而言毒性太高。


技术实现要素：

5.本文公开了治疗受试者癌症的方法，所述方法包括：(a)确定需要治疗的受试者；以及(b)向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
6.本文公开了减少有需要的受试者的血清中的至少一种炎性细胞因子的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
7.本文公开了减轻有需要的受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
8.本文公开了治疗有需要的受试者的过度增生性病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
9.本文公开了抑制有需要的受试者中的nfkb和环氧合酶表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
10.本文公开了抑制至少一种细胞中的nfkb和环氧合酶表达的方法，所述方法包括使至少一种细胞与有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)接触的步骤，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
11.本文公开了改变受试者中的表皮生长因子受体信号传导活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
12.本文公开了在有需要的受试者中诱导细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受试
者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
13.在以下描述、附图和权利要求书中说明了本发明的组合物和方法的其他特征和优点。
附图说明
14.图1a
‑
f示出了scne和印苦楝内酯抑制口腔鳞状癌细胞生长。图1a示出了对scc4、hsc3、cal27 oscc细胞系的scne处理(0
‑
400μg/ml)持续8小时或24小时。图1b示出了对scc4、hsc3、cal27oscc细胞系的scne处理(0
‑
100μm)持续8小时或24小时。图1c示出了对scc4、hsc3、cal27 oscc细胞系的印苦楝内酯处理(0
‑
400μg/ml)持续48小时。图1d示出了对scc4、hsc3、cal27 oscc细胞系的印苦楝内酯处理(0
‑
100μm)持续48小时。图1e示出了对scc4、hsc3、cal27 oscc细胞系的塞来昔布处理(0
‑
200μm)持续8小时或24小时。图1f示出了对scc4、hsc3、cal27 oscc细胞系的塞来昔布处理(0
‑
200μm)持续48小时。
15.图2示出了scne和印苦楝内酯下调炎性介质。用20μg、60μg scne或10μm、50μm印苦楝内酯处理scc4、cal27和hsc3细胞24小时。分析了细胞溶质蛋白级分中的cox1、cox2、nfkbp65、stat3、pstat3、egfr、pegfr、perk1/2、akt和pakt。分析了核蛋白级分中的perk1/2、stat3、pstat3和nfkbp65。gapdh和topo
‑
iiα用作负载对照。
16.图3a
‑
c示出了scne和印苦楝内酯抑制体外细胞迁移。图3a使用划痕(scratch)测定示出了60μg/ml scne和50mm印苦楝内酯抑制scc4(120小时)、cal27(72小时)和hsc3(8小时)中的细胞迁移。绿线代表初始划痕锋线，黄色是相应的处理时间后的划痕锋线。图3b示出了通过scne和印苦楝内酯处理，scc4、cal27和hsc3中的平均伤口宽度显著降低(n＝6，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.001)。图3c描绘明胶酶酶谱，其示出了来自scc4、cal27和hsc3经处理细胞的mmp2和mmp9活性。
17.图4a
‑
b示出了scne和印苦楝内酯抑制小鼠中oscc源性的肿瘤生长。图4a示出了scc4(30天治疗
–
肿瘤体积减小81.12％)、hsc3(25天治疗
–
肿瘤体积减小48.81％)和cal27(35天治疗
–
肿瘤体积减小49.00％)细胞生长在饲喂scne 200mg/kg饮食的小鼠中被显著抑制(*p<0.005，**p<0.001)。图4b示出了在25天后，印苦楝内酯治疗(20mg/kg ip)显著(*p<0.05)减小(66％)小鼠中的hsc3肿瘤体积。
18.图5a
‑
c示出了scne在oscc的4nqo
‑
1小鼠模型中抑制肿瘤生长。图6a示出了在12周研究中，按200mg/kg scne饮食，cba小鼠未显示体重增加的差异。图5b示出了与无scne饮食相比，scne饮食使舌头减小5倍(**p<0.01)并且减轻舌癌。图5c示出了scne饮食降低小鼠舌头中增殖标志物pcna、ki
‑
67、c
‑
met的水平。
19.图6.示出了饲喂scne的小鼠中来自scc4、cal27和hsc3异种移植物的对小鼠循环细胞因子水平的影响。
20.图7示出了来自4nqo
‑
1致癌物诱导的oscc模型的对小鼠循环细胞因子水平的影响。
21.图8示出了scne降低异种移植和致癌物诱导的oscc小鼠模型中的血清炎性细胞因子水平。
22.图9a
‑
d示出了scne降低crc细胞的活力。将hct116、ht29和iec6细胞分别用不同浓
度的scne(a，b)和印苦楝内酯(c，d)处理48小时和72小时，并通过mtt测定来测量细胞活力。数据表示为来自三个独立实验的平均值
±
sd。*p<0.05表示与媒介物对照相比的显著差异。
23.图10a
‑
b示出了scne诱导hct116和ht29细胞的凋亡。将crc细胞用scne(40和75μg/ml)和印苦楝内酯(5和10μm)处理48小时。通过bax、bcl
‑
2和细胞周期蛋白d1的蛋白质印迹分析确定了用scne(a)和印苦楝内酯(b)处理的hct116和ht29细胞中凋亡调控蛋白的表达，其中gapdh用作标准品。每个条带代表三个实验。
24.图11a
‑
b示出了scne参与ht29结肠癌细胞的迁移。采用迁移划痕测定来研究scne(75μg/ml)和印苦楝内酯(10μm)在ht29结肠癌细胞迁移中的作用。图11a示出了scne(75μg/ml)和印苦楝内酯(10μm)有效地抑制ht29细胞的迁移。图11b示出了用印苦楝内酯处理同样有效地抑制了迁移。
25.图12a
‑
e示出了结肠癌细胞hct116和ht29细胞中scne和印苦楝内酯对转录因子p65核定位和stat3磷酸以及促炎性标志物的抑制。图12a示出了用scne和印苦楝内酯处理hct116和ht29细胞48小时，并通过免疫荧光染色检查了p65核转运。scne和印苦楝内酯阻断了p65蛋白向细胞核易位。图12b示出了用scne(40和75μg/ml)处理hct116和ht29细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测pstat3、p65、ikkβ和gapdh蛋白的表达水平。图12c示出了用印苦楝内酯(5和10μm)处理hct116和ht29细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测pstat3、p65、ikkβ和gapdh蛋白的表达水平。数据是从3个独立的实验获得的。图12d示出了用scne(40和75μg/ml)处理hct116和ht29细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测cox1、cox2、il
‑
6、tnf
‑
α和gapdh蛋白的表达水平。图12e示出了用印苦楝内酯(5和10μm)处理hct116和ht29细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测cox1、cox2、il
‑
6、tnf
‑
α和gapdh蛋白的表达水平。gapdh用作细胞内部蛋白标志物。数据是从3个独立的实验获得的。
26.图13a
‑
b示出了结肠癌细胞中scne和印苦楝内酯对侵袭的抑制。图13a示出了用scne(40和75μg/ml)处理hct116和ht29细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测mmp2、mmp9和gapdh蛋白的表达水平。明胶酶谱测定显示scne处理对mmp2的蛋白水解活性的浓度依赖性抑制。图13b示出了用印苦楝内酯(5和10μm)处理hct116和ht29细胞48小时，并通过蛋白质印迹分析检测mmp2、mmp9和gapdh蛋白的表达水平。明胶酶谱测定显示印苦楝内酯处理对mmp2的蛋白水解活性的浓度依赖性抑制。
具体实施方式
27.通过参考本发明的以下详细描述、附图和本文所包括的实施例，可以更容易地理解本公开。
28.在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应理解它们不限于特定的合成方法(除非另外指明)或特定的试剂(除非另外指明)，因为此类组合物和方法当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且不意图是限制性的。尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试，但现在描述示例性方法和材料。
29.此外，应当理解的是，除非另有明确说明，否则决不意味着本文阐述的任何方法都被解释为要求其步骤以特定次序执行。因此，在方法权利要求项没有实际叙述其步骤所遵循的顺序或在权利要求书或描述中没有另外具体陈述各步骤将限于特定顺序的情况下，决
不意图在任何方面推断顺序。这适用于任何可能的未表达的解释原则，包括相对于步骤安排或操作流程的逻辑事项、从语法组织或标点符号得到的清晰含义以及在说明书中描述的方面的数量或类型。
30.为了公开和描述公布在引用时所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用的方式并入本文。本文所论述的出版物仅仅出于其在本申请的提交日期之前公开而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些公布。此外，本文中提供的公布日期可能不同于实际的公布日期，它们可能需要单独确认。
31.如在说明书和所述权利要求中所用，除上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
32.如本文所用的字词“或”表示特定列表的任何一个成员，并且还包括所述列表的成员的任何组合。
33.贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含(comprise)”和所述词语的变化形式如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”意指“包括但不限于”并且不意图排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。具体地，在被叙述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，特别设想每个步骤包括所列出的事物(除非所述步骤包括限制性术语，诸如“由......组成”)，这意味着每个步骤不意图排除例如所述步骤中未列出的其他添加剂、组分、整数或步骤。
34.范围在本文中可表示为“约(about)”或“大约(approximately)”一个特定值和/或至“约”或“大约”另一特定值。当表示这样一个范围时，另外的方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”或“大约”将值表达为近似值时，将理解的是特定值形成了另外方面。将进一步理解，每个范围的端值相对于另一端值而言都是重要的，并且独立于另一端值。还应理解，本文公开了多个值，并且本文中每个值除所述值本身之外还公开为“约”所述特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
35.如本文所使用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且所述描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。
36.如本文所用，术语“受试者”是指施用的靶标，例如人。因此，所公开的方法的受试者可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。术语“受试者”还包括家养动物(例如，猫、犬等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。在一个方面中，受试者是哺乳动物。在另一个方面中，受试者是人。所述术语不表示特定年龄或性别。因此，意图涵盖成年、儿童、青春期和新生的受试者，以及胎儿，无论是雄性还是雌性。
37.如本文所用，术语“患者”是指患有疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在所公开的方法的一些方面中，例如在施用步骤之前，“患者”已经被诊断出需要治疗癌症。
38.如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、减轻、延迟特定疾病、病症和/或疾患的发作，抑制或减缓其进展，降低其严重性和/或降低其的一种或多种症状或特征的发生率。可向未表现出疾病、病症和/或疾患的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症
和/或疾患的早期体征的受试者施用治疗，以用于降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。例如，疾病，病症和/或疾患可以是癌症或过度增生性病症。
39.如本文所用，术语“抑制”是指相对于无治疗情况下的速率降低肿瘤细胞生长速率和/或使得肿瘤块(例如，癌症)减小。抑制还包括引起肿瘤(例如，癌症)的完全消退。
40.引言
41.随着全球吸烟、饮酒和hpv暴露持续上升，发展口腔癌的风险在全球范围内日益增加(癌症事实和数据2015)。口腔鳞状细胞癌(oscc)占所有口腔癌的90％，并且代表全球第六最常见的癌症和美国第八最常见的癌症(癌症事实和数据2015)。尽管常规治疗提高了早期疾病患者的5年存活率，但晚期疾病(iii期和iv期)患者的5年存活率低至34％(癌症事实和数据2015)。此外，这些统计数据在近40年内没有变化。因此，预防oscc起始和进展对于降低这种破坏性疾病的发病率和死亡率可以是重要的。
42.印楝或印度楝树属于与桃花心木有关的树科；楝科(hao f,kumar s,yadav n,chandra d.neem components as potential agents for cancer prevention and treatment.biochim biophys acta；1846:247
‑
57)。印度楝树原产于印度、缅甸、孟加拉国、斯里兰卡、马来西亚和巴基斯坦，并生长在世界各地的热带和半热带地区(hao f,kumar s,yadav n,chandra d.neem components as potential agents for cancer prevention and treatment.biochim biophys acta；1846:247
‑
57)。印度楝树是高度活跃的柠檬苦素类化合物(liminoid)萜类化合物的来源，统称为azadiractoid，其显示出具有抗癌活性(manikandan p,ramalingam sm,vinothini g,ramamurthi vp,singh ip,anandan r,等人investigation of the chemopreventive potential of neem leaf subfractions in the hamster buccal pouch model and phytochemical characterization.eur j med chem；56:271
‑
81)。oscc中印度楝树提取物的先前研究仅限于在仓鼠颊囊致癌模型中评估的印度楝树树叶中相对不纯的乙醇有机提取物，在所述模型中显示一些活性(subapriya r,kumaraguruparan r,nagini s.expression of pcna,cytokeratin,bcl
‑
2and p53 during chemoprevention of hamster buccal pouch carcinogenesis by ethanolic neem(azadirachta indica)leaf extract.clin biochem 2006；39:1080
‑
7；和dasgupta t,banerjee s,yadava pk,rao ar.chemopreventive potential of azadirachta indica(neem)leaf extract in murine carcinogenesis model systems.j ethnopharmacol 2004；92:23
‑
36)。胃癌和皮肤癌的鼠类模型也证明了印度楝树树叶乙醇提取物的功效，所述印度楝树树叶乙醇提取物含有至少35种生物活性化合物(dasgupta t,banerjee s,yadava pk,rao ar.chemopreventive potential of azadirachta indica(neem)leaf extract in murine carcinogenesis model systems.j ethnopharmacol 2004；92:23
‑
36)。
43.印度楝树(印楝)的地上部分和种子已被用作治疗多种人疾病的药物。印度楝树在阿育吠陀传统医学中具有丰富的用途，并且其用于治疗促炎性疾患的民俗用途带来了以下假设：其抗炎潜力可用于癌症预防和治疗。支持这一观点的是印度和非洲传统上使用印度楝树治疗急性和慢性炎症性疾病的悠久历史。例如，印度楝树嫩枝长期以来一直在传统上用来维持口腔健康，并且印度楝树已经显示出具有抗细菌、抗真菌和抗溃疡特性。这些观察结果对印度楝树及其成分可调节癌症相关炎症的观点增加了可信度。
44.印度楝树树叶的有机溶剂提取物已在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等模型中展现了抗肿瘤作用。超临界提取技术允许从天然化合物中更好地提取生物活性成分，从而避免了活性剂对热量或溶剂降解的不稳定性。在一些方面中，印度楝树树叶的超临界co2提取物用于本文公开的实施例中，并且制备所述提取物的方法允许更好地保留先天性挥发物。印度楝树富含挥发性萜类化合物(柠檬苦素类化合物)，所述萜类化合物导致树叶的苦味，并且作为一类，是发现于印度楝树树叶中的主要生物活性植物化学物质之一。几乎没有印度楝树柠檬苦素类化合物以足以检查作用机制的量被分离出来。在更常见的印度楝树柠檬苦素类化合物中，大部分研究都集中在印苦楝内酯(5,7,4'
‑
三羟基
‑
3',5'
‑
二异戊二烯基黄酮)上。几项研究已经检查了印苦楝内酯用于抑制多种细胞系(包括成神经细胞瘤、白血病和黑素瘤)的生长。还发现印苦楝内酯可诱导乳腺癌和成胶质细胞瘤细胞系中的细胞周期改变，并调节细胞信号传导途径。据初始研究报告，vegf和其他实现转移的因子的表达在体外受到抑制。超临界树叶提取物使用相对安全，并且不含在印度楝树油中发现的毒性化合物，印度楝树油被广泛用作天然杀虫剂。由于印度楝树树叶的至少一种超临界提取物已作为许多保健产品的成分进入商业市场，因此在一系列结肠癌临床前模型系统中检查了其功效，将其作用与印苦楝内酯进行了比较。
45.本文描述的是印度楝树的超临界co2提取物(scne)，其纯度较高，因此已鉴定出生物活性成分印苦楝内酯并且已除去了潜在溶质污染物(rodriguez
‑
solana r,salgado jm,dominguez jm,cortes
‑
dieguez s.comparison of soxhlet,accelerated solvent and supercritical fluid extraction techniques for volatile(gc
‑
ms and gc/fid)and phenolic compounds(hplc
‑
esi/ms/ms)from lamiaceae species.phytochem anal；26:61
‑
71)。使用基于细胞的测定、oscc的4nqo
‑
1致癌物模型和人oscc的小鼠异种移植物模型，评估了scne在体外和体内的抗增殖作用。除了破坏驱动90％的oscc的egfr信号传导之外，本文还描述了对循环细胞因子以及炎性和凋亡标志物的影响。
46.组合物
47.本文公开了可与本文公开的任何方法一起使用的组合物。本文所述的组合物可以是超临界co2印度楝树提取物(scne)。本文还公开了包含超临界co2印度楝树提取物的组合物。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。如本文所公开，印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，本文所述的组合物中的任何组分的浓度可变化。
48.在一些方面中，本文所述的组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。取决于制剂，药学上可接受的赋形剂的包含可以是任选的。可使用的药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于糊精/麦芽糊精或磷酸二钙、蒸馏水、盐水、葡萄糖水溶液、醇(例如乙醇)、表面活性剂、丙二醇、tween
‑
80和聚乙二醇；和油性载体如各种动物油和植物油、白色软石蜡、石蜡、蜡、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、黄糊精、麦芽糊精、白糊精、气雾剂、微晶纤维素、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山梨醇、甜菊苷、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、l
‑
抗坏血酸、dl
‑
α
‑
生育酚、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂
肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、b族维生素、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、充气或气相二氧化硅、钙盐、色素、调味剂和防腐剂。
49.在一些方面中，scne可包含一种或多种柠檬苦素类化合物。在一些方面中，所述组合物还包含一种或多种生育酚；和芝麻油。生育酚的实例包括但不限于α
‑
生育酚、γ
‑
生育酚、维生素e(生育酚)或迷迭香(迷迭香)co2提取物或药学上可接受的任何抗氧化剂。在一些方面中，所述组合物还包含一种或多种生育酚；芝麻油；以及充气或气相二氧化硅。
50.在一些方面中，所述组合物可包含：snco2提取物：75mg；抗氧化剂，例如维生素e或迷迭香(迷迭香)co2提取物：10mg以及芝麻油：415mg。
51.在一些方面中，所述组合物可包含：snco2提取物：50mg；582mg糊精/麦芽糊精或其他载体(例如，磷酸二钙或任何其他药物级载体)；和18mg充气或气相二氧化硅。
52.在一些方面中，所述组合物可包含水提取物，所述水提取物获自印楝树叶并且用作载体以制备50mg通过如本文所述的超临界co2提取获得的印度楝树树叶提取物的自由流动粉末。
53.在一些方面中，所述组合物可包含snco2提取物：2.28g；薄荷(洋薄荷)油：13.81g；绿薄荷(留兰香)油：9.26g；丁香苞(丁香)co2油：3.98g；吐温80：20.68g。将1.25g的所述共混物稀释于98.75g的基料中。基料包含：水：73.5g；芦荟水(200x)：10g；山梨糖醇：10g；甘油：5.9g；抗坏血酸：0.5g；山梨酸钾：0.1g。
54.治疗方法
55.本文公开了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)确定需要治疗的受试者；以及(b)向所述受试者施用治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)。在一个方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。此外，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)确定需要治疗的受试者；以及(b)向所述受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，本文所述的组合物中的任何组分的浓度可变化。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试者可以是人。
56.本文公开了减少有需要的受试者血清中的至少一种炎性细胞因子的方法。在一些方面中，所述方法可包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物。在一个方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试
者可以是人。在一些方面中，至少一种炎性细胞因子可以是ifn
‑
γ、ifn
‑
β、tnf
‑
α、il
‑
6或il
‑
1。在一些方面中，所述受试者可患有、疑似患有或被诊断患有口腔癌。在一些方面中，向受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物的组合物(其中scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin)可减少受试者血清中的至少一种炎性细胞因子，其中所述受试者患有、疑似患有或已被诊断患有口腔癌。在一些方面中，至少一种炎性细胞因子可以是il
‑
6或tnf
‑
α。在一些方面中，在患有、疑似患有或已被诊断患有口腔癌的受试者中施用治疗有效量的本文所述的超临界co2印度楝树提取物后，ifn
‑
γ、ifn
‑
β、tnf
‑
α、il
‑
6或il
‑
1可减少。在一些方面中，在施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物的组合物之前，当与参考样品相比时，受试者的血清可具有增加水平的至少一种炎性细胞因子。在一些方面中，所述方法还可包括在施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物的组合物之前，确定受试者的一种或多种细胞中的至少一种炎性细胞因子的水平。在一些方面中，当与参考样品相比时，至少一种炎性细胞因子的水平可更高。
57.本文公开了减轻有需要的受试者的炎症的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试者可以是人。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断患有口腔癌或结肠癌。在一些方面中，可通过减少ifn
‑
γ、ifn
‑
β、tnf
‑
α、il
‑
6、il
‑
1、nf
‑
kb、stat3、cox1或cox2中的一者或多者的表达来减轻炎症。
58.本文公开了治疗有需要的受试者的过度增生性病症的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物。在一个方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试者可以是人。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断为需要治疗过度增生性病症。在一个方面中，过度增生性病症可以是癌症。在一些方面中，过度增生性病症可以是口腔癌或结肠癌。
59.本文公开了抑制有需要的受试者中的nfkb和环氧合酶表达的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所
述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试者可以是人。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断为需要抑制nfkb和环氧合酶的表达。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。在一些方面中，所述方法还可包括确定需要治疗细胞增殖失控的病症的受试者的步骤。在一些方面中，细胞增殖失控的病症可以是癌症。在一些方面中，癌症可以是口腔癌。
60.本文公开了抑制至少一种细胞中的nfkb和环氧合酶表达的方法。在一些方面中，所述方法可包括使至少一种细胞与有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)接触的步骤。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一些方面中，至少一种细胞可以是人细胞。在一些方面中，接触步骤可以通过向受试者施用来进行。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。在一些方面中，受试者患有、疑似患有或已被诊断患有口腔癌。在一些方面中，不受控制的细胞增殖可以是癌症。
61.本文公开了改变受试者中的表皮生长因子受体信号传导(egfr)活性的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试者可以是人。在一些方面中，受试者已被诊断为需要改变egfr信号传导活性。在一些方面中，改变可以是抑制。在一些方面中，scne可抑制egfr信号传导活性。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。在一些方面中，所述方法还包括确定需要治疗细胞增殖失控的病症的受试者的步骤。在一些方面中，细胞增殖失控的病症可以是口腔癌。
62.本文公开了在有需要的受试者中诱导细胞凋亡的方法。所述方法可包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物。在一些方面中，scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一些方面中，所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。在一个方面中，所述受试者可以是人。在一些方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。在一些方面中，所述方法还可包括确定需要治疗细胞增殖失控的病症的受试者的步骤。在一些方面中，细胞增殖失
控的病症可以是癌症。在一些方面中，癌症可以是结肠癌。
63.可将本文所述的组合物配制成包含治疗有效量的本文所述的超临界co2印度楝树提取物。在一个方面中，超临界co2印度楝树提取物可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。印苦楝内酯、印楝素和salinin中任一者的浓度可变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。治疗性施用涵盖预防性用药。基于基因测试和其他预后方法，与其患者会诊的医师可选择预防性施用，其中患者对某种类型的癌症具有临床确定的易患病体质或增加的易感性(在一些情况下，大大增加的易感性)。
64.印苦楝内酯、印楝素和salinin的浓度或量可在单一组合物中变化。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。每种组分的浓度或量可根据许多因素(例如，癌症的特定类型和严重程度以及制剂的类型)而变化。
65.在一些方面中，scne可包含一种或多种柠檬苦素类化合物。在一些方面中，scne还包含印楝素(azadirachtin)a、印楝素b和脱乙酰基salinin。在一些方面中，scne还包含少量的印楝素a、印楝素b和脱乙酰基salinin中的一者或多者。在一个方面中，“少量”可指可处于检测限的量。
66.在一些方面中，本文所述的组合物还可包含一种或多种生育酚；和芝麻油。生育酚的实例包括但不限于α
‑
生育酚、γ
‑
生育酚、维生素e(生育酚)或迷迭香(迷迭香)co2提取物或药学上可接受的任何其他天然存在的抗氧化剂。在一些方面中，所述组合物还包含一种或多种生育酚；芝麻油；以及充气或气相二氧化硅。
67.本文所述的组合物可以足以延迟、减少或优选预防临床疾病发作的量施用于受试者(例如，人患者)。因此，在一些方面中，患者可以是人患者。在治疗应用中，将组合物以足以至少部分地改善疾患的体征或症状或抑制疾患的进展(并且优选阻止疾患的症状、其并发症和后果)的量施用于已患有或被诊断患有癌症的受试者(例如，人患者)。将足够实现此的量定义为“治疗有效剂量”。组合物(例如药物组合物)的治疗有效量可以是达到治愈的量，但结果仅是可达到的多种结果中的一种。如上所述，治疗有效量包括提供治疗的量，其中癌症的发作或进展被延迟、阻碍或预防，或癌症或癌症的症状得到改善。症状中的一种或多种可能不太严重。可加快被治疗的个体的恢复。
68.本文公开了治疗患有癌症的患者的方法。癌症可以是任何癌症。在一些方面中，癌症可以是口腔癌或结肠癌。在一些方面中，癌症可以是原发性或继发性肿瘤。在一个方面中，在施用步骤之前，受试者已被诊断患有癌症。
69.可将本文所述的组合物配制成包含治疗有效量的单独或与一种或多种治疗剂或疗法或治疗方案组合的本文所述的超临界co2印度楝树提取物。在一个方面中，一种或多种治疗剂或疗法或治疗方案可以是化学疗法或放射疗法。在一个方面中，scne可包含在药物制剂内。在一个方面中，药物制剂可以是单位剂量制剂。本文所述的组合物可以各种组合来
配制。scne与一种或多种化学治疗剂或放射疗法的特定组合可根据许多因素(例如癌症的特定类型和严重程度)变化。
70.可由本领域普通技术人员考虑个体在年龄、体重、性别方面的差异、所施用的其他药物以及主治医生的判断来确定应用于哺乳动物(例如人)的如本文公开的方法中使用的如本文所述的超临界co2印度楝树提取物的治疗有效量或剂量。可预期所需剂量的变化。可使用标准经验途径来调整剂量水平的变化以进行优化。施用于患者的药物组合物的具体剂量将取决于多种考虑因素(例如，癌症症状的严重性)、受试者的年龄和身体特征以及本领域普通技术人员已知的其他考虑因素。可使用本领域普通技术人员已知的临床方法来确立剂量。
71.用本文提供的任何组合物治疗的持续时间可以是从短至一天到长至宿主的寿命(例如许多年)的任何时间长度。例如，所述组合物可每天一次；每周一次(例如4周到数月或数年)；每月一次(例如，三到十二个月或许多年)；或每年一次持续5年、10年或更长的时间段施用。还应注意，治疗的频率可以是可变的。例如，本发明的组合物可每天、每周、每月或每年施用一次(或两次、三次等)。在一个方面中，本文所述的组合物可每天施用两次至三次。在一些方面中，本文所述的组合物可每天施用两至三次，持续两周至三周至四周(或更长时间)。在一些方面中，本文所述的组合物可每天施用两至三次。在一些方面中，本文所述的组合物可每天施用两至三次，持续两周、三周或四周。
72.scne的剂量可在50mg至1000mg/天的范围内。在一个方面中，scne可以约50mg至1000mg/天范围内的剂量施用。在一个方面中，scne的剂量可以是25、50、75、100、125或150mg/天或其间的任何量。在一些方面中，scne的剂量可大于150mg/天。在一些方面中，scne的剂量可以是160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mg/天或其间的任何量。在一个方面中，本文所述的组合物可呈胶囊的形式。在一些方面中，胶囊可每天口服施用一次、两次或三次。在一些方面中，所述组合物可每天口服施用一次、两次或三次，持续21或28天。在一些方面中，所述组合物可每天口服施用两次或三次，持续21或28天。在一些方面中，所述组合物可施用1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间。在一些方面中，所述组合物可每天口服施用两次或三次，持续6个月。
73.在一些方面中，本文公开的组合物的总有效量可作为单剂量，作为大丸剂在相对较短的时间段内施用于受试者，或者可使用分次治疗方案来施用，其中在更长时间段内施用多次剂量。
74.在一些方面中，本文所述的组合物可与其他治疗方式联合施用于需要治疗的受试者。可在用其他剂或方案治疗之前、同时或之后给予本发明的化合物。例如，本文所述的超临界co2印度楝树提取物可与用于治疗癌症的标准疗法联合施用。在一个方面中，本文所述的任何组合物可与化学疗法或放射疗法一起施用或使用。
75.药物组合物
76.本文公开了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的超临界co2印度楝树提取物和本文所述的药学上可接受的载体。在一些方面中，scne可被配制成用于口服施用。可将组合物配制为通过多种施用途径中的任一种施用，并且可包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂，其可根据施用途径而变化。如本文所用，术语“赋形剂”是指任何化合物或物
质，包括也可称为“载体”或“稀释剂”的那些化合物或物质。制备制药上和生理学上可接受的组合物在本领域中被认为是常规的，并且因此，如果需要的话，本领域的普通技术人员可向众多权威咨询以获得指导。
77.在一些方面中，本文公开的组合物可直接施用于受试者。一般而言，可将组合物悬浮在药学上可接受的载体(例如，生理盐水或缓冲盐水溶液)中以促进其递送。将组合物包封在合适的递送媒介物(例如，聚合物微粒或可植入装置)中可提高递送效率。
78.在一些方面中，可以各种方式将组合物配制用于肠胃外或非肠胃外施用。在合适的情况下，口服制剂可采取片剂、丸剂、胶囊或粉末的形式，其可进行肠溶包衣或以其他方式进行保护。也可使用持续释放制剂、悬浮液、酏剂、气雾剂等。在一个方面中，所述组合物可呈包括胶囊的形式。
79.可掺入药学上可接受的载体和赋形剂(例如水、盐水、右旋糖水溶液和乙二醇、油(包括石油、动物、植物或合成来源的油)、淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙醇等)。在一些方面中，药学上可接受的赋形剂可以是糊精/麦芽糊精或磷酸二钙。在一些方面中，赋形剂可根据制剂而变化。在一些方面中，赋形剂可以是任选的。在一些方面中，药学上可接受的赋形剂和载体可选自由以下组成的组：蒸馏水、盐水、葡萄糖水溶液、醇(例如乙醇)、表面活性剂、丙二醇、tween
‑
80和聚乙二醇；和油性载体如各种动物油和植物油、白色软石蜡、石蜡、蜡、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、黄糊精、麦芽糊精、白糊精、气雾剂、微晶纤维素、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山梨醇、甜菊苷、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、l
‑
抗坏血酸、dl
‑
α
‑
生育酚、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、b族维生素、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、充气或气相二氧化硅、钙盐、色素、调味剂和防腐剂。组合物可经受常规药物手段如灭菌，并且可含有常规药物添加剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂等。合适的药物载体及其制剂描述于e.w.martin的"remington's pharmaceutical sciences"中，所述文献以引用的方式并入本文。在任何情况下，此类组合物将含有有效量的组合物以及合适量的载体，以便制备用于适当施用于患者的合适剂型。
80.如本文所公开的药物组合物可被制备来用于口服施用。在一个方面中，所述组合物可口服施用。被制备用于肠胃外施用的药物组合物包括被制备用于静脉内(或动脉内)、肌内、皮下、腹膜内、经粘膜(例如，鼻内、阴道内或直肠)或经皮(例如，局部)施用的那些药物组合物。也可使用气雾剂吸入。因此，可制备用于肠胃外施用的组合物，所述组合物包含溶解或悬浮在可接受的载体中的scne，所述可接受的载体包括但不限于水性载体，诸如水、缓冲水、盐水、缓冲盐水(例如，pbs)等。所包含的赋形剂中的一种或多种赋形剂可有助于接近生理条件，诸如为ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、湿润剂、去污剂等。在组合物包含固体组分(当它们可用于口服施用时)的情况下，赋形剂中的一种或多种可充当粘合剂或填充剂(例如，用于片剂、胶囊等的制剂)。在一个方面中，所述组合物可用于液体制剂(例如，漱口水)。药物组合物可为无菌的，并且可通过常规的灭菌技术进行灭菌或进行无菌过滤。水溶液可按原样被包装使用或被冻干，本公开所涵盖的冻干制备物可在施用之前与无菌溶液混合。药物组合物的ph通常将介于3与11之间(例如，介于约5与9之间)或介于6与8之间(例如，
介于约7与8之间)。可将固体形式的所得组合物以多个单剂量单位进行包装，每个单剂量单位包含固定量的一种或多种上述剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。在一个方面中，可将组合物包装在包含多个呈液体形式的剂量的容器中。
81.在一个方面中，药物组合物包含scne；以及任选地，药学上可接受的载体。scne可包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。在一些方面中，scne可包含至少3mg/g印苦楝内酯。在一些方面中，scne可包含至少130μg/g印楝素。在一些方面中，scne可包含至少200μg/g salinin。在一些方面中，组合物中存在的印苦楝内酯的量可以是至少3mg/g；组合物中存在的印楝素的量可以是至少130μg/g印楝素；并且组合物中存在的salinin可以是至少200μg/g。在一个方面中，所述药物组合物可被配制成用于口服施用。在一个方面中，所述组合物可被配制成胶囊或液体。
82.在一些方面中，本文所述的组合物可以用于口服施用的治疗有效制剂的形式提供，所述制剂包含：snco2提取物：75mg；抗氧化剂，例如维生素e(生育酚)或迷迭香(迷迭香)co2提取物：10mg以及芝麻油：415mg。可将所述组合物置于500mg的软胶囊中。在一些方面中，可将所述胶囊每天两次总计50
‑
1000mg至每天四次总计1000mg的印度楝树树叶提取物作为活性药物施用于患者。
83.在一些方面中，本文所述的组合物可以用于口服施用的治疗有效制剂的形式提供，所述制剂包含：snco2提取物：50mg；582mg糊精/麦芽糊精或其他载体(例如，磷酸二钙或任何其他药物级载体)；和18mg充气或气相二氧化硅。可制备自由流动的粉末并将其封装在“00”号硬明胶或素食胶囊中。在一个方面中，所述治疗方案可以是在21或28天的周期中每天两次，每次1个胶囊至每天三次每次3个胶囊，共6个周期。在一些方面中，本文所述的组合物可以用于口服施用的治疗有效制剂的形式提供，所述制剂包含：水提取物，所述水提取物获自印楝树叶并且用作载体以制备50mg通过如本文所述的超临界co2提取获得的印度楝树树叶提取物的自由流动粉末。可每天两次施用所述组合物以达到150mg的治疗剂量至每天四次施用总计1000mg如本文所述的印度楝树树叶co2提取物。
84.在一些方面中，本文所述的组合物可以作为漱口水的治疗有效制剂的形式提供，所述制剂包含：snco2提取物：2.28g；薄荷(洋薄荷)油：13.81g；绿薄荷(留兰香)油：9.26g；丁香苞(丁香)co2油：3.98g；吐温80：20.68g。将1.25g的所述共混物稀释于98.75g的基料中。基料包含：水：73.5g；芦荟水(200x)：10g；山梨糖醇：10g；甘油：5.9g；抗坏血酸：0.5g；山梨酸钾：0.1g。本文所述的制剂是液体制剂，所述制剂可每天施用1
‑
3次，每次20ml，以达到150
‑
1000mg如上所述的印度楝树树叶co2提取物的治疗剂量。漱口水制剂可用于治疗或预防口腔癌。
85.在一些方面中，微细尺寸的纳米颗粒co2(其中最少10％的提取物是纳米颗粒)可通过增加速度并使颗粒通过微射流或喷嘴来制备，可每天口服施用2至3次，以达到100
‑
500mg如上所述的印度楝树树叶co2提取物的治疗有效剂量，而不是1000mg的普通co2提取物。
86.可使用本文所述的纳米颗粒提取物来制备本文公开的制剂。
87.制品
88.可将本文所述的组合物包装在经标记的合适容器中，例如以用作治疗癌症的疗法或用于本文所公开的任何方法。因此，包装产品(例如，含有本文所述的组合物并以浓缩或
即用浓度包装用于储存、运输或销售的无菌容器)和药盒(至少包括如本文所述的scne和使用说明书)在本公开的范围内。产品可包括含有本文所述的组合物的容器(例如，小瓶、广口瓶、瓶、袋等)。此外，制品还可包括例如包装材料、使用说明书、注射器、缓冲剂或其他用于治疗或监测需要预防或治疗的疾患的对照试剂。产品还可包括图例(例如，印刷的标签或插页或描述产品用途的其他媒介(例如，录音带或录像带))。图例可与容器相关联(例如，固定至容器上)，并且可描述其中的化合物应施用的方式(例如，施用的频率和途径)、其适应症以及其他用途。所述化合物可以是预备好施用的(例如，以剂量合适的单位存在)，并且可包含药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂。可替代地，化合物可以浓缩形式与稀释剂和稀释说明书一起提供。
89.实施例
90.实施例1：印度楝树(印楝)提取物在体内对口腔鳞状细胞癌的生长抑制：通过用天然印度楝树树叶提取物治疗，破坏炎症级联反应，减少口腔鳞状细胞癌的肿瘤发生和体积。
91.印度楝树(印楝)的树叶和树皮已在传统的阿育吠陀医学中使用了多个世纪用于治疗口腔疾病。本文所述的实验测试以下假设：使用这种印度楝树树叶提取物可预防oscc的起始和/或进展。印度楝树树叶提取物的抗癌潜力已在体外和体内平台上进行测试。在不同时间点用所述树叶提取物处理oscc细胞系(scc4、cal27、hsc3)，同时分析炎症、侵袭和增殖的标志物。在异位异种移植物小鼠模型和致癌物诱导的口腔癌小鼠模型中也评估了scne的预防作用。用印度楝树树叶提取物处理抑制了oscc细胞增殖，降低oscc细胞中炎症标志物的水平。印度楝树树叶提取物减少伤口闭合，显示出对转移的抑制。异种移植裸鼠显示出oscc肿瘤发生的显著减少和肿瘤生长减少。印度楝树树叶提取物还显著减少4nqo
‑
1小鼠口腔致癌物模型中的肿瘤和舌头发育异常。在两种癌症动物模型中，印度楝树树叶提取物均抑制循环炎性细胞因子。还在体外和体内检查了scne对抑制和预防oscc的化学预防作用。结果显示肿瘤增殖显著减少、炎症标志物和循环细胞因子减少，这有力地支持了scne在独立方案中或与标准前线疗法组合地作为预防剂来改善患者结果的潜力。
92.材料和方法
93.试剂。超临界co2印度楝树提取物由印度萨尔塔拉的nisarga ltd提供。将来自有机生长的印度楝树的树叶用超临界co2进行加工。超临界提取物具有以优异的溶解力替代有机溶剂的优点，并且没有有机残余物剩余，从而产生高纯度的印度楝树提取物(scne)(lindskog ma,nelander h,jonson ac,halvarsson t.delivering the promise of sfc:a case study.drug discov today；19:1607
‑
12)。在体外使用在100％dmso中的50mg/ml原液。印苦楝内酯购自biovision(#2356)，并溶解于100％dmso中得到1mg/ml的原液。scne饮食由harlan teklad生产，递送200mg/kg的scne
–
snce溶解于玉米油中并与剩余的饮食成分均匀混合并且形成团块。将塞来昔布(pz0008，sigma，usa)溶解于100％dmso中得到1mg/ml的原液。
94.人oscc细胞系和mtt测定。scc4和cal27口腔癌细胞获自atcc，并在37℃和5％co2下保持在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem中。对于scc4细胞，在完全培养基中提供400ng/ml的氢化可的松。对于细胞处理，使用scne(nisarga ltd.)并以不同浓度(1
‑
400μg/m)施加8小时、24小时或48小时至75％汇合细胞。对于每种细胞系，待测试的剂量将包括ic
50
。对照细胞将接受dmso。将印苦楝内酯以不同浓度(1
‑
100μm)施加8小时、24小时
或48小时至50％汇合细胞。对于塞来昔布处理，将细胞以不同浓度(1
‑
200ug/ml)处理8小时、24小时或48小时。将细胞在完全培养基中培养过夜，使血清饥饿24小时，并如本文所述用媒介物、scne、印苦楝内酯或塞来昔布处理。随后，向每个孔添加10μl 12mm mtt(life technologies；carlsbad,ca)溶液，在37℃下孵育4小时，并用dmso中和。在540nm处测量吸光度并计算活力百分比。
95.明胶酶酶谱。在非还原条件下，在0.1％明胶存在下，在10％sds聚丙烯酰胺凝胶中进行明胶酶酶谱分析。在96孔板中生长结肠癌细胞。从每个孔(3x的池)收集200μl培养基，并浓缩至最终体积20μl。将培养基(20μl)与样品缓冲液混合，并负载用于sds
‑
page，无需煮沸。电泳后，将凝胶在含有triton x
‑
100(thermo scientific，ma)的1x酶谱复性缓冲液中于室温下洗涤两次(每次1小时)，以除去sds。然后将凝胶在含有底物(thermo scientific，ma)的1x酶谱显影缓冲液中在37℃下孵育48小时，并用50％甲醇和10％冰醋酸中的0.5％考马斯蓝r250染色60分钟并脱色。在酶复性后，明胶酶消化凝胶中的明胶，并在强烈染色的背景下产生清晰条带。同时运行蛋白质标准品和2％胎牛血清(阳性对照)，并通过绘制已知蛋白质的相对迁移率(pmid 28440509)来确定适当的分子量。
96.细胞迁移测定。在完全生长培养基中的96孔板中培养scc4、cal27和hsc3细胞。使用woundmaker进行划痕，并使用incucyte zoom实时成像系统(essen bioscience,mi,usa)可视化。用20或60μg/ml scne或10或50μm印苦楝内酯处理细胞，并以3小时间隔成像72
‑
120小时，以监测细胞迁移和伤口愈合。
97.蛋白质表达。如前所述，将制备细胞蛋白提取物并定量蛋白质。简言之，将细胞用1x pbs洗涤两次，通过刮擦收集，并在4℃下在300g下离心6分钟。将团块重悬于250μl的缓冲液a(10mm tris
‑
hcl ph 7.8，10mm kcl，1.5mm mgcl2，1片蛋白酶抑制剂和水)中，并在冰上孵育10分钟。然后将样品在冰上以15,000rpm匀化45秒，然后在4℃下以4,600g离心5分钟。上清液将被除去并作为细胞溶质蛋白级分储存在
‑
80℃下。将收集的团块重悬于100μl缓冲液b(210mm tris
‑
hcl ph 7.8，420mm kcl，1.5mm mgcl2，20％甘油，1片蛋白酶抑制剂和水)中，然后在4℃下轻轻搅拌30分钟，并且在4℃下以10,000g离心10分钟。将收集上清液，并作为核蛋白级分储存在
‑
80℃下。将通过sds
‑
page(12％凝胶)分离50微克的细胞溶质或核蛋白级分，并转移至pvdf膜(bio
‑
rad，usa)。将用第一抗体(cell signalling，usa)nfkb p65(8242s)、stat3(8768s)、pstat3(9131s)、cox1(9896s)、cox2(12282s)、egfr(4267s)、pegfr(4404s)、erk1/2(t202/y204
–
9101s)、akt(9272s)、pakt(9271s)，然后辣根过氧化物酶结合的抗兔(7074s)探测膜。gapdh(2118s)或topo iiα(12286s)将用于确保相等的蛋白质负载。将使用化学发光底物(clarity ecl，bio
‑
rad)使免疫反应性条带在chemidoc touch(bio
‑
rad，usa)上可视化。将使用chemidoc软件(bio
‑
rad)对条带进行定量。
98.动物。在无病原体条件下，将六周大的雌性无胸腺裸鼠(harlan,indianapolis,in)用于层流气流橱中。在可控制的温度和湿度下，为它们提供12小时明/暗时间表，可随意获取食物和水。在研究开始之前，使小鼠适应一周。
99.oscc小鼠异种移植物模型。如先前所述，将小鼠在右侧腹皮下注射0.2ml无菌pbs中的3
×
106个hsc3或10x106个scc4或6x 106个cal27细胞。将小鼠置于ain76a合成饮食中24小时。然后将scne饮食(200mg/kg)放入印度楝树处理组，然后对照组保持ain76a。对于hsc3
动物组，从肿瘤注射后第10天开始以5mg或20mg印苦楝内酯/kg小鼠通过腹膜内连续5天注射印苦楝内酯。通过椭圆公式计算肿瘤体积：1/2(长度x宽度2)(jensen mm,jorgensen jt,binderup t,kjaer a.tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microct is more accurate and reproducible than determined by18f
‑
fdg
‑
micropet or external caliper.bmc med imaging 2008；8:16)。在终止时抽血并分离血清用于细胞因子分析。
100.cba致癌物诱导的口腔癌模型。将20只cba小鼠置于ain76a或200mg/kg scne饮食，并在其饮用水中以100μg/ml给予4
‑
nqo
‑
1(sigma)。将小鼠保持4nqo
‑
1水8周，然后4周常规水。在第12周时，在终止时抽血以进行血清细胞因子分析，并切除舌头且固定在福尔马林中。
101.免疫组织化学。将福尔马林固定的舌头用石蜡包埋并以1微米切片。使用以下抗体(abcam：pcna ab18197；ki
‑
67ab16667；c
‑
met ab51067)，按照先前公布的方法(pmid 27167203)进行免疫染色。
102.细胞因子和趋化因子测定。在终止时获取血清细胞因子/趋化因子谱，并储存在
‑
80℃，直到使用bio
‑
plex pro第1组小鼠细胞因子23
‑
plex测定试剂盒进行分析，并使用基于bio
‑
plex 200luminex的多重分析系统(bio
‑
rad，hercules，ca)进行分析。
103.统计分析。使用graphpad prism4(san diego，california)进行统计分析。通过单向anova和邦弗朗尼事后检验(bonferroni’s post
‑
hoc test)分析了细胞活力和迁移测定。使用邦弗朗尼事后检验进行重复测量，使用方差分析进行肿瘤生长的统计分析。小于0.05的p值被视为统计学上显著的。
104.结果
105.scne和印苦楝内酯抑制口腔鳞状癌细胞生长。先前报告了印度楝树提取物的一些抗癌作用，主要是醇来源的，以及印苦楝内酯(来自印度楝树树叶提取物的单一化合物)的作用。然而，迄今为止，尚无报告研究印度楝树树叶的无溶剂含疏水性和亲水性成分的超临界co2提取物的抗癌潜力。利用scne和印苦楝内酯，以不同的剂量和三个时间点(8小时、24小时、48小时)处理三种不同的oscc人细胞系，以确定细胞毒性浓度和ic50(图1a
‑
d)。scne以剂量和时间依赖性方式减少细胞生长，在所测试的时间点ic50为50μg/ml的snce(图1a，1c)且对于三个时间点ic50为15μm印苦楝内酯(图1b，1d)。接下来，将scne和印苦楝内酯的细胞毒性作用与标准的非类固醇类抗炎药塞来昔布进行比较(图1e
‑
f)。在8小时和24小时处理中，塞来昔布的ic50为75μm，并且在48小时的相似ic50明显低于印苦楝内酯。这些结果表明，scne和印苦楝内酯对oscc细胞系具有的细胞毒性作用类似于或略高于标准nsaid。从此数据中，选择20和60μg/ml scne以及10和50μm以进一步了解其作用机制。
106.scne和印苦楝内酯下调炎性介质。为了阐明scne和印苦楝内酯的一种或多种作用机制，用20μg、60μg/ml scne和10mm、50mm印苦楝内酯处理三种oscc细胞系，并分析细胞溶质和核蛋白组分(pmid 27167203)。报告显示，oscc中炎症标志物如nfkb、环氧合酶以及细胞增殖物stat3、akt和erk1/2升高。用scne或印苦楝内酯处理适度地降低cox2水平，对cox1的影响最小(图2)，但在较高剂量的scne和印苦楝内酯下观察到对nfkbp65的适度影响。snce和印苦楝内酯均显示pstat3、pakt和perk1/2的急剧下调。然而，响应于处理未观察到egfr和pegfr的变化。在核酸酶中，scne和印苦楝内酯显示对nfkbp65和perk1/2的更强减
少。响应于scne和印苦楝内酯，也观察到stat3和pstat3减少的相似趋势。这些结果证实了scne和印苦楝内酯在oscc中的抗炎和抗增殖能力。
107.scne和印苦楝内酯抑制体外细胞迁移。体外结果表明，通过下调炎性介质和细胞增殖标志物，对oscc具有较强细胞毒性作用。为了更好地了解scne和印苦楝内酯的抗癌潜力，评估了它们的抗转移作用。利用伤口愈合测定，观察到scne和印苦楝内酯两者均显著减少细胞迁移(图3a
‑
b)。高度移动的细胞系hsc3在8小时内减少了伤口(90％)，然而，scne和印苦楝内酯抑制了这种闭合，闭合率不到10％。在移动性较小的细胞系中，scc4、scne和印苦楝内酯以类似的方式阻止跨伤口的细胞迁移，尽管这在120小时后发生(图3a
‑
b)。cal27细胞的移动性不是非常高，然而与未处理组相比，snce和印苦楝内酯确实抑制了适度细胞迁移。鉴于这些干扰细胞迁移的强大结果，评估了scne和印苦楝内酯对两种金属蛋白酶蛋白mmp2和mmp9的作用。在高度移动的hsc3 oscc细胞系中，snce和印苦楝内酯降低mmp2活性，mmp9略有降低。在scc4细胞系中，通过scne和印苦楝内酯mmp9显著减少，而mmp2几乎没有变化。非移动cal27细胞系通过scne处理具有mmp2活性的适度降低，并且通过用印苦楝内酯处理具有mmp9活性的适度降低。总之，体外结果表明scne和印苦楝内酯通过下调增殖标志物、减少炎症标志物和减少细胞迁移的强抗肿瘤作用。
108.snce和印苦楝内酯抑制小鼠中oscc源性的肿瘤生长。为了证实来自oscc实验的结果，在异种移植小鼠模型中使用了相同的三种细胞系(图4)。将200mg/kg scne掺入饮食中以递送治疗性印度楝树提取物，并且合成ain73a饮食作为对照。在一种细胞系hsc3中，连续5天通过ip注射5mg或20mg印苦楝内酯。与未处理的对照组相比，在终止时scne饮食显著减小scc4肿瘤体积(81％)和cal27(49％)体积(图4a)。scne确实减小hsc3肿瘤体积(49％)，然而，高方差并未产生显著结果。20mg/kg印苦楝内酯处理确实显著减小肿瘤体积(69％)，并且5mg/kg处理显示适度体积减小(40％)(图4b)。体重数据在实验组之间是相当的(数据未示出)。这些数据证实scne和印苦楝内酯在体内具有极大抗肿瘤活性。
109.scne和印苦楝内酯降低异种移植小鼠的血清炎性细胞因子水平。对用于研究scne对循环炎性细胞因子群体的影响的来自上述小鼠的血清进行分析(图8)。提取物强烈降低il
‑
1b、tnfα、ifnγ和il
‑
6血清水平。对于il
‑
1α，在异种移植小鼠中鉴定出的il
‑
1α水平适度降低。对于il
‑
10观察到相似的模式，但是在携带hsc3肿瘤的小鼠中发生了更强的降低。检查了来自这些动物的许多其他细胞因子(图6)，并且与对照相比，总体scne处理产生不同的特征。与肿瘤体积减小结合，数据表明scne可减少肿瘤负担和有害的炎性细胞因子。
110.scne在oscc的4nqo
‑
1小鼠模型中抑制肿瘤生长。为了进一步验证scne的体内抗癌潜力，建立了cba品系中4
‑
nqo
‑
1诱导的舌头oscc模型。在饮用水中施用4nqo
‑
1(50μg/ml)持续8周，然后用普通水代替它持续另外4周。在整个12周研究中，对照组小鼠自由饲喂ain73a饮食，并且处理组给予相同的200mg/kg scne饮食。为了评估饮食的适口性，每两周测量小鼠体重，并且小鼠未显示体重增加的差异(图5a)。在终止时，针对任何发育异常和/或肿瘤检查舌头病理生物学。与对照相比，scne显著减少早期发育异常，并且oscc肿瘤减少66％(图5b)。舌头中增殖标志物的表达水平也通过免疫组织化学来表征，并且发现scne降低pcna、ki
‑
67和c
‑
met蛋白水平(图5c)。
111.scne减少致癌物诱导的oscc小鼠模型中的血清炎性细胞因子。除了这些小鼠的病理生物学以外，还检查了血清循环细胞因子炎性群体。在这些动物中，scne显著降低ifnγ、
il
‑
1β和tnfα水平(图8)。在12周scne饮食消耗后，两种其他细胞因子il
‑
6(30％)和il
‑
1α(25％)水平降低。检查了来自这些动物的许多其他细胞因子(图7)，并且与对照相比，总体scne和印苦楝内酯处理产生不同的特征。这种模式遵循异种移植物动物研究中的类似减少，从而进一步表明scne的抗癌和抗炎作用。
112.讨论
113.scne在oscc中的抗癌作用被证明是通过下调关键肿瘤增殖标志物和减少炎症调节剂来实现的。印度楝树树叶提取物减少伤口闭合，显示出对转移的抑制。异种移植裸鼠显示出oscc肿瘤发生的显著减少和肿瘤生长减少。印度楝树树叶提取物还显著减少4nqo
‑
1小鼠口腔致癌物模型中的肿瘤和舌头发育异常。在两种癌症动物模型中，印度楝树树叶提取物均抑制循环炎性细胞因子。
114.目前，oscc癌症正在增加，并且在临床上，大多数化学疗法属于标准种类，几乎没有二线选择。为了改善这种情况，使用新型剂和联合疗法进行治疗的新途径可克服这一问题。例如，已证明在oscc病例中cox2表达升高，并且有助于放射抵抗。
115.在体内和体外关于oscc的抑制和预防检查了scne的化学预防作用(以其生物医学特性著称)。本文所述的数据显示肿瘤增殖、炎性标志物减少和循环细胞因子的显著减少。由于缺乏oscc一线和二线疗法的临床治疗选择，因此这种提取物可在独立方案中或与标准一线疗法结合用作预防剂，以改善患者结果和/或复发患者的耐药复发性肿瘤。
116.实施例2：印度楝树树叶(印楝)的超临界co2提取物及其生物活性柠檬苦素类化合物、印苦楝内酯通过调节促炎性途径在临床前模型中抑制结肠癌。
117.为了探索印度楝树在crc中的作用，将人结肠癌细胞系hct116和ht29细胞用纯化的超临界印度楝树提取物(scne)或印苦楝内酯处理。scne处理显示对crc细胞增殖的剂量依赖性抑制和细胞凋亡增加。发现scne和印苦楝内酯的处理均显示由于crc细胞中p65的不良核定位、转录因子磷酸化stat3和促炎性细胞因子cox1、cox2、il
‑
6和tnf
‑
α的蛋白表达降低而产生的抗炎作用。蛋白质印迹和酶谱结果显示，在用scne处理后由于crc细胞中mmp2和mmp9蛋白的表达降低而产生的抗侵袭作用。总体而言，这些数据证实scne的潜在抗癌作用，减少人结肠癌细胞中的细胞增殖、炎症、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡。
118.材料和方法
119.细胞系和细胞培养物。人结肠癌细胞系hct116和ht29从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得。这两种细胞系均在mccoy的5a培养基中培养，所述培养基补充有丙酮酸、维生素、氨基酸、抗生素和10％胎牛血清。大鼠结肠正常上皮细胞系iec6从美国典型培养物保藏中心[iec6](crl
‑
1592tm)获得。在含有4mm谷氨酰胺、1.5g/l碳酸氢钠、4.5g/l葡萄糖、0.1单位/ml牛胰岛素和10％胎牛血清的杜尔贝科氏改良的伊格尔氏培养基(dmem)中培养iec6细胞。将培养物在37℃保持在具有5％co2的增湿器孵育箱中。为了确定蛋白质和基因表达的剂量依赖性变化，将细胞用不同浓度的超临界提取物印度楝树提取物scne(nisarga，india)和印苦楝内酯(biovision，usa)或等体积的二甲基亚砜(dmso)作为媒介物进行处理根据需要持续不同的时间段。
[0120]
细胞活力测定。将结肠直肠癌细胞hct116和ht29以及正常大鼠结肠细胞iec
‑
6细胞涂铺在96孔板中，第二天将细胞血清饥饿24小时，并用scne(0
‑
150μg/ml)和印苦楝内酯(1
‑
100μm)处理48小时和72小时。在处理后，根据制造商的说明书，通过mtt[3
‑
(4,5
‑
二甲基
噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑鎓溴化物]测定(sigma aldrich，mo)测量细胞活力。简言之，添加mtt(5mg/ml)，并将板在37℃下孵育4小时，然后将二甲基亚砜添加至每个孔。最后，使用酶标仪(molecular devices,sunnyvale,ca,usa)在540nm波长下读取每个孔的吸光度。结果表示为存活细胞相对于未处理细胞的百分比。
[0121]
迁移划痕测定。使用incucyte zoom系统(essen bioscience,inc.,mi)进行迁移测定，以测量没有或有scne和印苦楝内酯处理的情况下结肠癌细胞的迁移。在每个孔的汇合细胞中创建伤口(10个重复)，并通过在0小时针对未处理的细胞掩蔽伤口边界，在一定时间段内计算细胞的向内生长以测量伤口闭合。
[0122]
蛋白质印迹分析。使hct
‑
116和ht
‑
29细胞在100mm培养皿中生长至汇合。使细胞血清饥饿24小时。第二天，在37℃下将细胞相对于媒介物(dmso)用不同剂量的scne和印苦楝内酯处理48小时。用ripa裂解缓冲液制备全细胞裂解物。核蛋白提取：将未处理和处理的hct
‑
116和ht
‑
29细胞在冰上用低盐裂解缓冲液(10mm hepes，10mm kcl，1mm edta)保持10分钟，然后刮擦并离心。收集团块，并添加50
‑
100μl高盐裂解缓冲液，并且在冰上伴随中等涡旋孵育30分钟。将管离心，并从上清液中收集核蛋白。使用pierce bca蛋白质测定试剂盒(thermo scientific,ma)测定蛋白质浓度。
[0123]
在7.5％、10％和12％sds_page上分离相等量的蛋白质。然后，将蛋白质转移至immun
‑
blot pvdf膜进行蛋白质印迹(bio rad，ca)，并在室温下在含0.1％tween
‑
20(tbst)的tris缓冲盐水中的5％脱脂奶中封闭1小时。将针对cox1(cell signaling technology,ma)、cox2(cell signaling technology,ma)、bcl
‑
2(abcam,ma)、bax1(abcam,ma)、tnf
‑
αcox2(1:500；cell signaling technology,ma)、il
‑
6(cell signaling technology,ma)、细胞周期蛋白d1(cell signaling technology,ma)、p65(abcam,ma)、ikkβ(abcam,ma)、mmp2(abcam,ma)、mmp9(abcam,ma)、pstat3(y705)(cell signaling technology,ma)、拓扑异构酶(abcam,ma)和gapdh(sigma
‑
aldrich,mo)的抗体稀释在5％脱脂奶中。辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔(abcam，ma)抗体用作第二抗体。
[0124]
明胶酶酶谱：在非还原条件下，在0.1％明胶存在下，在10％sds聚丙烯酰胺凝胶中进行明胶酶酶谱分析。在96孔板中生长结肠癌细胞。从每个孔(3x的池)收集200μl培养基，并浓缩至最终体积20μl。将培养基(20μl)与样品缓冲液混合，并负载用于sds
‑
page，无需煮沸。电泳后，将凝胶在含有triton x
‑
100(thermo scientific，ma)的1x酶谱复性缓冲液中于室温下洗涤两次(每次1小时)，以除去sds。然后将凝胶在含有底物(thermo scientific，ma)的1x酶谱显影缓冲液中在37℃下孵育48小时，并用50％甲醇和10％冰醋酸中的0.5％考马斯蓝r250染色60分钟并脱色。在酶复性后，明胶酶消化凝胶中的明胶，并在强烈染色的背景下产生清晰条带。同时运行蛋白质标准品和2％胎牛血清(阳性对照)，并通过绘制已知蛋白质的相对迁移率(25997494)来确定适当的分子量。
[0125]
免疫荧光显微术：将静态人crc细胞在多孔塑料室载玻片中生长，并用scne或印苦楝内酯处理48小时。在研究时间结束时，将细胞用冰冷pbs洗涤两次，并在
‑
20℃下在甲醇中固定5分钟。短暂漂洗后，将细胞用pbs中的0.1％bsa封闭，然后使用间接免疫荧光法用p65染色。alexa fluor 594驴抗兔抗体用作第二抗体(thermo fisher scientific，ma)。将染色的细胞用pbs洗涤，用具有dapi(thermo fisher scientific，ma)的prolong gold抗褪色试剂封固，用盖玻片封固，使用zeiss lsm710共聚焦显微镜(carl zeiss microscopy,llc,
ny)观察并拍照。
[0126]
结果
[0127]
scne和印苦楝内酯抑制人crc细胞的增殖。为了评估scne对人crc细胞的作用，使用mtt测定分析细胞活力。为了研究scne和印苦楝内酯是否对crc细胞具有直接作用，通过mtt测定，在hct
‑
116和ht
‑
29人crc细胞系以及正常啮齿动物结肠细胞系iec
‑
6中测试了由scne和印苦楝内酯引起的增殖抑制。用不同浓度的scne和印苦楝内酯处理hct
‑
116和ht29 48小时和72小时导致细胞活力降低(图9)。正常啮齿动物结肠细胞系生长(iec6)不受scne和印苦楝内酯的影响。这些结果表明scne能够以浓度和时间依赖性方式抑制crc细胞活力。scne和印苦楝内酯的ic
50
分别被确定为<75μg/ml和<10μm。在进一步实验中，将crc细胞用40μg/ml和75μg/ml的scne剂量以及5μm和10μm的印苦楝内酯剂量处理48小时。
[0128]
scne诱导crc细胞的凋亡。认为在致癌过程中抑制细胞凋亡在一些癌症的发展和进展中起核心作用。肿瘤细胞可通过表达抗凋亡蛋白(如bcl
‑
2)或下调促凋亡蛋白(如bax)来获得对细胞凋亡的抗性。为了弄清楚通过scne处理诱导细胞凋亡与其调控蛋白表达之间的关系，研究了细胞凋亡调控蛋白的表达。scne导致hct116和ht29细胞两者中抗凋亡标志物bcl
‑
2蛋白的表达降低和促凋亡标志物bax蛋白的上调(图10a)，这与hct116和ht29细胞中的印苦楝内酯处理相似(图10b)。
[0129]
细胞周期蛋白d1是通过细胞周期的g1期进展所需的蛋白质。细胞周期蛋白d1的过表达已被证明与早期癌症发作和肿瘤进展有关。crc细胞系显示细胞周期d1蛋白的较高表达，在用scne和印苦楝内酯处理48小时后，其表达显著降低(图10)。
[0130]
scne抑制人crc细胞的迁移。然后确定scne和印苦楝内酯的细胞抗增殖和凋亡活性是否可能转化为对细胞迁移的可能抑制，从而预测对侵袭的潜在抑制。为了测试这一点，使用incucyte zoom系统进行迁移测定，以测量没有和有scne和印苦楝内酯处理的情况下crc细胞的迁移。发现scne和印苦楝内酯两者在ht
‑
29人结肠癌细胞中在72小时处理后均以剂量依赖性方式抑制伤口闭合(图11)。
[0131]
scne在crc细胞中具有抗炎活性
–
nf
‑
κb/il
‑
6/stat3表达。nf
‑
κb和stat3调控参与炎症的大量基因的表达。为了确定对crc细胞系hct
‑
116和ht
‑
29的scne和印苦楝内酯处理是否表现出抗炎作用，评估了scne和印苦楝内酯处理对crc细胞系的影响。在此，发现用scne和印苦楝内酯的ic
50
处理hct
‑
116和ht
‑
29细胞48小时导致p65从细胞质向细胞核的易位减少(图12a，12b，12c)以及pstat3蛋白表达的表达降低，从而表明可用的nf
‑
κb和stat3转录因子丢失至细胞核。
[0132]
il
‑
6和tnf
‑
α是促炎性细胞因子，并且在癌症期间高度表达。来自本文所述的实验的结果表明，用scne和印苦楝内酯处理crc细胞系显著降低il
‑
6和tnf
‑
α蛋白的表达(图12d，12e)。
[0133]
cox1在人结肠组织中组成性地表达，而致肿瘤因子(如cox2)一直参与结肠肿瘤发生。结果显示，scne和印苦楝内酯的处理降低crc细胞系中cox1和cox2的蛋白质表达(图12d，12e)。总之，这些数据表明scne和印苦楝内酯对crc细胞系具有抗炎作用。
[0134]
scne抑制人crc细胞的侵袭。mmp参与侵袭、迁移、转移和肿瘤发生。在已鉴定的许多mmp中，明胶酶、尤其是mmp
‑
2(明胶酶a)和mmp
‑
9(明胶酶b)被认为在iv型胶原和明胶的降解中起关键作用，iv型胶原和明胶是ecm的两种主要组分。为了检查金属蛋白酶的作用，对
相对于媒介物用scne和印苦楝内酯处理的hct116和ht29细胞进行明胶酶酶谱分析。hct116和ht29细胞在无血清培养基中展现mmp2的强分泌，在处理48小时后，所述分泌受到scne和印苦楝内酯的抑制(图13a，13b)。培养基中更多的mmp2表达与凝胶中明胶的更多消化直接相关，从而在未处理的细胞中产生清晰的条带。人crc细胞系的蛋白质印迹分析显示，未处理的细胞中mmp2和mmp9的表达较高。用scne和印苦楝内酯处理结肠直肠癌细胞显著降低mmp的表达。
[0135]
讨论
[0136]
鉴于结肠癌所致的高死亡率以及当前化疗方案的显著发病率、明显毒性和较差的应答率，大力推动鉴定具有较低毒性概况的新型治疗方式。现在针对vegf(贝伐单抗)或针对egfr(西妥昔单抗)的靶向疗法通常被用作crc治疗。然而，患者对此类治疗产生耐药性；因此，需要新的策略来替代或补充当前的疗法。饮食改变可导致几种类型的癌症的风险和发生率的广泛差异。此外，长期食用存在于水果和香料中的天然产品具有公认的安全性，有利于其在癌症化学预防中的使用。许多科学家加强了使用安全且无毒的新型植物来源的剂预防肿瘤的方法。已经对大量天然产物作为抗癌剂的潜在用途进行了研究。印度楝树是这样一种具有明显抗癌特性的天然草药，并且是几种柠檬苦素类化合物(limonoid)的来源，柠檬苦素类化合物是一类氧化的三萜烯，被称为四降萜类。这些柠檬苦素类化合物负责印度楝树树叶提取物(nle)的抗肿瘤作用。然而，其抑制结肠直肠癌细胞增殖和转移的潜在机制仍有待阐明。
[0137]
如本文所述，研究了scne是否能够通过调节crc细胞和动物模型中的促炎途径来发挥针对crc的抗癌活性。在不存在或存在各种浓度的scne的情况下，使用mtt测定评估细胞活力。发现scne抑制crc细胞的增殖、迁移并诱导凋亡。因此，在本研究中观察到的scne的抗增殖和抗迁移作用取决于其癌症预防作用。印苦楝内酯导致细胞周期停滞在g1/s期。显然，发现印苦楝内酯降低结肠癌细胞进展通过s期所必需的细胞周期蛋白a水平，从而诱导细胞周期停滞并导致细胞生长受到抑制。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白调控半胱天冬酶3的激活水平。印苦楝内酯处理降低前列腺癌细胞中抗凋亡蛋白(bcl
‑
xl、bcl
‑
2、存活素、半胱天冬酶抑制剂分子)的表达，并增加促凋亡蛋白(细胞色素c、bax、bad、bid、裂解的半胱天冬酶)的表达，这与本文公开的crc细胞中的scne处理的结果相似。与细胞存活和细胞增殖相关的蛋白质的过表达已被证明促成肿瘤发展。与细胞存活和增殖有关的蛋白质表达的下调可有助于结肠癌细胞的生长减少。所观察到的scne的抗增殖和凋亡诱导特性与其他人在白血病和结肠癌中观察到的特性一致。
[0138]
在本研究中，本文描述的结果表明scne能够抑制参与肿瘤侵袭、转移和血管生成的蛋白质(mmp
‑
9，mmp
‑
2)的表达，这进一步支持了scne针对crc的作用。岩藻依聚糖通过抑制pi3k/akt/mtor途径并降低人ht
‑
29结肠癌细胞中mmp
‑
2的表达而抑制细胞生长、迁移和球体形成。厚朴酚显著下调了基质金属蛋白酶
‑
9(mmp9)(一种对肿瘤侵袭至关重要的酶)表达，并且还抑制核因子
‑
kb(nf
‑
kb)转录活性，从而表明其在人乳腺癌中通过经由nf
‑
kb途径抑制mmp
‑
9来抑制肿瘤侵袭的作用。(24226295)。印苦楝内酯抑制crc细胞的增殖、诱导细胞凋亡并抑制nf
‑
κb激活和nf
‑
κb调控的致肿瘤蛋白。肿瘤接种后腹膜内注射的印苦楝内酯显著减小crc异种移植物的体积。经柠檬苦素类化合物处理的异种移植物表现出参与肿瘤细胞存活(bcl
‑
2、bcl
‑
xl、c
‑
iap
‑
1、存活素、mcl
‑
1)、增殖(cmyc、细胞周期蛋白d1)、侵袭(mmp
‑
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476.

技术特征：
1.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)确定需要治疗的受试者；以及(b)向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包含药学上可接受的赋形剂。3.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。4.如权利要求1所述的方法，其中所述药学上可接受的赋形剂选自以下的组：磷酸二钙、蒸馏水、盐水、葡萄糖水溶液、醇(例如乙醇)、表面活性剂、丙二醇、tween
‑
80和聚乙二醇；和油性载体如各种动物油和植物油、白色软石蜡、石蜡、蜡、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、黄糊精、麦芽糊精、白糊精、气雾剂、微晶纤维素、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山梨醇、甜菊苷、玉米糖浆、乳糖、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、l
‑
抗坏血酸、dl
‑
α
‑
生育酚、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、阿拉伯胶、角叉菜胶、酪蛋白、明胶、果胶、琼脂、b族维生素、烟酰胺、泛酸钙、氨基酸、充气或气相二氧化硅、钙盐、色素、调味剂和防腐剂。5.如权利要求1所述的方法，其中所述scne以50mg至1000mg/天范围内的剂量施用。6.如权利要求5所述的方法，其中scne的量是约50mg至1000mg/天。7.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物中存在的印苦楝内酯的量是至少3mg/g，所述组合物中存在的印楝素的量是至少130μg/g印楝素；并且salinin的量是至少200μg/g。8.如权利要求1所述的方法，其中所述scne包含一种或多种柠檬苦素类化合物。9.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种生育酚；和芝麻油。10.如权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种生育酚是α
‑
生育酚、γ
‑
生育酚、维生素e或迷迭香。11.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种生育酚；芝麻油；以及充气或气相二氧化硅。12.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物呈包括胶囊的形式。13.如权利要求1所述的方法，其中口服施用所述组合物。14.如权利要求12所述的方法，其中所述胶囊每天口服施用两次或三次。15.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是原发性或继发性肿瘤。16.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是口腔癌或结肠癌。17.一种减少有需要的受试者的血清中的至少一种炎性细胞因子的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。18.如权利要求17所述的方法，其中scne的量是约50mg至75mg。19.如权利要求17所述的方法，其中所述scne以50mg至1000mg/天范围内的剂量施用。20.如权利要求17所述的方法，其中所述组合物中存在的印苦楝内酯的量是至少3mg/g，所述组合物中存在的印楝素的量是至少130μg/g；并且salinin的量是至少200μg/g。21.如权利要求17所述的方法，其中所述scne包含一种或多种柠檬苦素类化合物。22.如权利要求17所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种生育酚；和芝麻油。23.如权利要求22所述的方法，其中所述一种或多种生育酚是α
‑
生育酚、γ
‑
生育酚、维
生素e或迷迭香。24.如权利要求17所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种生育酚；芝麻油；以及充气或气相二氧化硅。25.如权利要求17所述的方法，其中所述组合物呈包括胶囊的形式。26.如权利要求17所述的方法，其中口服施用所述组合物。27.如权利要求25所述的方法，其中所述胶囊每天口服施用两次或三次。28.如权利要求17所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。29.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者是人。30.如权利要求17所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断患有口腔癌或结肠癌。31.如权利要求17所述的方法，其中所述至少一种炎性细胞因子是ifn
‑
γ、ifn
‑
β、tnf
‑
α、il
‑
6或il
‑
1。32.如权利要求31所述的方法，其中所述至少一种炎性细胞因子是il
‑
6或tnf
‑
α。33.如权利要求17所述的方法，其中在施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物的组合物之前，与参考样品相比，所述受试者的血清具有增加的至少一种炎性细胞因子的水平。34.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括在施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物的组合物之前，测定受试者的一种或多种细胞中的至少一种炎性细胞因子的水平，其中与参考样品相比，至少一种炎性细胞因子的所述水平更高。35.一种减轻有需要的受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。36.如权利要求35所述的方法，其中所述受试者是人。37.如权利要求35所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断患有口腔癌或结肠癌。38.如权利要求35所述的方法，其中通过减少ifn
‑
γ、ifn
‑
β、tnf
‑
α、il
‑
6、il
‑
1、nf
‑
kb、stat3、cox1或cox2中的一者或多者的表达来减轻所述炎症。39.一种治疗有需要的受试者的过度增生性病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包含药学上可接受的赋形剂。41.如权利要求39所述的方法，其中所述受试者是人。42.如权利要求39所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断为需要治疗所述病症。43.如权利要求39所述的方法，其中所述过度增生性病症是癌症。44.如权利要求43所述的方法，其中所述癌症是口腔癌或结肠癌。45.一种抑制有需要的受试者中的nfkb和环氧合酶表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。
46.如权利要求45所述的方法，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。47.如权利要求45所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断为需要抑制nfkb和环氧合酶的表达。48.如权利要求45所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。49.如权利要求45所述的方法，所述方法还包括确定需要治疗细胞增殖失控的病症的受试者的步骤。50.如权利要求49所述的方法，其中所述细胞增殖失控的病症是癌症。51.如权利要求50所述的方法，其中所述癌症是口腔癌。52.一种抑制至少一种细胞中的nfkb和环氧合酶表达的方法，所述方法包括使至少一种细胞与有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)接触的步骤，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。53.如权利要求52所述的方法，所述方法还包含药学上可接受的赋形剂。54.如权利要求52所述的方法，其中所述至少一种细胞是人细胞。55.如权利要求52所述的方法，其中所述接触是通过向受试者施用来进行。56.如权利要求55所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。57.一种改变受试者中的表皮生长因子受体信号(egfr)传导活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。58.如权利要求57所述的方法，所述方法还包含药学上可接受的赋形剂。59.如权利要求57所述的方法，其中所述受试者是人。60.如权利要求57所述的方法，其中所述受试者已被诊断为需要改变efgr信号传导活性。61.如权利要求57所述的方法，其中所述改变是抑制。62.如权利要求57所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。63.如权利要求62所述的方法，所述方法还包括确定需要治疗细胞增殖失控的病症的受试者的步骤。64.如权利要求63所述的方法，其中所述细胞增殖失控的病症是口腔癌。65.一种在有需要的受试者中诱导细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的超临界co2印度楝树提取物(scne)的组合物，其中所述scne包含印苦楝内酯、印楝素和salinin。66.如权利要求65所述的方法，所述方法还包含药学上可接受的赋形剂。67.如权利要求65所述的方法，其中所述受试者是人。68.如权利要求65所述的方法，其中在所述施用步骤之前，所述受试者已被诊断为需要治疗细胞增殖失控的病症。69.如权利要求68所述的方法，所述方法还包括确定需要治疗细胞增殖失控的病症的受试者的步骤。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述细胞增殖失控的病症是癌症。71.如权利要求70所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。72.一种组合物，所述组合物包含如本文所公开的超临界co2印度楝树提取物。
技术总结
本公开涉及治疗受试者的癌症的组合物和方法。所述方法包括向需要治疗的患者施用有效量的超临界CO2印度楝树提取物。印度楝树提取物。


技术研发人员：吉里什
受保护的技术使用者：吉里什
技术研发日：2019.08.30
技术公布日：2021/6/29