改善的抗FLT3抗原结合蛋白的制作方法

改善的抗flt3抗原结合蛋白
发明领域
1.本发明提供了具有改善的flt3结合亲和力和/或抗肿瘤活性的新型人fms相关酪氨酸激酶3(flt3)抗原结合蛋白，例如抗体。本发明的flt3抗体是通过亲本flt3抗体的突变产生的，并在结合测定法中体外测试以及在小鼠肿瘤模型和人类患者肿瘤样品中体内测试。本发明的抗体以单特异性构建体或双特异性flt3xcd3抗体形式提供，并显示出优异的靶亲和力和/或肿瘤细胞杀伤。本发明还涉及用于产生本发明的抗原结合蛋白的方法以及编码它们的核酸、表达它们的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及使用本发明的flt3抗原结合蛋白(abp)治疗或诊断疾病诸如白血病的方法。
2.发明背景
3.从20世纪80年代开始的科学工作已经建立，针对肿瘤相关抗原(taa)和t细胞受体(tcr)/cd3复合物的双特异性抗体能够激活t细胞，从而导致活化的t细胞对表达taa的肿瘤细胞裂解(staerz et al.nature 1985,314:628
‑
631；perez et al.nature 1985,316:354
‑
356；jung et al.proc natl acad sci usa 1986,83:4479
‑
4483)。由于cd3抗体通过其fc部分与fc受体(fcr)结合，在诱导t细胞活化和细胞因子释放方面具有非常高的效率，是有害的副作用，因此极为重要的是构建fc消减或减弱的双特异性taaxcd3抗体以防止fcr结合并允许靶细胞限制性而不是fcr介导的t细胞活化(jung et al.immunol today 1988；9:257
‑
260；jung et al.eur j immunol 1991；21:2431
‑
2435)。
4.满足产业质量和数量中的此种关键前提的双特异性抗体的生产仍然是一个艰巨的挑战。最近，一种具有cd19xcd3特异性的重组双特异性单链(bssc)抗体，称为blinatumomab，在治疗all患者方面已显示出相当高的效率(bargou et al.science 2008,321:974
‑
977)，并在fda的突破性标志下获得了批准。值得注意的是，该药物由于其低的血清半衰期和相当高的毒性以连续24小时连续输注在数周内应用：安全性可应用剂量是每位患者每天30μg，这比用于使用已建立的单特异性抗肿瘤抗体的治疗的安全性可应用剂量低10.000倍(adams and weiner.nat biotechnol 2005,23:1147
‑
57)。所得药物的血清浓度低于1ng/ml(topp et al.j clin oncol 2011；29:2493
‑
2498)。这种严重的剂量限制，也是在较早的临床试验中使用不同的双特异性抗体观察到(kroesen et al.br j cancer 1994；70:652
‑
661；tibben et al.int j cancer 1996；66:477
‑
483)，是由于脱靶t细胞活化，导致系统性细胞因子释放。显然，这种现象阻止刺激tcr/cd3复合物的双特异性抗体的最佳治疗活性。
5.原则上，剂量限制性脱靶性t细胞活化及产生的毒性问题可能是由两种不同的机制引起的。t细胞活化(当时)不是靶细胞限制性的，也就是说，即使双特异性抗体构建体中的单价cd3效应器结合位点也能够在不存在抗体以其靶向部分结合的靶细胞的情况下诱导某些t细胞活化。从严格意义上讲，这代表脱靶活化，因为不需要携带靶抗原的细胞诱导这种现象。我们已经注意到，若使用不同形式的不同cd3抗体，并且若添加为t细胞活化提供共刺激的某些刺激性旁观者细胞(sbc)，例如淋巴瘤细胞(skw6.4)或内皮细胞(huvec)，则该现象会发生相当大变化。因此，应当选择诱导最小的“脱靶”t细胞活化的cd3部分来构建双
特异性抗体。
6.由于与正常的表达taa的细胞结合，双特异性抗体靶向的taa并非完全是肿瘤特异性的，导致抗体介导的t细胞活化。从严格意义上讲，这不是脱靶活化，因为它是由表达抗原的靶细胞(尽管是“错误的”)，即正常细胞而非恶性细胞诱导的。上面提到的双特异性cd19xcd3抗体blinatumomab当然遇到此问题，因为其靶抗原cd19在正常b淋巴细胞上表达。显然，恶性组织的靶向抗原的特异性对于防止此种脱靶t细胞活化至关重要。fms样酪氨酸激酶3(flt3)是一种造血iii类受体酪氨酸激酶蛋白，其与其他iii类家族成员共享同源性，包括干细胞因子受体(c
‑
kit)，巨噬细胞集落刺激因子受体(fms)和血小板衍生生长因子受体(pdgfr)。与flt3配体结合后，flt3受体进行同二聚化，从而使近膜域中特定酪氨酸残基发生自磷酸化，并通过pi3k akt，mapk和stat5途径进行下游激活。因此，flt3在控制正常造血细胞的增殖，存活和分化中作为信号传导成分起着至关重要的作用。
7.人flt3在cd34 cd38
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造血干细胞(hsc)以及树突状前体细胞的子集中表达。还可以在多能祖细胞，如cd34 cd38 cd45ra
‑
cd123
|0w
共同髓样祖细胞(cmp)，cd34 cd38 cd45ra cd123
|0w
粒细胞单核细胞祖细胞(gmp)和cd34 cd38 cd10 cd19
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共同淋巴样祖细胞(clp)中检测到flt3表达。令人感兴趣的是，在cd34 cd38
‑
cd45ra
‑
cd123
‑
巨核细胞红细胞祖细胞(mep)中几乎不存在flt3表达。因此，flt3表达主要局限于早期的髓样和淋巴样祖细胞，而在更成熟的单核细胞谱系细胞中有一些表达。在急性髓样性白血病(aml)和急性淋巴细胞性白血病(all)中，flt3的表达水平很高。flt3还在原始细胞危象中但非慢性阶段的慢性髓样白血病(cml)中表达。总体而言，flt3在约98％前b all患者和约90％aml患者中表达。
8.15％至34％的aml患者显示出flt3/itd突变，儿童中频率较低，老年人中频率较高。具有flt3/itd突变的成年和小儿aml患者的预后都很差(rombouts wj,blokland i,b,ploemacher releukemia.2000apr；14(4):675
‑
83.)，因此flt3是有希望的用于aml，而且还用于all疗法的靶标。突变的flt3是组成性激活的，并且flt3通过包括ras/map激酶，stat5和pi3激酶/akt的途径传导信号，从而促成凋亡和分化和刺激增殖的阻断。flt3可以通过抗体方法被靶向以治疗aml和all两者。已经开发了结合flt3并抑制fl与受体结合的抗体。在一项i期研究中，对复发的aml患者评估了imclone抗体imc
‑
eb10，但是由于缺乏疗效而终止了该研究(clinicaltrials.gov identifier:nct00887926)。因此，存在评估第二代单克隆抗体，包括用于治疗aml的双特异性抗体的迫切需要。
9.除了由真正的单体cd3刺激诱导的t细胞活化外，最近的论文还提出了一种脱靶活化的替代机制，其涉及双特异性抗体的靶向部分；若该部分由诱导双特异性抗体的效应器部分在t细胞表面上聚簇的单链片段组成，则可能诱导强信号传导，从而导致t细胞耗竭(long et al.nat med 2015；6:581)，其通过常规的短期体外测定法几乎无法检测，但严重影响体内效率。使用用嵌合抗原受体转染的t细胞(car t细胞)已经获得了这些观察结果。嵌合t细胞受体包含单链抗体作为靶向部分。高度可能的是，long等人(2015)的结果同样适用于具有此类靶向部分的双特异性抗体，因为这些试剂一旦结合到t细胞上，在功能上等同于用相应的car转染的t细胞。在本领域中公知，大多数单链抗体具有形成多聚体和聚集体的趋势(worn et al.j mol biol 2001,305:989
‑
1010)，因此long等人(2015)测试的1个除外的所有car显示聚簇的现象和强cd3信号传导，尽管程度可变(long et al.2015)。本文概述的问题需要一种双特异性形式，其防止通过靶向部分进行的多聚化和聚簇。
10.大多数双特异性形式由于分子量降低和缺乏ch3域而具有非常低的血清半衰期(1
‑
3小时)。因此，原型blinatumomab抗体通过在几周内连续24小时静脉内输注应用。由于由二价c端cd3结合部分诱导的脱靶活化可能增加，认为使用具有延长的血清半衰期的基于完整igg的形式，如图1中描绘的iggsc的使用是不合适的。
11.基于上文，本领域中需要靶向flt3的改善的abp，其解决以上概述的至少一个问题。
12.发明概述
13.通常，通过简要描述，可以如下描述本发明的主要方面：
14.在第一方面，本发明涉及一种能够结合人fms相关酪氨酸激酶3(flt3)的抗原结合蛋白(abp)，其包含：
15.(i)一个，优选两个重链可变域，其包含seq id no:01(sywmh)所示的cdrh1区，seq id no:02(eidpsdsykdynqkfkd)所示的cdrh2区(eidpsdsykdynqkfkd)和seq id no:03(aitttpfdf)所示的cdrh3区，或者其中在每种情况下，cdrh1、cdrh2和/或cdrh3独立地包含分别与seq id no:01，seq id no:02或seq id no:03相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的序列；和
16.(ii)一个，优选两个轻链可变域，其包含seq id no:05(rasqsisnnlh)所示的cdrl1区，seq id no:06(yasqsis)所示的cdrl2区和seq id no:07(qqsntwpyt)所示的cdrl3区，或者其中在每种情况下，cdrl1、cdrl2和/或cdrl3独立地包含分别与seq id no:05，seq id no:06或seq id no:07相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的序列
17.其特征在于，所述一个，优选两个重链可变域和所述一个，优选两个轻链可变域各自包含具有人抗体共有框架序列的至少部分的抗体框架区。
18.在第二方面，本发明涉及一种抗原结合蛋白(abp)或其抗原结合片段，其能够结合fms相关的酪氨酸激酶3(flt3)，并且能够竞争第一方面的abp与flt3的结合。
19.在第三方面，本发明涉及双特异性抗原结合蛋白(abp)，其包含能够结合人fms样酪氨酸激酶3(flt3)抗原的第一抗原结合域和能够结合人分化簇3(cd3)抗原的第二抗原结合域，其中所述双特异性abp：
20.a.根据通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞术分析所述双特异性abp与flt3阳性细胞的结合测定，以低于10nm的ec
50
结合flt3；和
21.b.根据通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞仪分析所述双特异性abp与cd3阳性细胞的结合测定，以低于200nm的ec
50
结合cd3。
22.在第四方面，本发明涉及一种分离的核酸，其包含编码第一或第二方面的abp或abp的抗原结合片段或单体如重链或轻链的序列，或编码根据第三方面的双特异性abp的序列。
23.在第五方面，本发明涉及一种核酸构建体(nac)，其包含第四方面的核酸和一个或多个其他序列特征，其允许在细胞中表达所编码的抗原结合蛋白(abp)或双特异性abp或所述abp或双特异性abp的组分(例如抗体重链或轻链)。
24.在第六方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含第四方面的核酸或根据第二方面的核酸构建体(nac)。
25.在第七方面，本发明涉及药物组合物，其包含：(i)第一至第三方面的抗原结合蛋白(abp)或双特异性abp，或(ii)第四方面的核酸或根据第五方面的nac，或(iii)根据第六方面的重组宿主细胞，以及药学上可接受的载体，稳定剂和/或赋形剂。
26.在第八方面，本发明涉及一种在医学中使用的组分，其中所述组分选自：(i)第一至第三方面的抗原结合蛋白(abp)或双特异性abp，或(ii)第四方面的核酸或根据第五方面的nac，或(iii)根据第六方面的重组宿主细胞和根据第七方面的药物组合物。
27.在第九方面，本发明涉及增强对表达人flt3的人细胞的细胞介导的免疫应答的方法，其包括在免疫细胞，例如t细胞或自然杀伤(nk)细胞的存在下使所述细胞与以下接触：第一或第二方面的抗原结合蛋白(abp)，或根据第三方面的双特异性abp或根据第四方面的编码所述abp或双特异性abp的核酸，从而增强针对所述人细胞的细胞介导的免疫反应。
28.在第十方面，本发明涉及一种用于预防和/或治疗受试者中的增殖性疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的第八方面中所述的组分；并且其中所述增殖性疾病的特征在于与所述增殖性病症相关的细胞中flt3的表达。
29.发明详述
30.在下文中，将描述本发明的要素。这些元素与特定方案一起列出，但是，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建附加的实施方案。各种描述的示例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将两个或更多个明确描述的实施方案组合或将一个或多个明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选元件组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应当认为本申请的描述中公开了本申请中所有描述的元素的任何排列和组合。
31.在第一方面，本发明涉及本发明，其提供一种能够结合人fms相关酪氨酸激酶3(flt3)的抗原结合蛋白(abp)，其包含：(i)重链可变域，其包含seq id no:01(sywmh)所示的cdrh1区，seq id no:02(eidpsdsykdynqkfkd)所示的cdrh2区和seq id no:03(aitttpfdf)所示的cdrh3区，或在每种情况下cdrh1，cdrh2和/或cdrh3分别独立包含序列，其分别与seq id no:01，seq id no:02或seq id no:03相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代，缺失或插入；或包含与seq id no:01，seq id no:02或seq id no:03具有至少75％序列同一性或至少80％，优选90％序列同一性的cdrh1，cdrh2或cdrh3序列；或(ii)轻链可变域，其包含seq id no:05(rasqsisnnlh)所示的cdrl1区，seq id no:06(yasqsis)所示的cdrl2区和seq id no:seq id no:07(qqsntwpyt)所示的cdrl3区或其中在每种情况下cdrl1，cdrl2和/或cdrl3独立包含序列，其分别与seq id no:05，seq id no:06或seq id no:07具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代，缺失或插入；或包含与seq id no:05，seq id no:06或seq id no:07具有至少75％的序列同一性或至少80％的序列同一性的cdrl1，cdrl2或cdrl3序列，其特征在于所述重链可变区和所述轻链可变区各自包含人可变区框架序列。优选地，所述重链可变域和所述轻链可变域各自包含具有人抗体共有框架序列的至少部分的抗体框架区。
32.本发明还提供了衍生自抗flt3抗体4g8(在wo 2011/076922中完全公开的小鼠抗flt3抗体)的人源化形式的新颖且高度亲和且有效的抗体构建体，其已在本文中第一次通过cdr嫁接而人源化，意味着将鼠抗体4g8的cdr区插入人抗体的重链和轻链的框架区中。然而，然后将人源化4g8抗体进行形式，恒定区和可变区的广泛改变以获得本发明的abp。原则
immunological interest,us dept of health and human services限定的高变区或抗体的三维结构中的高变环(chothia and lesk,1987；j mol biol 196:901)。每条链中的cdr都被框架区紧密保持，并且与另一条链中的cdr一起有助于抗原结合位点的形成。在cdr内，有已被描述为选择性决定区(sdr)的选定的氨基酸，它们代表cdr在抗体
‑
抗原相互作用中使用的关键接触残基。(kashmiri,2005；methods 36:25)。
35.术语“抗体”通常是指基于免疫球蛋白的蛋白质性结合分子。此类抗体的典型例子是保留结合特异性的免疫球蛋白的衍生物或功能片段。产生抗体和抗体片段的技术是本领域公知的。术语“抗体”还包括不同类别(即iga，igg，igm，igd和ige)和亚类(例如igg1，igg2等)的免疫球蛋白(ig)。同样如上所述，抗体衍生物或分子的示例性实例包括fab片段，f(ab')2，fv片段，单链fv片段(scfv)，双抗体或域抗体(holt lj et al.,trends biotechnol.21(11),2003,484
‑
490)。因此，术语“抗体”的定义也包括诸如嵌合，单链和人源化抗体的实施方案。
36.如本文所用，“abp”可带有一个或多个域，所述域具有与免疫球蛋白m，免疫球蛋白g，免疫球蛋白a，免疫球蛋白d或免疫球蛋白e的相应的天然存在的域具有至少约60％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约92％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％的序列同一性的序列。就此而言，如本文所用的术语“约”或“大约”是指在20％的偏差内，例如在10％的偏差或给定值或范围的5％内。
37.如本发明中使用的“序列同一性百分比(％)”是指在将本发明的多肽的序列与所讨论的序列进行同源比对之后，成对相同残基相对于这两个序列中较长者的残基数的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分数的目的，比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如，使用诸如blast，align或megalign(dnastar)软件的公开可用的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。对于本文公开的核苷酸序列也是如此。
38.当在本文中使用时，“免疫球蛋白”通常是四聚体糖基化蛋白，其由两条各自约25kda的轻(l)链和两条各自约50kda的重(h)链组成。在免疫球蛋白中可以发现两种类型的轻链，称为lambda和kappa。根据重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五大类：a，d，e，g和m，并且这些中的几种可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。igm免疫球蛋白由5个基本异四聚体单元以及称为j链的其他多肽组成，并且含有10个抗原结合位点，而iga免疫球蛋白含有2
‑
5个基本4链单元，它们可以聚合与j链组合形成多价装配体(assemblages)。在igg的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。
39.在igg类免疫球蛋白中，重链中有几个免疫球蛋白域。本文的“免疫球蛋白(ig)域”是指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。在igg抗体的上下文中，igg同种型分别具有三个ch区：根据kabat等人中的eu索引，“ch1”是指位置118
‑
220，“ch2”是指位置237
‑
340，并且“ch3”是指位置341
‑
447。本文中的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”或“h”是指在抗体的第一和第二恒定域之间包含氨基酸的柔性多肽。在结构上，igg ch1域在eu位置220处终止，并且igg ch2域在eu位置残基237处开始。因此，对于igg，此处的铰链定义为包括位置221(igg1中的d221)至236(igg1中的g236)，其中编号是根据kabat等人的eu索引。如本文所定义的恒定重链是指ch1域的n末端至ch3域的c末端，因此包含位置118
‑
447，其中编号根据eu索引。
40.术语“可变的”是指免疫球蛋白域的在其序列中表现出可变性并参与确定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即“可变域”)。变异性在抗体的可变域中分布不均；它集中在每个重链和轻链可变区的亚域中。这些亚域称为“高变区”，“hvr”或“hv”或“互补决定区”(cdr)。可变域的更保守的(即，非高变的)部分称为“框架”区(fr)。天然存在的重链和轻链的可变域各自包括四个主要采用β
‑
折叠构型的fr区，所述fr区由三个高变区连接，所述高变区形成连接β
‑
折叠结构并在某些情况下形成β
‑
折叠结构的部分的环。每条链中的高变区通过fr紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，有助于抗原结合位点的形成(参见kabat等人，见下文)。通常，天然存在的免疫球蛋白包括六个cdr(见下文)；vh中的三个(cdrh1，cdrh2，cdrh3)，vl中的三个(cdrl1，cdrl2，cdrl3)。在天然存在的免疫球蛋白中，cdrh3和cdrl3显示六个cdr的最广泛的多样性，尤其是cdrh3被认为在对免疫球蛋白赋予优良的特异性方面起着独特的作用。恒定域不直接参与抗原结合，但是表现出多种效应器功能，诸如例如抗体依赖性，细胞介导的细胞毒性和补体激活。
41.术语“vh”(也称为vh)和“vl”(也称为vl)在本文中分别用于指免疫球蛋白的重链可变域和轻链可变域。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区中断的“框架”区组成。因此，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基。在免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链cdr(或cdr区)。因此，如本文所用的“cdr”是指所有三个重链cdr(cdrh1，cdrh2和cdrh3)，或所有三个轻链cdr(cdrl1，cdrl2和cdrl3)，或所有重链和所有轻链cdr两者(若合适的话)。三个cdr组成轻链可变区的结合特征，而三个cdr组成重链可变区的结合特征。cdr确定免疫球蛋白分子的抗原特异性，并被包含支架或框架区的氨基酸序列分隔。确切的定义性cdr边界和长度受制于不同的分类和编号系统。抗体的结构和蛋白质折叠可能意味着其他残基被认为是抗原结合区的一部分，并且本领域技术人员应理解为如此。cdr为免疫球蛋白与抗原或表位的结合提供了大多数接触残基。
42.cdr3通常是抗体结合位点内分子多样性的最大来源。例如，h3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域公知的。有关抗体结构的综述，参见antibodies:alaboratory manual,cold spring harbor laboratory,eds.harlow et al.,1988。本领域技术人员将认识到，每个亚基结构(例如ch，vh，cl，vl，cdr，fr结构)均包含活性片段，例如vh，vl，或cdr亚基的部分结合抗原，即抗原结合片段，或例如ch亚基结合和/或激活例如fc受体和/或补体的部分。cdr通常是指kabat cdr，如记载于sequences of proteins of immunological interest,us department of health and human services(1991),kabat等编。表征抗原结合位点的另一标准是指如chothia所述的高变环。参见例如chothia,et al.(1992；j.moi.biol.227:799
‑
817；and tomlinson et al.(1995)embo j.14:4628
‑
4638。再一个标准是oxford molecular的abm建模软件使用的abm定义。通常，例如参见protein sequence and structure analysis of antibody variable domains.in:antibody engineering lab manual(ed.:duebel,s.and kontermann,r.,springer
‑
verlag,heidelberg)。或者，关于chothia超变环或abm定义的环使用类似的描述关系来实现关于kabat cdr描述的实施方案。
43.相应的免疫球蛋白mu重链，gamma重链，alpha重链，delta重链，epsilon重链，lambda轻链或kappa轻链可以属于任何物种，例如哺乳动物物种，包括啮齿动物物种，两栖
动物，例如滑体亚纲(lissamphibia)亚类，包括例如蛙，蟾蜍，火蜥蜴(salamanders)或蝾螈(newts)或无脊椎动物。哺乳动物的例子包括但不限于，大鼠，小鼠，兔子，豚鼠，松鼠，仓鼠，刺猬，鸭嘴兽，美洲鼠兔，犰狳，狗，狐猴，山羊，猪，牛，负鼠，马，蝙蝠，土拨鼠，猩猩，恒河猴，绒毛猴，猕猴，黑猩猩，绢毛猴(saguinusoedipus)，狨猴或人。
44.如本文所述，免疫球蛋白通常是包括通过二硫键连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链具有重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包括三个域，ch1，ch2和ch3。每条轻链具有轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个域cl。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(fr)。cdr包含负责抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基。每个vh和vl具有三个cdr和四个fr，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原表位相互作用的结合域。
[0045]“框架区”或“fr”残基是除高变区以外的那些可变域残基。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内相对保守。因此，“人框架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的框架区基本相同(约85％或更多，通常90
‑
95％或更多)的框架区。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于定位和对齐cdr。cdr主要负责与抗原表位的结合。
[0046]
术语“fab”，“fab区”，“fab部分”或“fab片段”应理解为定义包括vh，ch1，vl和cl免疫球蛋白域的多肽。fab可指分离的该区域，或在abp的背景下的该区域，以及全长免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。通常，fab区包含抗体的整个轻链。可以采用fab区来定义免疫球蛋白分子的“臂”。它包含该ig的表位结合部分。天然存在的免疫球蛋白的fab区可以通过木瓜蛋白酶消化获得为蛋白水解片段。“f(ab’)2部分”是胃蛋白酶消化的免疫球蛋白的蛋白水解片段。“fab’部分”是通过还原f(ab’)2部分的二硫键而产生的产物。如本文所用，术语“fab”，“fab区”，“fab部分”或“fab片段”可以进一步包括限定抗体臂的c端末端的铰链区。该铰链区对应于全长免疫球蛋白中ch1域c端发现的铰链区，此处可以用abp的臂来定义y。在本领域中使用术语铰链区，因为免疫球蛋白在该区域具有一定的灵活性。如本文所用的“fab重链”应理解为包含vh和ch1的fab片段的部分或多肽，而如本文所用的“fab轻链”应理解为fab片段的包含vl和cl的那部分或多肽。
[0047]
术语“fc区”或“fc片段”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的c端区域，包括天然序列fc区和变体fc区。fc部分介导抗体的效应器功能，例如补体系统的活化和带有fc受体的免疫效应细胞(例如nk细胞)的活化。在人igg分子中，fc区是通过木瓜蛋白酶在cys226的n端切割而产生的。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可以变化，但是通常将人igg重链的fc区定义为从cys226位置的氨基酸残基或从pro230延伸至其羧基末端。可以除去fc区的c端赖氨酸(根据eu编号系统的残基447)，例如在abp的生产或纯化过程中，或通过重组工程化改造编码abp重链的核酸。天然序列fc区包括哺乳动物，例如人或鼠，igg1，igg2(igg2a，igg2b)，igg3和igg4。fc区包含两个或三个恒定域，这取决于抗体的种类。在免疫球蛋白是igg的实施方案中，fc区具有ch2和ch3域。
[0048]
术语“单链可变片段”(scfv)在本文中用于定义抗体片段，其中免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区通过10至约25个氨基酸的短接头肽融合在一起。对于柔性，接头通常富含甘氨酸，以及对于溶解度，富含丝氨酸或苏氨酸，并且可以将vh的n端与vl的c端相
连，或将vl的n端与vh的c端相连。scfv片段保留特定的抗原结合位点，但缺少免疫球蛋白恒定域。
[0049]
术语“表位”，也称为“抗原决定簇”，是指抗原中与抗体或t细胞受体特异性结合从而形成复合物的部分。因此，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体的任何分子或蛋白质决定簇。本文所述的abp的结合位点(互补位)可以与构象或连续表位特异性结合/相互作用，所述构象或连续表位对于靶结构是多肽的。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在一些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸，糖侧链，磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。关于多肽抗原，构象或不连续的表位的特征在于存在两个或更多个在一级序列中分离的离散的氨基酸残基，但是当多肽折叠成天然蛋白/抗原时在分子表面上组装成一致的结构(seia,m.,science(1969)166,1365
‑
1374；laver,w.g.,et al.cell(1990)61,553
‑
556)。促成表位的两个或多个离散氨基酸残基可存在于一个或多个多肽链的分开的部分上。当多肽链折叠成三维结构以构成表位时，这些残基在分子表面上聚集在一起。相反，连续或线性表位由两个或更多个离散氨基酸残基组成，其存在于多肽链的单个线性片段中。
[0050]
在本背景中，术语“特异性”或“特异性结合”，也称为“定向于”，是指根据本发明，抗体或免疫受体片段能够与特定抗原或配体或一组特定抗原或配体特异性相互作用和/或结合，但基本上不与其他抗原或配体结合。这种结合可以通过“锁和钥匙原理”的特异性来举例说明。若抗体交叉竞争，从而在给定的时间点只有一种抗体可以与表位结合，即一种抗体阻止了另一种抗体的结合或调节作用，则抗体被称为“结合同一表位”。
[0051]
如本文所用，术语“分离的abp”是指已经从其天然环境的组分中鉴定，分离和/或回收的abp。其自然环境中的污染物成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶，激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，如通过lowry方法测定的，将abp纯化至大于95重量％的抗体，例如大于99重量％。在一些实施方案中，使用考马斯亮蓝或优选银染色，在还原或非还原条件下，将抗体纯化至同质，如通过sds
‑
page判断的。在一些实施方案中，分离的abp可以存在于重组细胞内，而抗体天然环境的一种或多种组分不存在。通常，通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
[0052]
如本文所述的结合flt3和/或表达flt3的癌细胞的本发明的(重组)abp可以以任何合适的重组抗体形式使用，例如作为fv片段，scfv，缺乏铰链区的单价抗体，微抗体，fab片段，fab
′
片段，f(ab
′
)2片段。本发明的重组abp还可以包含恒定域(区)，例如人igg恒定区，ch1域(如fab片段那样)和/或整个fc区。或者，本发明的abp也可以是全长(整个)抗体，优选为双特异性形式。
[0053]
存在有抗体介导细胞效应的多种可能的机制，包括通过阻断所需的生长途径进行抗增殖，导致凋亡的细胞内信号传导，增强的受体下调和/或周转，补体依赖性细胞毒性(cdc)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和促进适应性免疫应答(cragg et al,1999,curropinimmunol 11 541
‑
547,glennie et al,2000,immunoltoday 21403
‑
410)。抗体功效可归因于这些机制的结合，并且它们在肿瘤学临床治疗中的相对重要性似乎是癌症依赖性的。
[0054]
fcγr介导的效应器功能对某些抗体活性的重要性已在小鼠中得到证实(clynes et al,1998,procnatlacadsci u s a 95 652
‑
656,clynes et al,2000,nat med 6 443
‑
446)，以及从观察到的对人类的临床疗效与其高(v158)或低(f158)亲和力多态形式的fcγriiia的同种异型之间的相关性得到证实(cartron et al,2002,blood 99 754
‑
758,weng&levy,2003,journal of clinical oncology,213940
‑
3947)。这些数据共同表明，针对与某些fcγrs结合而优化的抗体可以更好地介导效应器功能，从而在患者中更有效地破坏靶细胞。因此，增强抗体抗肿瘤潜能的一种有前途的手段是通过增强其介导细胞毒性效应功能(如adcc，adcp和cdc)的能力。此外，抗体可以通过可当抗体与肿瘤细胞上的其靶标结合时发生的生长抑制或凋亡信号转导介导抗肿瘤机制。当抗体通过fcγr呈现到与免疫细胞结合的肿瘤细胞时，可以增强此类信号传导。因此，抗体对fcγr的亲和力增加可导致抗增殖作用增强。
[0055]
在修饰抗体时，通过选择性增强与fcγr的结合来提供增强的效应器功能，已经取得了一些成功。使用氨基酸修饰已经实现了用于优化的效应器功能的抗体工程(参见例如美国专利申请us 2004
‑
0132101或美国专利申请2006
‑
0024298。
[0056]
本发明的abp能够结合人flt3。术语“fms相关的酪氨酸激酶3”或“flt
3”在本文可互换使用，并且包括人flt3的变体，同等型和物种同源物。人flt3蛋白的uniprot登录号为p36888(2018年9月9日版本)。人类flt3的基因位于13号染色体上，并具有hgnc：3765的hgnc登录名(www.genenames.org
–
hgnc version of september 9,2018)。人flt 3也以cd135，flk2，stk1的名称而为人所知。但是，在某些优选的情况下，本发明的抗体可以不与来自人类以外物种的flt3交叉反应。
[0057]
为了确定表位，可以使用本领域已知的标准表位作图方法。例如，结合抗体的flt3的片段(肽)(例如合成肽)可用于确定候选抗体或其抗原结合片段是否结合相同的表位。对于线性表位，合成了限定长度(例如8个或更多个氨基酸)的重叠肽。肽可以偏移1个氨基酸，从而制备覆盖flt3蛋白序列的每8个氨基酸片段的一系列肽。可以通过使用较大的偏移量(例如2个或3个氨基酸)来制备较少的肽。另外，可以合成更长的肽(例如9聚体，10聚体或11聚体)。可以使用标准方法来确定肽与抗体或抗原结合片段的结合，包括表面等离振子共振(biacore)和elisa测定法。为了检查构象表位，可以使用较大的flt3片段。使用质谱法定义构象表位的其他方法已经进行了描述并且可以是(参见例如baerga
‑
ortiz et al.,protein science 11:1300
‑
1308,2002和其中引用的参考文献)。标准实验室参考工作中提供了其他确定表位的方法，例如current protocols in immunology,coligan et al.编,john wiley&sons的第6.8单元(“b细胞表位的噬菌体展示选择和分析”)和第9.8单元(“使用合成肽组合文库鉴定抗原决定簇”)。可以通过将点突变或缺失引入已知表位中，然后测试与一种或多种抗体或抗原结合片段的结合，以确定哪些突变降低抗体或抗原结合片段的结合来确定表位。
[0058]
在一些优选的实施方案中，本发明的abp在其第一抗原结合域中包含重链可变区，该重链可变区包含等位基因ighv1
‑
46，优选ighv1
‑
46*3的人框架区。在轻链内，本发明的abp包含具有igkv3d
‑
15*01框架的可变区。在一些实施方案中，本发明的抗体是完全移植的人源化抗体，其表示为v0
‑
v6，并且包含分别为seq id no:76和77的重链和轻链可变域序列。然而，本发明的一个成就是提供人源化抗flt3抗体的突变变体，其具有改善的结合亲和
力，亲合力和/或t细胞的募集和活化以及t细胞介导的抗肿瘤细胞毒性的活性。因此，根据本发明，优选地，本发明的abp在flt3特异性第一抗原结合域中，abp包含重链可变区，所述重链可变区在选自16,18,19,20,22,48,57,60,69,70,75,76,78,80,81,87和108的一个或多个位置处具有突变，根据kabat编号。最优选地，突变是k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,m48i,k57t,n60a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a和t108l中的任何一个或任何组合或全部，根据kabat编号。另外，本发明的abp还可在其flt3特异性第一抗原结合域中包含具有选自49、87和55，优选y49k，i55a和y87f的一个或多个突变的可变轻链序列，其中编号根据kabat系统。在一些实施方案中，本发明的abp在其第一抗原结合域中可包括重链可变序列突变，并且优选作为唯一突变，包括k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,k57t,n60a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a和t108l，以及轻链可变序列突变i55a，或在可变轻链区域中没有突变。或本发明的abp可以包括k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a,t108l，优选作为唯一突变，而在轻链可变序列中没有突变。另一个例子涉及abp，其在抗flt3结合域重链可变序列中不包含突变，并且在相应的轻链可变序列中包含i55a突变。进一步优选的是本发明的abp，其在抗flt3第一抗原结合域中包含在位置48处具有突变，优选48i的重链可变序列，并且在相应的轻链可变序列中具有突变49k和87f。根据kabat系统编号。
[0059]
本发明的另一个实施方案涉及abp，所述abp在其针对flt3的第一抗原结合域中包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，其中所述重链可变区包含氨基酸序列，其与选自seq id no:15、17、19、21、23或76的氨基酸序列具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％，优选100％的序列同一性，或者在每种情况下独立地，任选地与这些序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失；和/或其中轻链可变区包含氨基酸序列，其与选自seq id no:16、18、20、22、24或77的氨基酸序列具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％，优选100％的序列同一性的氨基酸序列，或在每种情况下独立地，任选地与这些序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4，优选地，不超过3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。其中此类氨基酸取代优选是保守取代。最优选地，这些abp中的轻链和重链在根据下表1中本文公开的抗体配对的这些abp中。另外，根据本发明的优选的abp在重链可变区中包括如seq id no:15,17,19,21或23的任一项中提供的氨基酸位置16,18,19,20,22,48,57,60,69,70,75,76,78,80,81,87和108；和/或在轻链可变区中包含如seq id no:16,18,20,22或24的任一项中提供的氨基酸位置49、55和87；其中编号根据kabat系统。
[0060]
在本发明的一些实施方案中，abp的重链可变区包含与seq id no:21所示的氨基酸序列具有至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与seq id no:22所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0061]
在本发明的一些实施方案中，abp的重链可变区包含与seq id no:76所示的氨基酸序列具有至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且轻链可变区包含与seq id no:77所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
[0062]
在本发明的一些特定实施方案中，优选abp，其中重链可变区包括48i，并且其中轻链可变区包括87f，其中编号根据kabat系统。甚至更优选本发明的abp，其中轻链可变区还包含49k，其中编号根据kabat系统。
[0063]
如本文解释，本发明的abp优选为双特异性分子，其中所述第二抗原结合域结合cd3，优选其中所述第二抗原结合域与第一抗体结合域的重链融合。优选地，第二抗原结合域包含scfv片段，该scfv片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与seq id no:14、25、26和27的序列比较具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％，优选100％的氨基酸同一性，或在每种情况下独立地具有不超过10、9、8、7、6、5、4，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失。
[0064]
在一些实施方案中，根据本发明的abp可以是包含至少一个抗体重链和/或包含至少一个抗体轻链的abp，所述抗体重链与seq id no:28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74和78具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％，优选100％序列同一性或者具有不超过20、15、10、9、8、7、6、4、优选3或2个，优选不超过1个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列，所述抗体轻链与seq id no:29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75和79具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％，优选100％序列同一性或者具有不超过20、15、10、9、8、7、6、4、优选3或2个，优选不超过1个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的abp是如本段中所述的abp，条件是轻链和重链如下表1中本文公开的抗体所示配对。
[0065]
本发明的abp优选是如下的abp，其包含一条，优选两条抗体重链和一条，优选两条抗体轻链，它们各自与以下相比具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％，优选100％序列同一性或者具有不超过20、15、10、9、8、7、6、4、优选3或2个，优选不超过1个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列：
[0066]
a.选自以下的序列：重链的seq id no:28和轻链的seq id no:29(抗体v1
‑
v6)；
[0067]
b.选自以下的序列：重链的seq id no:30和轻链的seq id no:31(抗体v2
‑
v6)；
[0068]
c.选自以下的序列：重链的seq id no:32和轻链的seq id no:33(抗体v3
‑
v6)；
[0069]
d.选自以下的序列：重链的seq id no:34和轻链的seq id no:35(抗体v4
‑
v6)；
[0070]
e.选自以下的序列：重链的seq id no:36和轻链的seq id no:37(抗体v5
‑
v6)；
[0071]
f.选自以下的序列：重链的seq id no:38和轻链的seq id no:39(抗体v1
‑
v7)；
[0072]
g.选自以下的序列：重链的seq id no:40和轻链的seq id no:41(抗体v2
‑
v7)；
[0073]
h.选自以下的序列：重链的seq id no:42和轻链的seq id no:43(抗体v3
‑
v7)；
[0074]
i.选自以下的序列：重链的seq id no:44和轻链的seq id no:45(抗体v4
‑
v7)；
[0075]
j.选自以下的序列：重链的seq id no:46和轻链的seq id no:47(抗体v5
‑
v7)；
[0076]
k.选自以下的序列：重链的seq id no:48和轻链的seq id no:49(抗体v1
‑
v8)；
[0077]
l.选自以下的序列：重链的seq id no:50和轻链的seq id no:51(抗体v2
‑
v8)；
[0078]
m.选自以下的序列：重链的seq id no:52和轻链的seq id no:53(抗体v3
‑
v8)；
[0079]
n.选自以下的序列：重链的seq id no:54和轻链的seq id no:55(抗体v4
‑
v8)；
[0080]
o.选自以下的序列：重链的seq id no:56和轻链的seq id no:57(抗体v5
‑
v8)；
[0081]
p.选自以下的序列：重链的seq id no:58和轻链的seq id no:59(抗体v1
‑
v9)；
[0082]
q.选自以下的序列：重链的seq id no:60和轻链的seq id no:61(抗体v2
‑
v9)；
[0083]
r.选自以下的序列：重链的seq id no:62和轻链的seq id no:63(抗体v3
‑
v9)；
[0084]
s.选自以下的序列：重链的seq id no:64和轻链的seq id no:65(抗体v4
‑
v9)；
[0085]
t.选自以下的序列：重链的seq id no:66和轻链的seq id no:67(抗体v5
‑
v9)；
[0086]
u.选自以下的序列：重链的seq id no:68和轻链的seq id no:69(抗体v6
‑
v6)；
[0087]
v.选自以下的序列：重链的seq id no:70和轻链的seq id no:71(抗体v6
‑
v7)；
[0088]
w.选自以下的序列：重链的seq id no:72和轻链的seq id no:73(抗体v6
‑
v8)；
[0089]
x.选自以下的序列：重链的seq id no:74和轻链的seq id no:75(抗体v6
‑
v9)；
[0090]
y.选自以下的序列：重链的seq id no:78和轻链的seq id no:79(抗体v0
‑
v6)。
[0091]
在整个本公开中，优选的抗体可变链变体以名称“vx”或“vx
‑
vy”指代。短语“vx”，其中x可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8或9，表示根据表1或实施例部分的本发明中公开的可变区变体，特别是如实施例3中所述。特别地，人源化4g8 flt3抗原结合域表示为变体0或v0。术语v0，v1，v2，v3，v4，v5和v6可以指本发明抗体的flt3结合位点的可变区变体。另一方面，术语v6，v7，v8和v9是指本发明的抗体(双特异性)的cd3结合位点的某些变体。术语“vx
‑
vy”在本文中用于描述本发明的优选的双特异性flt3xcd3 abp，其中vx表示抗flt3结合位点变体，而vy表示抗cd3结合位点变体。在这种情况下，vx可以是v0，v1，v2，v3，v4，v5和v6之一；而vy可以是v6，v7，v8或v9之一。应当理解，v6可以在本发明的抗flt3结合位点变体或抗cd3结合位点变体的背景下使用。从上下文中可以明显看出其用法。从下面的表1中，变体的序列和总体构建体命名也变得显而易见。
[0092]
上述abp(a.)至(y.)的重链和轻链优选彼此配对。本发明的优选abp根据它们诱导对白血病癌细胞的t细胞介导的杀伤和/或生长抑制的能力来选择，例如根据本公开的实施例部分中提供的数据。例如，某些构建体如v5
‑
v9显示出最高的组合的flt3和cd3亲和力。尽管就此而言，包含v5
‑
v9的cd3或flt3抗原结合域的每个构建体是优选的abp，但是某些应用可能需要此类强的flt3/cd3结合剂。然而，也包括具有稍微降低的亲和力但因此具有更好的耐受性(人源化)或生物学活性(抗癌活性)的抗体作为本发明的优选构建体。因此，上文描述的abp a.至x都是优选的，特别是不包含v6
‑
v6的flt3(第一)抗原结合域的所有人源化变体。
[0093]
然后，本发明的另一个方面涉及双特异性抗原结合蛋白(abp)，其包含能够结合人fms样酪氨酸激酶3(flt3)抗原的第一抗原结合域，以及结合人分化簇3(cd3)抗原的第二抗原结合域。如在此方面所述的双特异性abp在优选的实施方案中可包括本文之前所述的abp的实施方案中的任一种或组合。在此之前所述的abp在所有其实施方案中可以是如在下文中所述的双特异性abp。
[0094]
在某些实施方案中，优选双特异性abp以低于10nm，优选低于9nm，更优选低于8nm，更优选低于7nm，更优选低于6nm，或低于5.5nm的ec
50
结合flt3。或者/另外，本发明的双特异性abp以高于0.5nm，更优选高于1nm，更优选高于1.3nm，更优选高于2nm，更优选高于3nm或4nm，或高于4.5nm的ec
50
结合flt3。进一步或者/另外，根据本发明的双特异性abp以低于10nm且高于0.5nm，更优选地低于9nm且高于1nm，优选地低于8nm且高于1.3nm，优选低于7nm且高于3nm，优选低于6nm且高于4nm，优选低于5.5nm且高于4.5nm的ec
50
结合flt3。通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞术分析双特异性abp与flt3阳性细胞的结合确定双特异性abp与flt3的结合的ec
50
；优选其中flt3阳性细胞是b细胞前体白血病细胞，优选nalm
‑
16细胞(如在acc680下存放于dsmz)；和/或优选地，其中使用荧光标记的二抗检测结合；和/或其中在流式细胞术之前将双特异性abp与flt3阳性细胞一起温育约30分钟。在此
实施方案中，本发明涉及抗体，令人惊讶地发现与靶抗原结合分子的某些优选的结合亲和力可以转化为改善的治疗效果。在这方面，如实施例中所示，尽管某些抗体与其他抗体相比对flt3的亲和力更低，但在介导细胞毒性方面具有显著改善的作用。在一些优选的方面和实施方案中，落入如本文公开的此类亲和力“窗”内的抗体是优选的。
[0095]
另外/或者，本发明的双特异性abp以小于50μm，更优选小于20μm，更优选小于10μm，更优选小于5μm，更优选小于1μm的k
d
结合flt3；和/或以大于50nm，更优选大于100nm，更优选大于160nm，更优选大于200nm，更优选大于300nm的kd结合flt3。最优选地，本发明的双特异性abp在某些优选的范围中，例如小于50μm且大于50nm，更优选地小于20μm且大于100nm，更优选地小于10μm且大于160nm，更优选小于5μm且大于200nm，更优选小于1μm且大于300nm的kd结合flt3；其中kd是通过表面等离振子共振测量的，例如在biacore亲和力测定法中，如在实施例部分中提供的。
[0096]
在另一个实施方案中，根据本发明的双特异性abp以低于200nm，优选低于90nm，更优选低于50nm，更优选低于20nm，更优选低于15nm的ec50结合cd3，和/或以高于1nm，优选地大于2nm，更优选地大于4.1nm，更优选地大于6nm，更优选地大于8nm的ec50结合cd3；和/或在一些实施方案中，对于cd3结合的亲和力的某些范围是优选的，例如以低于200nm且高于1nm，优选低于200nm且高于2nm，更优选低于90nm且高于4.1nm，更优选低于20nm且高于6nm，更优选低于15nm且高于8nm的ec50结合cd3。通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞术分析双特异性abp与cd3阳性细胞的结合来确定双特异性abp与cd3结合的ec50；优选其中cd3阳性细胞是t细胞白血病细胞，优选jurkat细胞(如在acc 282下存放于dsmz)；和/或优选地，其中使用荧光标记的二抗检测结合；和/或其中在流式细胞术前将双特异性abp与cd3阳性细胞温育约30分钟。
[0097]
或者/另外，在一些实施方案中，本发明的abp的特征在于它们杀死表达人flt3的癌细胞如all或aml细胞或抑制它们的增殖的能力。因此，在本发明的上下文中优选的是如本文所述的双特异性abp，其与无关对照相比在体外测定中将患有急性白血病的患者的白血病血液单个核细胞的增殖和/或存活力抑制至等于或小于50％，更优选等于或小于40％，更优选等于或小于30％，最优选等于或小于25％。本发明的此类优选的双特异性abp在v3
‑
v6,v3
‑
v8,v3
‑
v9,v4
‑
v6,v4
‑
v8,v4
‑
v9,v5
‑
v6,v5
‑
v8和v5
‑
v9以及它们在本文中公开的变体中举例说明。
[0098]
此外，本发明的一些实施方案涉及abp，其与本发明的abp竞争与flt3的结合，例如，竞争性抑制本发明的抗体与flt3的结合。为了确定竞争性抑制，可以采用本领域普通技术人员已知的多种测定法。例如，交叉竞争测定可用于确定抗体或其抗原结合片段是否竞争性抑制另一抗体或其抗原结合片段与flt3的结合。这些包括采用流式细胞仪或固相结合分析的基于细胞的方法。也可以使用在固相或溶液相中评估抗体或其抗原结合片段与未在细胞表面上表达的flt3分子交叉竞争的能力的其他测定法。
[0099]
根据本发明的abp可以具有两条链，一条短链(在一些实施方案中可以是轻链)和一条主链(在一些实施方案中也可以称为重链)。abp通常是这两条链的二聚体。
[0100]
本发明的abp可以优选是双特异性abp。双特异性abp可包含(i)可变区，其包含前述权利要求中任一项所定义的重链可变域和轻链可变域，其中所述可变区包含能够结合人flt3的第一抗原结合域和(ii)包含第二抗原结合域的abp的重链可变区和轻链可变区。应
当理解，flt3的结合位点优选是本文所述的本发明的flt3结合抗体的结合位点。
[0101]“双特异性”或“双功能”abp是具有两个不同的表位/抗原结合域(或“位点”)的abp，因此具有对两个不同的靶表位的结合特异性。这两个表位可以是相同抗原的表位，或者如本发明中优选的是不同抗原的，例如不同抗原flt3和cd3的。
[0102]“双特异性abp”可以是abp，其以由第一对重链和轻链或主链和较短/较小链限定的两个或更多个结合臂之一结合一个抗原或表位，并在第二对重链和轻链或主链和较小链限定的第二臂上结合不同抗原或表位。双特异性abp的这种实施方案在特异性和cdr序列上均具有两个不同的抗原结合臂。通常，双特异性abp对于它结合的每种抗原都是单价的，也就是说，它只用一个臂结合相应的抗原或表位。但是，双特异性抗体也可以二聚化或多聚化，这在本发明的上下文中是优选的。例如，在如本文所述的二聚体iggsc形式中，抗体对于每种抗原可以具有两个结合位点(图1)。双特异性抗体可以是杂合abp，其可以具有由第一轻链可变区和第一重链可变区定义的第一结合区，以及由第二轻链可变区和第二重链可变区定义的第二结合区。本发明预见到这些结合区之一可以由重链/轻链对限定。在本发明的上下文中，双特异性abp可以具有由主链和较小链的可变区定义的第一结合位点，以及由abp的主链中包含的scfv片段的可变区定义的第二不同结合位点。
[0103]
制备双特异性abp的方法在本领域是已知的，例如两个不同单克隆抗体的化学缀合，或者例如两个抗体片段，例如两个fab片段的化学缀合。或者，双特异性abp通过四源杂交瘤(quadroma)技术制备，即通过融合产生亲本抗体的杂交瘤来制备。由于h和l链的随机分类，产生了十种不同抗体结构的潜在混合物，其中只有一种具有所需的结合特异性。
[0104]
本发明的双特异性abp可以充当针对每个靶标的单克隆抗体(mab)。在一些实施方案中，抗体是嵌合的，人源化的或完全人的。双特异性abp可以例如是双特异性串联单链fv，双特异性fab2或双特异性双抗体。
[0105]
基于在本发明的abp中包含的域，本发明的双特异性abp可包含fab片段，其通常可包含铰链区，ch 2域和单链fv片段。此类双特异性abp被称为“fabsc
”‑
abp，并且已经在国际专利申请wo 2013/092001中首次进行了描述。更具体地，如本文所用的“fabsc”形式的abp通常是指具有fab片段的本发明的双特异性abp，该fab片段通常包括铰链区，该铰链区位于与ch2域n端连接的fab片段的c端，所述ch2域c末端又与scfv片段的n端连接。此类“fabsc”不包含或基本上不包含ch3域。在此上下文中，“不包含”或“基本上不包含”是指abp不包含全长ch3域。优选地，其意指abp包含ch3域的10个或更少，优选5个或更少，优选3个或甚至更少的氨基酸。fabsc形式abp的说明性示例在图1a中示出，fabsc形式abp的另一说明性示例在图12中示出。在说明性实施方案中(在这方面也参见图1a，本发明的fabsc abp可以包含ch2域，所述ch2域缺乏通过二硫键二聚化的能力，所述二硫键由铰链区的序列位置226处的半胱氨酸残基和/或铰链域之一的序列位置229处的半胱氨酸残基形成，根据kabat编号[eu
‑
索引]。因此，在这些实施方案中，序列位置226和/或序列位置229处的半胱氨酸残基被除去或替换，例如由丝氨酸残基替换。另外/或者，本发明的“fabsc”abp还可以具有“fc减弱的”ch2域(其包括铰链区)。此“fc减弱”通过缺失和/或取代(突变)ch2域中能够介导与fc受体的结合的选定氨基酸残基的至少一个来实现。在说明性实施方案中，铰链区或ch2域中能够介导与fc受体结合并且缺乏或突变的至少一个氨基酸残基选自下组：序列位置228,230,231,232,233,234,235,236,237,238,265,297,327和330(根据eu索引的序列位置编号)。在
783b1或欧洲专利ep 2 155 788b1中描述的abp，能够结合人和狨毛猴(callithrix jacchus)、棉顶狨(,saguinus oedipus)或松鼠猴(saimiri sciureus)cd3ε链的表位。
[0109]
因此，本发明的双特异性abp可以是双特异性abp，例如包含如本文所述的fab片段和scfv片段的iggsc分子。在该分子中，第一结合位点可以结合flt3，并且可以包含在如本文所述的fab(或iggsc形式上下文中的二价flt3f(ab)2)片段中，并且第二结合位点(其可以结合免疫受体)可包含在scfv片段，例如特异性结合cd3的scfv中。或者，结合flt3的第一结合位点包含在单链fv片段中，并且第二结合位点(其可以结合cd3)包含在fab片段中。
[0110]
在一些实施方案中，在结合，例如结合cd3后，本发明的双特异性abp本身不活化免疫细胞，例如t细胞。相反，仅当两个结合位点例如flt3特异性结合位点和cd3特异性结合位点与t细胞上的受体和靶癌细胞上的flt3结合时，前者可以使活化受体交联，从而触发效应细胞杀死特定的靶细胞。可以建立用于评估在存在和不存在本发明的双特异性abp的情况下淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力的标准功能测定法，以评估和/或筛选abp活化与其结合的受体的能力。
[0111]
在本发明的一些实施方案中，双特异性abp包含抗cd3抗体，例如ucht1或其变体的scfv作为第二抗原结合域，其例如在本申请的seq id no:14和25至27中公开。
[0112]
在本上下文中注意到，abp可包含一个或多个突变的氨基酸残基在本发明的范围内。关于核酸或多肽的术语“突变的”，“突变体”和“突变”是指与“天然”或“亲本”(若提供参考)存在的核酸或多肽，即可用于定义野生型的参考序列相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入。例如，如通过亲本4g8分子的广泛突变改变获得的并且如本文所述的本发明的abp的可变域可以视为亲本序列。
[0113]
就这而言，应理解，术语“位置”，当根据本发明使用时，是指氨基酸在本文所述的氨基酸序列内的位置。可以相对于类似的天然序列，例如天然存在的igg域或链的序列来指示该位置。如本文所用，术语“对应的”还包括位置不一定或不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数目确定。因此，可以取代的根据本发明的给定氨基酸位置可以由于抗体链中其他地方的氨基酸的缺失或添加而变化。
[0114]
因此，在根据本发明的“相应位置”下，应理解氨基酸在指示数量上可以不同，但仍具有相似的相邻氨基酸。可以交换，缺失或添加的所述氨基酸也被术语“相应位置”所涵盖。为了确定给定氨基酸序列中的氨基酸残基是否对应于天然存在的免疫球蛋白域或链的氨基酸序列中的某个位置，技术人员可以使用本领域公知的手段和方法，例如比对，手动或者通过使用计算机程序如blast2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或clustalw，或者适合于产生序列比对的任何其他合适程序进行比对。
[0115]
在一些实施方案中，取代(或替换)是保守取代。保守取代通常是以下取代，根据要突变的氨基酸列出，每个后带有一个或多个可以视为保守的替换：ala
→
gly,ser,val；arg
→
lys；asn
→
gln,his；asp
→
glu；cys
→
ser；gln
→
asn；glu
→
asp；gly
→
ala；his
→
arg,asn,gln；ile
→
leu,val；leu
→
ile,val；lys
→
arg,gln,glu；met
→
leu,tyr,ile；phe
→
met,leu,tyr；ser
→
thr；thr
→
ser；trp
→
tyr；tyr
→
trp,phe；val
→
ile,leu。其他取代也是允许的，并且可以凭经验确定或与其他已知的保守或非保守取代一致确定。作为进一步的方向，以下八组各含有通常可用来定义彼此保守取代的氨基酸：
[0116]
‑
丙氨酸(ala)，甘氨酸(gly)；
[0117]
‑
天冬氨酸(asp)，谷氨酸(glu)；
[0118]
‑
天冬酰胺(asn)，谷氨酰胺(gln)；
[0119]
‑
精氨酸(arg)，赖氨酸(lys)；
[0120]
‑
异亮氨酸(ile)，亮氨酸(leu)，甲硫氨酸(met)，缬氨酸(val)；
[0121]
‑
苯丙氨酸(phe)，酪氨酸(tyr)，色氨酸(trp)；
[0122]
‑
丝氨酸(ser)，苏氨酸(thr)；和
[0123]
‑
半胱氨酸(cys)，甲硫氨酸(met)
[0124]
若此类取代导致生物活性的改变，则可以引入更实质性的变化，例如以下所述，或如以下参考氨基酸类别进一步描述的，并针对所需特性筛选产物。此类更实质性的变化的示例包括：ala
→
leu,ile；arg
→
gln；asn
→
asp,lys,arg,his；asp
→
asn；cys
→
ala；gln
→
glu；glu
→
gln；his
→
lys；ile
→
met,ala,phe；leu
→
ala,met,正亮氨酸；lys
→
asn；met
→
phe；phe
→
val,ile,ala；trp
→
phe；tyr
→
thr,ser；val
→
met,phe,ala。
[0125]
在一些实施方案中，根据本发明的abp包括一个或多个氨基酸残基，包括2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17个或18个氨基酸残基，它们被突变以防止通过半胱氨酸残基进行二聚化或以调节fc功能(参见上文)。在这些实施方案的一些中，将能够介导与fc受体结合的ch2域和/或铰链区的一个或多个氨基酸残基进行突变。若存在，则一个或多个能够介导与fc受体结合的氨基酸残基可以是能够激活抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体介导的细胞毒性(cdc)的氨基酸残基。在一些实施方案中，通常当将序列与免疫球蛋白例如igg中的相应天然存在的域的序列进行比较时，能够介导与fc受体结合的相应氨基酸残基被另一个氨基酸取代。在一些实施方案中，通常相对于免疫球蛋白例如igg中的相应天然存在的域的序列，缺失能够介导与fc受体结合的此类氨基酸残基。
[0126]
在一些实施方案中，一个或多个突变，例如取代或缺失的氨基酸残基是位于位置226,228,229,230,231,232,233,234,235,236,237,238,265,297,327和330之一的氨基酸。再次，所使用的氨基酸编号对应于根据kabat编号[eu
‑
索引]的序列位置。氨基酸的相应缺失可以例如是氨基酸228的缺失，通常是igg中的脯氨酸，氨基酸229的缺失，通常是igg中的半胱氨酸，氨基酸230的缺失，通常是igg中的脯氨酸，氨基酸231的缺失，通常是igg中的丙氨酸，氨基酸232的缺失，通常在igg中的脯氨酸，氨基酸233的缺失，通常在igg中的谷氨酸，氨基酸234的缺失，通常是在igg中的亮氨酸，氨基酸235的缺失，通常是igg中的亮氨酸，氨基酸236位缺失，通常是在igg中的甘氨酸，237位氨基酸的缺失，通常是在igg中的甘氨酸，氨基酸238的缺失，通常是igg中的脯氨酸和氨基酸265的缺失，通常是igg中的天冬氨酸。氨基酸的相应取代可以例如是氨基酸226的取代，通常是igg中的半胱氨酸，氨基酸228的取代，通常是igg中的脯氨酸，氨基酸229的取代，通常是igg中的半胱氨酸，氨基酸230的取代，通常是igg中的脯氨酸，氨基酸231的取代，通常在igg中的丙氨酸，氨基酸232的取代，通常在igg中的脯氨酸，氨基酸233的取代，通常是在igg中的谷氨酸，氨基酸234的取代，通常是igg的亮氨酸，在氨基酸235中的取代，通常在igg中的亮氨酸，氨基酸265的取代，通常是igg中的天冬氨酸，氨基酸297的取代，通常是igg中的天冬酰胺，氨基酸327中的取代，通常是igg的丙氨酸，以及氨基酸330中的取代，通常是在igg的丙氨酸。各自的取代可以是取代取代cys226
→
ser,取代cys229
→
ser,取代glu233
→
pro,取代leu234
→
val,取代leu235
→
ala,取代asp265
→
gly,取代asn297
→
gln,取代ala327
→
gln,取代ala327
→
gly和取代
ala330
→
ser之一。从上面可以看出，在一些实施方案中，铰链区中位置226和229的一个或两个半胱氨酸残基被取代为另一种氨基酸，例如取代为丝氨酸残基。由此可以防止与另一主链形成二硫键。此外，并且如下文所解释，缺失和/或取代(突变)ch2域中能够介导与fc受体结合的选定氨基酸残基可以导致本发明的abp在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体固定方面具有更少活性或没有活性。
[0127]
抗体的另一类氨基酸变体改变abp的原始糖基化模式(若有的话)。改变是指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是n
‑
连接或o
‑
连接的。n
‑
连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺
‑
x
‑
丝氨酸和天冬酰胺
‑
x
‑
苏氨酸，其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸，是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。o
‑
连接的糖基化是指糖n
‑
乙酰半乳糖胺，半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管也可以使用5
‑
羟脯氨酸或5
‑
羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列(对于n
‑
连接的糖基化位点)，可以方便地实现将糖基化位点添加至抗体。也可以通过向原始抗体的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代进行改变(对于o
‑
连接的糖基化位点)。
[0128]
在本发明的上下文中，在一些实施方案中，代表免疫球蛋白fc区的本发明abp的主链部分就结合fc受体而言通常是惰性的，或者至少基本上是低影响的。如所述，这通过缺失和/或取代(突变)ch2域中能够介导与fc受体的结合的选定氨基酸残基的至少一个来实现。此类分子在本文中也称为“fc减弱的”abp或“fcko”abp。因此，例如，根据本发明的抗体链中可视为代表fc片段的部分，即ch2域和(若存在的话)ch3域的部分可在不提供特定生物学功能例如效应器功能的情况下定义“支架”。然而，在本发明中已经发现，与已知的abp相比，该支架可以在本发明的abp的纯化，生产效率和/或稳定性方面提供显著的优势。
[0129]
在一些实施方案中，此fc对应部分对给定的fc受体的识别以及相应的结合比天然存在的免疫球蛋白的fc区低约2倍，约5倍，约8倍，约10倍，约12倍，高约15倍，约20倍或更低。在一些实施方案中，此fc对应部分完全没有其结合fc受体的能力。熟练技术人员可以使用标准技术，例如表面等离振子共振，例如使用biacoretm测量，容易地确定抗体与fc受体的结合，包括确定解离常数。同样可以使用任何其他测量生物分子结合的方法，其可以例如依赖于光谱学，光化学，光度学或放射学手段。相应检测方法的例子分别是荧光相关光谱法，光化学交联法以及光活性或放射性标记物的使用。这些方法中的某些可以包括其他分离技术，例如电泳或hplc。
[0130]
若需要的话，可以大致实施如上文解释的氨基酸残基的取代或缺失。例如，合适的突变可取自armour et al.(eur.j.immunol.[1999]29,2613
‑
2624)。可以从在fcγriii和人igg1 fc片段之间的复合物上公布的晶体结构数据中获得用于抗体链序列突变的其他合适的位置(sondermann et al.,nature[2000]406,267
‑
273)。除了如上所述测量结合亲和力以评估“fc减弱”水平或结合亲和力的丧失外，还可以在功能上评估介导与fc受体结合的能力(缺乏)。在结合cd3作为靶标的abp的情况下，例如可以通过此类cd3结合性abp在细胞上的致有丝分裂性(mitogenity)来评估结合。致有丝分裂性是通过cd3抗体与辅助细胞如单核细胞上的fc受体结合而介导的。若具有一个cd3结合位点的本发明的abp没有显示出任
kinet,annu.rev.immunol.9:457
‑
92(1991)；capel et al.,immunomethods 4:25
‑
34(1994)；和de haas et al.,j.lab.clin.med.126:330
‑
41(1995)。
[0135]“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活通过补体系统的第一组分(c1q)与抗体(适当亚类)的结合而开始，所述抗体与其关联抗原结合。为了评估补体激活，可进行cdc测定，例如，如gazzano
‑
santoro et al.,j.immunol.methods 202:163(1997)中所述。
[0136]
术语“补体系统”在本领域中用于指代在血液中发现的许多小蛋白质，称为补体因子，通常以无活性的前体(原蛋白)形式流通。该术语指这种不可改变且不可适应的系统“补充”抗体和吞噬细胞从生物体清除病原体(例如细菌)以及抗原
‑
抗体复合物的能力的能力。补体因子的一个例子是复合物c1，它包括c1q和两个丝氨酸蛋白酶c1r和c1s。复合物c1是cdc途径的组分。c1q是分子量为约460,000的六价分子，其结构类似于一束郁金香，其中六个胶原蛋白性“茎”与六个球形头部相连。为了激活补体级联，c1q必须结合igg1，igg2或igg3的至少两个分子。
[0137]“抗体依赖性细胞毒性”或adcc是指细胞毒性的一种形式，其中结合到fc受体(fcr)上的免疫球蛋白分子存在于某些细胞毒性细胞上，例如自然杀伤(nk)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞——使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合到带有抗原的靶细胞上，并随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过这种机制杀死靶细胞所需的。介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri，fcγr11和fcγriii。ravetch and kinet,annu.rev.immunol.9:457
‑
92(1991)的第464页表3中总结了造血细胞上的fcr表达。为了评估目的分子的adcc活性，可以进行体外adcc测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。用于此类测定的有用的效应细胞包括但不限于外周血液单个核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方案中，可以在体内，例如在动物模型，诸如clynes et al.,pnas usa 95:652
‑
656(1998)中公开的动物模型中评估目的分子的adcc活性。
[0138]
本发明的abp可以使用任何已知的和公认的表达系统和重组细胞培养技术来产生，例如通过在细菌宿主(原核系统)或真核系统例如酵母，真菌，昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达来产生。例如，当本发明的abp以“iggsc”形式使用时，abp可以(当然)如coloma and morrison(nat biotechnol15:159
‑
63,1997)所描述或本申请的实施例部分中所描述产生。同样地，可以如国际专利申请wo 2013/092001中所述或如本文实施例部分中所述产生以“fabsc”形式采用的本发明的abp。本发明的abp还可以在转基因生物如山羊，植物或xenomouse转基因小鼠(工程化小鼠，其具有人免疫球蛋白基因座的大片段并且是小鼠抗体产生缺陷的)中产生。抗体也可以通过化学合成来产生。
[0139]
为了产生本发明的重组abp，通常分离编码抗体的多核苷酸，并将其插入可复制的载体例如质粒中，以进行进一步的克隆(扩增)或表达。合适的表达系统的说明性例子是谷氨酸合成酶系统(例如由lonza biologics出售)，其中宿主细胞是例如cho或ns0。编码抗体的多核苷酸易于使用常规方法分离并测序。可以使用的载体包括质粒，病毒，噬菌体，转座子，微型染色体，其中质粒是典型的实施方案。通常，此类载体还包括可操作地连接至轻链和/或重链多核苷酸以促进表达的信号序列，复制起点，一个或多个标志物基因，增强子元件，启动子和转录终止序列。可以将编码轻链和重链的多核苷酸插入分开的载体中并转染
到同一宿主细胞中，或者，若需要，可以将重链和轻链都插入同一载体中以转染到宿主细胞中。两条链可以例如在双顺反子操纵子的控制下排列，并表达以产生功能性且正确折叠的abp，如skerra,a.(1994)use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in escherichia coli,gene 151,131
‑
135,或skerra,a.(1994)ageneral vector,pask84,for cloning,bacterial production,and single
‑
step purification of antibody fab fragments,gene 141,79
‑
8中所述。因此，根据本发明的一个方面，提供了一种构建编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的载体的方法，该方法包括将编码本发明的abp的轻链和/或重链插入载体中。
[0140]
当使用重组技术时，abp可以在细胞内，周质空间中产生，或直接分泌到培养基中(也参见skerra 1994，同上)。若抗体在细胞内产生，则第一步，例如通过离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。carter et al.,bio/technology 10:163
‑
167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。抗体也可以在任何氧化环境中产生。此类氧化环境可由革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)的周质提供，在革兰氏阳性细菌的细胞外环境或真核细胞(包括动物细胞，如昆虫或哺乳动物细胞)的内质网腔中提供，通常有利于结构二硫键的形成。然而，也可能在宿主细胞如大肠杆菌的胞质溶胶中产生本发明的abp。在这种情况下，可以以可溶性和折叠状态直接获得多肽多肽，或者可以以包涵体的形式回收，然后在体外复性。进一步的选择是使用具有氧化性细胞内环境的特定宿主菌株，因此这可以允许在胞质溶胶中形成二硫键(venturi m,seifert c,hunte c.(2002)“high level production of functional antibody fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm.”j.mol.biol.315,1
‑
8)。
[0141]
由细胞产生的abp可以使用任何常规的纯化技术来纯化，例如羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析，其中亲和层析是一种优选的纯化技术。可以通过与蛋白质/配体的亲和纯化来纯化abp，所述蛋白质/配体特异性且可逆地结合恒定域，例如ch1或cl域。此类蛋白质的例子是结合免疫球蛋白的细菌蛋白质，例如蛋白a，蛋白g，蛋白a/g或蛋白l，其中蛋白l的结合限于含有kappa轻链的abp。纯化具有κ轻链的抗体的备选方法是使用珠偶联的抗kappa抗体(kappaselect)。蛋白a作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白fc域的种类和同种型。蛋白a可用于纯化抗体(lindmark et al.,j.immunol.meth.62:1
‑
13(1983))。蛋白g推荐用于所有小鼠同种型和人gamma3(guss et al.,embo j.5:15671575(1986))。用于本发明的特定abp的纯化方法的选择在本领域普通技术人员的知识范围内。
[0142]
还可以给本发明的abp的链之一装备一个或多个亲和标签。亲和标签，例如或(schmidt,t.g.m.et al.(1996)j.mol.biol.255,753
‑
766)，myc标签，flagtm标签，his6标签或ha标签允许重组abp的容易检测以及还有简单纯化。
[0143]
现在转向本发明的核酸，编码根据本发明的抗体的一条或多条链的核酸分子可以是任何可能构型的任何核酸，例如单链，双链或其组合。核酸包括例如dna分子，rna分子，使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的dna或rna的类似物，锁核酸分子(lna)和蛋白质核酸分子(pna)。dna或rna可以是基因组或合成来源的，并且可以是单链或双链的。此类核酸可以是例如mrna，crna，合成rna，基因组dna，cdna合成dna，dna和rna的共聚物，寡核苷酸
等。此外，相应的核酸可包含非天然核苷酸类似物和/或与亲和标签或标记物连接。
[0144]
在一些实施方案中，在载体例如质粒中包括编码根据本发明的抗体的链例如主链和/或较小链的核酸序列。与抗体的天然域或区域相比时，在抗体链中将包含取代或缺失的情况下，相应天然域/区的编码序列(例如包含在免疫球蛋白序列中)可以用作诱变的起点。为了诱变选定的氨基酸位置，本领域技术人员可以使用各种已建立的用于定点诱变的标准方法。常用的技术是使用合成寡核苷酸的混合物通过pcr(聚合酶链反应)引入突变，所述合成寡核苷酸在所需序列位置具有简并的碱基组成。例如，使用密码子nnk或nns(其中n＝腺嘌呤，鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；k＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶；s＝腺嘌呤或胞嘧啶)允许在诱变过程中掺入所有20个氨基酸加琥珀终止密码子，而密码子vvs将可能掺入的氨基酸的数目限制为12，因为它排除了将cys,ile,leu,met,phe,trp,tyr,val氨基酸掺入多肽序列的选定位置；例如，使用密码子nms(其中m＝腺嘌呤或胞嘧啶)在选定的序列位置将可能的氨基酸数量限制为11个，因为它排除了将arg,cys,gly,ile,leu,met,phe,trp,val氨基酸掺入选定的序列位置。在这方面，应注意的是，其他氨基酸(不同于常规的20个天然存在的氨基酸)的密码子，例如硒代半胱氨酸(selenocystein)或吡咯赖氨酸(pyrrolysine)也可以掺入abp的核酸中。如wang,l.,et al.(2001)science292,498
‑
500或wang,l.和schultz,p.g.(2002)chem.comm.1,1
‑
11所描述的，也可能用通常认为是终止密码子的“人工”密码子(例如uag)以便插入其他不常见的氨基酸，例如邻甲基l
‑
酪氨酸或对氨基苯丙氨酸。
[0145]
使用碱基对特异性降低的核苷酸构件，例如肌苷，8
‑
氧代
‑2’
脱氧鸟苷或6(2
‑
脱氧
‑
β
‑
d
‑
核糖呋喃糖基)
‑
3,4
‑
二氢
‑
8h
‑
嘧啶并
‑
1,2
‑
恶嗪
‑7‑
酮6(2
‑
deoxy
‑
β
‑
d
‑
ribofuranosyl)
‑
3,4
‑
dihydro
‑
8h
‑
pyrimin
‑
do
‑
1,2
‑
oxazine
‑7‑
one(zaccolo et al.(1996)j.mol.biol.255,589
‑
603)，是将突变引入所选序列片段的另一种选择。进一步的可能性是所谓的三重诱变。该方法使用不同核苷酸三联体的混合物，每个三联体编码一个氨基酸，以掺入编码序列中(b,et al.,1994nucleic acids res 22,5600
‑
5607)。
[0146]
可以使用任何合适的表达系统，例如在合适的宿主细胞中或在无细胞系统中，表达编码根据本发明的抗体的链，例如主链和/或较小链的核酸分子。可以通过选择和/或分离来富集所获得的abp。优选地，在遗传构建体例如载体/质粒的背景下提供本发明的核酸。
[0147]
还提供了包含本发明的此类核酸的核酸系统或构建体，其中本发明的系统包含各编码本发明的abp的一个单体的至少两个本发明的核酸，例如编码重链序列的一种核酸和编码轻链序列的第二核酸。
[0148]
在一些实施方案中，本发明的abp的多肽可以由核酸编码以在体内或体外表达。因此，在一些实施方案中，提供了编码本发明的abp的分离的核酸。在一些实施方案中，核酸编码本发明的abp的一个部分或单体(例如抗体的两条(重和轻)链之一)，和/或另一个核酸编码本发明abp的另一部分或单体(例如抗体的两条链中的另一条)。此类核酸可以以组合或作为系统一起提供。在一些实施方案中，核酸编码两条或更多条abp多肽链，例如，至少2条抗体链。编码多个abp链的核酸可以包括至少两个链序列之间的核酸切割位点，可以编码两个或更多个链序列之间的转录或翻译起始位点，和/或可以编码两个或更多个abp链之间的蛋白水解靶位点。
[0149]
然而，本发明的另一方面提供了一种载体(例如表达载体)，其包含编码如本文所公开的abp或abp的一部分或单体的核酸。例如，在一些实施方案中，在abp是多聚体蛋白的
情况下，核酸仅编码抗原构建体的单个多肽链。因此，为了表达此类抗原结合构建体，本发明的表达载体可以含有两个或更多个核酸，其各自编码abp的不同部分或单体，其组合将表达整个abp。类似地，可以将包含核酸的本发明的表达载体与本发明的各自编码abp的不同部分或单体的其他不同表达载体组合使用，所述核酸仅编码抗原结合构建体的一部分或单体的。在其他实施方案中，核酸编码本发明的abp的多条多肽链。在一些实施方案中，表达载体包括用于哺乳动物表达的pcdna3.1
tm
/myc
‑
his(
‑
)a版载体(invitrogen，inc.)或其变体。pcdna3.1表达载体特征为用于哺乳动物表达的cmv启动子以及哺乳动物(新霉素)和细菌(氨苄青霉素)选择标志物两者。在一些实施方案中，表达载体包括质粒。在一些实施方案中，载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或腺病毒载体。在实施方案中，载体包括粘粒，yac或bac。
[0150]
在另一个相关方面，本发明涉及包含一种或多种本发明核酸的细胞(例如宿主细胞和/或重组宿主细胞)。优选地，此类细胞能够表达由所述核酸编码的abp(或其组分)。例如，若本发明的abp包含两条分开的多肽链(例如igg的重链和轻链)，则本发明的细胞可以包含编码(并且可以表达)此类abp的重链的第一核酸以及编码(并且可以表达)此类abp的轻链的第二核酸；或者，细胞可以包含编码此类abp的两条链的单个核酸。以这些方式，本发明的此类细胞将能够表达本发明的功能性abp。本发明的(宿主)细胞可以是如本文其他地方所述的哺乳动物，原核或真核宿主细胞之一，特别是当所述细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞时。
[0151]
在此类方面的某些实施方案中，(宿主)细胞是人细胞；特别地，它可以是已经从特定个体采样的人细胞(例如自体人细胞)。在此类实施方案中，此类人细胞可以体外繁殖和/或操作，以引入本发明的核酸。来自特定个体的经操作的人细胞的效用可以产生本发明的abp，包括将此类经操作的人细胞群体重新引入人类受试者，例如用于治疗。在某些此类用途中，可以将经操作的人细胞引入首次采样的同一人个体；例如，作为自体人细胞。
[0152]
经受此类操作的人细胞可以是体内的任何生殖细胞或体细胞类型。例如，供体细胞可以是生殖细胞或体细胞，其选自下组：成纤维细胞，b细胞，t细胞，树突状细胞，角质形成细胞，脂肪细胞，上皮细胞，表皮细胞，软骨细胞，卵丘细胞，神经细胞，神经胶质细胞，星形胶质细胞，心脏细胞，食道细胞，肌肉细胞，黑素细胞，造血细胞，巨噬细胞，单核细胞和单个核细胞。供体细胞可以从体内的任何器官或组织中获得。例如，它可以是选自肝，胃，肠，肺，胰腺，角膜，皮肤，胆囊，卵巢，睾丸，肾脏，心脏，膀胱和尿道的器官中的细胞。
[0153]
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的abp和任选的药学上可接受的赋形剂。
[0154]
根据本发明的abp可以通过对蛋白质性药物治疗有效的任何胃肠外或非胃肠外(肠)途径施用。胃肠外施用方法包括例如皮内，皮下，肌肉内，气管内，鼻内，玻璃体内或静脉内注射和输注技术，例如以注射溶液，输注溶液或酊剂的形式，以及气雾剂滴注和吸入，例如以气雾剂混合物，喷雾剂或粉末的形式。对通过肺部给药的概述，即通过吸入气雾剂(也可用于鼻内给药)或通过气管内滴注。例如，j.s.patton et al.the lungs as a portal of entry for systemic drug delivery.proc.amer.thoracic soc.2004vol.1第338
‑
344页给出了关于肺药物递送的概述，即通过吸入气雾剂(其也可以在鼻内施用中使用)或气管内滴注。非胃肠外递送模式例如是口服递送，例如以丸剂，片剂，胶囊剂，溶液剂
或悬浮剂的形式，或直肠递送，例如以栓剂的形式。本发明的abp可以按需要以含有常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体，添加剂和媒介物的制剂全身或局部施用。
[0155]
在本发明的一个实施方案中，将药物胃肠外施用给哺乳动物，特别是人。相应的施用方法包括但不限于例如皮内，皮下，肌内，气管内或静脉内注射和输注技术，例如以注射溶液，输注溶液或酊剂的形式以及气雾剂滴注和吸入形式，例如以气雾剂混合物，喷雾剂或粉末的形式。若化合物的血清半衰期相对较短，则静脉内和皮下输注和/或注射的组合可以是最方便的。药物组合物可以是水溶液，水包油乳剂或油包水乳剂。
[0156]
在这方面，应当注意的是，meidan vm and michniak bb 2004am.j.ther.11(4):312
‑
316中描述的透皮递送技术，例如，离子透入法(iontophoresis)，超声促渗(sonophoresis)或微针增强递送也可用于本文所述的abp的透皮递送。非胃肠外递送模式例如是口服的，例如以丸剂，片剂，胶囊剂，溶液剂或悬浮液形式，或直肠施用，例如以栓剂的形式。本发明的abp可以以含有多种常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体，添加剂和赋形剂的制剂全身或局部施用。
[0157]
所施加的abp的剂量可以在宽的限度内变化，以实现所需的预防效果或治疗响应。例如，这将取决于abp对所选靶标的亲和力以及abp与配体之间复合物的体内半衰期。此外，最佳剂量将取决于abp或其缀合物的生物分布，施用方式，所治疗疾病/病症的严重程度以及患者的医疗状况。例如，当在用于局部应用的软膏剂中使用时，可以使用高浓度的abp。但是，若想要的话，也可以以缓释制剂的形式给出abp，例如脂质体分散体或基于水凝胶的聚合物微球，例如polyactivetm或octodextm(参见bos et al.,business briefing:pharmatech 2003:1
‑
6)。其他可用的缓释制剂是例如基于plga的聚合物(pr pharmaceuticals)，基于pla
‑
peg的水凝胶(medincell)和基于pea的聚合物(medivas)。
[0158]
因此，可以使用药学上可接受的成分以及建立的制备方法将本发明的abp配制成组合物(gennaro,a.l.and gennaro,a.r.(2000)remington:the science and practice of pharmacy,20th ed.,lippincott williams&wilkins,philadelphia,pa)。为了制备药物组合物，可以使用药学上惰性的无机或有机赋形剂。为了制备例如丸剂，粉末，明胶胶囊或栓剂，可以使用例如乳糖，滑石，硬脂酸及其盐，脂肪，蜡，固体或液体多元醇，天然和硬化油。用于制备溶液，悬浮液，乳剂，气雾剂混合物或粉末以在使用前重新配制成溶液或气雾剂混合物的合适赋形剂包括水，醇，甘油，多元醇及其合适的混合物以及植物油。
[0159]
药物组合物还可包含添加剂，诸如例如填充剂，粘合剂，湿润剂，助流剂，稳定剂，防腐剂，乳化剂，以及此外溶剂或增溶剂或实现贮积作用的试剂。后者是融合蛋白可以掺入缓慢或持续释放或靶向递送系统中，例如脂质体和微胶囊。
[0160]
可以通过多种方式对制剂进行灭菌，包括通过保持细菌的滤器进行过滤，或者以无菌固体组合物的形式掺入灭菌剂，该组合物可以刚好在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌介质中。
[0161]
abp可以是适合的并可以用于治疗或预防疾病。因此，在一些实施方案中，根据本发明的abp可以用于治疗和/或预防诸如病症或疾病的医学状况的方法中。类似地，本发明的abp可以用于治疗疾病。要治疗或预防的疾病可以是增殖性疾病。此类增殖性疾病可以优选是肿瘤或癌症。由于本发明的abp结合flt3的能力，该abp可用于治疗由表达flt3，野生型或突变的flt3的细胞组成的癌症。就本发明的方法而言，癌症可以是任何癌症，包括下列任
一种：急性淋巴细胞癌，急性髓样白血病(ami)，肺泡横纹肌肉瘤，膀胱癌(例如膀胱癌瘤)，骨癌，脑癌(例如髓母细胞瘤)，乳腺癌，肛门癌，肛管癌或肛门直肠癌，眼癌，肝内胆管癌，关节癌，颈癌，胆囊癌或胸膜癌，鼻癌，鼻腔癌或中耳癌，口腔癌，外阴癌，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓样癌，结肠癌，食道癌，宫颈癌，纤维肉瘤，胃肠类癌肿瘤，头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，肾癌，喉癌，白血病，液体肿瘤，肝癌，肺癌(例如非小细胞肺癌和长腺癌)，淋巴瘤，间皮瘤，肥大细胞瘤，黑素瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，非霍奇金淋巴瘤，b型慢性淋巴细胞性白血病，毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(all)和伯吉特氏淋巴瘤(burkiht’slymphoma)，卵巢癌，胰腺癌，腹膜癌，网膜癌和肠系膜癌，咽癌，前列腺癌，直肠癌，肾癌，皮肤癌，小肠癌，软组织癌，实体瘤，滑膜肉瘤，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌和输尿管癌。优选地，癌症的特征在于flt3的表达。最优选地，癌症是flt3阳性白血病，例如aml或all。
[0162]
要用融合蛋白治疗的受试者可以是人类或非人类动物。此类动物优选地是哺乳动物，例如人，猪，牛，兔，小鼠，大鼠，灵长类，山羊，绵羊，鸡或马，最优选地是人。
[0163]
本发明的abp还可以用于疾病的诊断，例如如本文所述的疾病。为此，可以用合适的可检测信号标记物标记abp。此类标记的abp可以允许检测或定量flt3水平或癌症，例如白血病，或任何上述癌症或受试者。当指定用于体内使用时，所述可检测信号标记物优选在体内可检测。
[0164]
标记的abp可以用于免疫成像技术。然后，例如，可以基于用于诊断的免疫成像技术来选择可检测的信号标记物，例如，在gamma相机成像技术/spect的情况下发射gamma的放射性核素(或gamma发射体)，在mri或pet成像技术的情况下金属或正电子发射器。就这而言，本公开的一种或多种可检测的信号标记物包括gamma相机可成像剂，pet可成像剂和mri可成像剂，例如放射性核素，荧光剂(fluorescers)，荧光原(fluorogens)，生色团(chromophores)，色原体(chromogens)，磷光剂(phosphorescers)，化学发光剂和生物发光剂。
[0165]
合适的可检测信号标记物可以是放射性核素。所述放射性核素可以选自3h,14c,35s,99tc,1231,1251,131i,min,97ru,67ga,68ga,72as,89zr和201t1。
[0166]
合适的可检测信号标记物也可以是荧光团或荧光原。所述荧光团或荧光原可以选自下组：荧光素，若丹明，丹酰，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛，荧光胺，荧光素衍生物，oregon green，若丹明绿(rhodamine green)，rhodol green或texas red。
[0167]
标记的abp可以直接或间接偶联至可检测的信号标记。例如，abp可以直接(例如，通过abp的酪氨酸残基)或间接(例如，通过接头
‑
作为金属螯合剂)偶联至可检测的信号标记物。在一些其他实施方案中，abp可以偶联至分子，其能够在使用的时间和地点(体外或体内)与可检测的信号标记物偶联。
[0168]
可检测的信号标记物可以通过与abp偶联的一个或多个二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)残基与abp结合。
[0169]
本发明还考虑了一种检测或诊断本文定义的疾病的体外方法。此类方法可以包括使从受试者获得的样品与本发明的优选标记的abp接触。样品可以是血液，尿液或脑脊液样品，但是优选可以是液体样品或生检样品。待检测或诊断的疾病优选是白血病，例如all或aml。
[0170]
如本文所用，术语“本发明的”，“根据本发明的”，“依照本发明的”等指本文描述和/或要求保护的本发明的所有方面和实施方案。
[0171]
如本文中所用，术语“包括”应当解释为涵盖“包括”和“由
……
组成”两者，这两种含义都是特别意图的，因此是根据本发明的单独公开的实施方案。在本文中使用时，“和/或”应视为具体公开两个规定特征或组分中的每种，具有或没有另一种。例如，“a和/或b”应当视为(i)a，(ii)b和(iii)a和b中的每个的具体公开，就如同每个在本文中单独列出一样。在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解为仍确保所讨论特征的技术效果的精度范围。该术语通常表示与指示的数值偏差
±
20％，
±
15％，
±
10％，例如
±
5％。如普通技术人员将理解的，对于给定的技术效果，数值的此类特定偏差将取决于技术效果的性质。例如，与人为或工程技术效果相比，自然或生物技术效果通常可以具有更大的此类偏差。如普通技术人员将理解的，对于给定的技术效果，数值的此类特定偏差将取决于技术效果的性质。例如，与人为或工程技术效果相比，自然或生物技术效果通常可以具有更大的此类偏差。当提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一个/种”或“所述”的情况下，例如除非特别说明，这包括复数个该名词。
[0172]
应理解，根据本文包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或环境，以及包括本发明的变型或其他特征(诸如另外的方面和实施方案)将在本领域普通技术人员的能力内。
[0173]
除非上下文另外指出，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方案。
[0174]
本文引用的所有参考文献，专利和出版物均通过引用全文并入本文。
[0175]
鉴于上述情况，将理解，本发明还涉及以下逐项实施方案：
[0176]
第1项：双特异性抗原结合蛋白(abp)，其包含能够结合人fms样酪氨酸激酶3(flt3)抗原的第一抗原结合域，和结合人分化簇3(cd3)抗原的第二抗原结合域。
[0177]
第2项：根据第1项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以低于10nm，优选低于9nm，更优选低于8nm，更优选低于7nm，更优选低于6nm，或低于5.5nm的ec50结合flt3。
[0178]
第3项：根据第1或2项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以高于0.5nm，更优选高于1nm，更优选高于1.3nm，更优选高于2nm，更优选高于3nm，或4nm，或高于4.5nm的ec50结合flt3。
[0179]
第4项：根据第1至3项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以低于10nm且高于0.5nm，更优选低于9nm且高于1nm，优选低于8nm且高于1.3nm，优选低于7nm且高于3nm，优选低于6nm且高于4nm，优选低于5.5nm且高于4,5nm的ec50结合flt3。
[0180]
第5项：根据第2至4项中任一项的双特异性abp，其中通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞术分析所述双特异性abp与flt3阳性细胞的结合来确定所述双特异性abp结合flt3的ec50；优选其中flt3阳性细胞是b细胞前体白血病细胞，优选nalm
‑
16细胞(如在acc 680下存放于dsmz)；和/或优选地，其中使用荧光标记的二抗检测结合；和/或其中在流式细胞术之前将所述双特异性abp与所述flt3阳性细胞温育约30分钟。
[0181]
第6项：根据第1至5项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以小于50μm，更优选小于20μm，更优选小于10μm，更优选小于5μm，更优选小于1μm的kd结合flt3。
[0182]
第7项：根据第1至5项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以大于
50nm，更优选大于100nm，更优选大于160nm，更优选大于200nm，更优选大于300nm的kd结合flt3。
[0183]
第8项：根据第1至5项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以小于50μm且大于50nm，更优选小于20μm且大于100nm，优选小于10μm且大于160nm，更优选小于5μm且大于200nm，更优选小于1μm且大于300nm的kd结合flt3。
[0184]
第9项：根据第6至8项中任一项的双特异性abp，其中所述kd是通过表面等离振子共振测量的，例如在biacore亲和力测定法中测量的。
[0185]
第10项：根据第1至9项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以低于200nm，优选低于90nm，更优选低于50nm，更优选低于20nm，更优选低于15nm的ec50结合cd3。
[0186]
第11项：根据第1至10项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以高于1nm，优选高于2nm，更优选高于4.1nm，更优选高于6nm，更优选高于8nm的ec50结合cd3。
[0187]
第12项：根据第1至11项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以低于200nm且高于1nm，优选地低于200nm且高于2nm，更优选地低于90nm且高于4.1nm，更优选低于20nm且高于6nm，更优选低于15nm且高于8nm的ec50结合cd3。
[0188]
第13项：根据第10至12项中任一项的双特异性abp，其中通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞术分析所述双特异性abp与cd3阳性细胞的结合来确定所述双特异性abp结合cd3的ec50；优选其中cd3阳性细胞是t细胞白血病细胞，优选jurkat细胞(如在acc 282下存放于dsmz)；和/或优选地，其中使用荧光标记的二抗检测结合；和/或其中在流式细胞术之前将所述双特异性abp与所述cd3阳性细胞温育约30分钟。
[0189]
第14项：根据第1至13项中任一项的双特异性abp，与非处理的对照相比，该双特异性abp在体外测定中将患有急性白血病的患者的白血病血液单个核细胞的增殖和/或存活力抑制至等于或小于50％，更优选等于或小于40％，更优选等于或小于30％，最优选等于或小于25％。
[0190]
第15项：根据第1至14项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp包含两个第一抗原结合位点。
[0191]
第16项：根据第1至15项中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp包含两个第二抗原结合位点。
[0192]
第17项：根据第1至16项中任一项的双特异性abp，其是抗体或抗体变体。
[0193]
第18项：根据第17项的双特异性abp，其中所述抗原结合域由抗体重链可变域和抗体轻链可变域组成。
[0194]
第19项：根据第1至18项中任一项的双特异性abp，其是四价且同二聚的双特异性抗体，其在每个单体中包含：(i)n端fab片段，其包含含有重链可变域和轻链可变域的可变区，其中所述可变区包含第一抗原结合位点；(ii)包含第二抗原结合位点的c端scfv片段，并且其中(i)和(ii)通过ch2和ch3域连接。
[0195]
第20项：根据第17至19项中任一项的双特异性abp，其中所述抗体中的所述ch2域的至少一个能够介导与fc受体结合的氨基酸残基是缺少或突变的。
[0196]
第21项：根据第1至20项中任一项的双特异性abp，其中所述第二抗原结合位点在c端至n端的方向上包含抗体重链可变域和抗体轻链可变域。
[0197]
第22项：一种能够结合人fms相关酪氨酸激酶3(flt3)的abp，其包含：(i)重链可变
域，其包含seq id no:01(sywmh)所示的cdrh1区，seq id no:02(eidpsdsykdynqkfkd)所示的cdrh2区(eidpsdsykdynqkfkd)和seq id no:03(aitttpfdf)所示的cdrh3区，或者其中在每种情况下，cdrh1、cdrh2和/或cdrh3独立地包含分别与seq id no:01，seq id no:02或seq id no:03相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的序列；或包含与seq id no:01,seq id no:02或seq id no:03具有至少75％序列同一性或至少80％，优选90％序列同一性的cdrh1,cdrh2或cdrh3序列；和(ii)轻链可变域，其包含seq id no:05(rasqsisnnlh)所示的cdrl1区，seq id no:06(yasqsis)所示的cdrl2区和seq id no:07(qqsntwpyt)所示的cdrl3区，或者其中在每种情况下，cdrl1、cdrl2和/或cdrl3独立地包含分别与seq id no:05，seq id no:06或seq id no:07相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的序列；或包含与seq id no:05,seq id no:06或seq id no:07具有至少75％序列同一性或至少80％序列同一性的cdrl1,cdrl2或cdrl3序列；其特征在于，所述重链可变域和所述轻链可变域各自包含人可变区框架序列。
[0198]
第23项：根据第22项的abp，其是根据第1
‑
21项中任一项的双特异性abp，并且其中在所述第一抗原结合域中包含在第22项中的(i)和(ii)的所述cdr区。
[0199]
第24项：根据第22或23项中任一项的abp，其中所述重链可变域人框架序列衍生自ighv1
‑
46，优选ighv1
‑
46*3，和/或其中所述重链可变域人框架序列衍生自igkv3d
‑
15。
[0200]
第25项：根据第24项的abp，其中所述重链可变区包含以下突变中的任何一个或它们的组合：k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,m48i,k57t,n60a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a和t108l，其中编号根据kabat系统。
[0201]
第26项：根据第24或25项的abp，其中所述轻链可变区包含以下突变中的任何一个或它们的组合：y49k，y87f和i55a，其中编号根据kabat系统。
[0202]
第27项：第1项的abp，其中所述重链可变区包含氨基酸序列，其与选自seq id no:15、17、19、21或23的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性，或在每种情况下独立地，任选地与这些序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4个，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失；和/或其中轻链可变区包含氨基酸序列，其与选自seq id no:16、18、20、22或24的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性，或在每种情况下独立地，任选地与这些序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4个，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失。
[0203]
第28项：根据第27项的abp，其中在所述重链可变区中，氨基酸位置16,18,19,20,22,48,57,60,69,70,75,76,78,80,81,87和108是如在seq id no:15、17、19、21或23的任一项中；和/或其中在所述轻链可变区中，氨基酸位置49、55和87是如在seq id no:16、18、20、22或24的任一项中；其中编号根据kabat系统。
[0204]
第29项：第1至28项中任一项的abp，其包含至少一个，优选两个第二抗原结合域，其中所述第二抗原结合域结合cd3，优选其中所述第二抗原结合域与所述第一抗体结合域的重链融合。
[0205]
第30项：根据第29项的abp，其中所述第二抗原结合域包含scfv片段，所述scfv片段包含氨基酸序列，其与选自seq id no:14,25,26和27的序列具有至少80％的序列同一性，或在每种情况下独立地，任选地与选自seq id no:14,25,26和27的序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4个，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失。
[0206]
第31项：根据第27项或第28项的abp，包括至少一个抗体重链，其包含氨基酸序列，
其与选自seq id no:28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72和74的序列具有至少80％的序列同一性，或与该序列相比具有不超过20、15、10、9、8、7、6、4个，优选3或2，优选不超过1个氨基酸取代，插入或缺失；和/或包括至少一个抗体轻链，其包含氨基酸序列，其与选自seq id no:29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73和75的序列具有至少80％的序列同一性，或与该序列相比具有不超过20、15、10、9、8、7、6、4个，优选3或2，优选不超过1个氨基酸取代，插入或缺失
[0207]
第32项：根据第31项的abp，其包含一个，优选两个抗体重链和一个优选两个抗体轻链，它们各自与以下相比具有至少80％序列同一性或者具有不超过20、15、10、9、8、7、6、4、优选3或2个，优选不超过1个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列：
[0208]
a.选自以下的序列：重链的seq id no:28和轻链的seq id no:29；
[0209]
b.选自以下的序列：重链的seq id no:30和轻链的seq id no:31；
[0210]
c.选自以下的序列：重链的seq id no:32和轻链的seq id no:33；
[0211]
d.选自以下的序列：重链的seq id no:34和轻链的seq id no:35；
[0212]
e.选自以下的序列：重链的seq id no:36和轻链的seq id no:37；
[0213]
f.选自以下的序列：重链的seq id no:38和轻链的seq id no:39；
[0214]
g.选自以下的序列：重链的seq id no:40和轻链的seq id no:41；
[0215]
h.选自以下的序列：重链的seq id no:42和轻链的seq id no:43；
[0216]
i.选自以下的序列：重链的seq id no:44和轻链的seq id no:45；
[0217]
j.选自以下的序列：重链的seq id no:46和轻链的seq id no:47；
[0218]
k.选自以下的序列：重链的seq id no:48和轻链的seq id no:49；
[0219]
l.选自以下的序列：重链的seq id no:50和轻链的seq id no:51；
[0220]
m.选自以下的序列：重链的seq id no:52和轻链的seq id no:53；
[0221]
n.选自以下的序列：重链的seq id no:54和轻链的seq id no:55；
[0222]
o.选自以下的序列：重链的seq id no:56和轻链的seq id no:57；
[0223]
p.选自以下的序列：重链的seq id no:58和轻链的seq id no:59；
[0224]
q.选自以下的序列：重链的seq id no:60和轻链的seq id no:61；
[0225]
r.选自以下的序列：重链的seq id no:62和轻链的seq id no:63；
[0226]
s.选自以下的序列：重链的seq id no:64和轻链的seq id no:65；
[0227]
t.选自以下的序列：重链的seq id no:66和轻链的seq id no:67；
[0228]
u.选自以下的序列：重链的seq id no:68和轻链的seq id no:69；
[0229]
v.选自以下的序列：重链的seq id no:70和轻链的seq id no:71；
[0230]
w.选自以下的序列：重链的seq id no:72和轻链的seq id no:73；
[0231]
x.选自以下的序列：重链的seq id no:74和轻链的seq id no:75；
[0232]
其中所述重链和轻链彼此配对。
[0233]
第33项：能够结合人flt3的abp或其抗原结合片段，其能够与根据第1至32项中任一项的abp的结合竞争。
[0234]
第34项：第1至33项中任一项的abp，其具有结合t细胞和表达flt3的肿瘤细胞的活性，优选地，其中所述抗体通过结合flt3和cd3增加t细胞向表达flt3的肿瘤细胞的募集。
[0235]
第35项：根据第1至34项中任一项的abp，其中包含第二结合域的抗体分子的重链可变区和轻链可变区是ucht1的重链可变区和轻链可变区。
[0236]
第36项：根据第1至35项中任一项的abp，其包含重链恒定区ch1至ch3，并且其中所述人ch2域的至少一个能够介导与fc受体结合的氨基酸残基是缺少或突变的。
[0237]
第37项：第1至36项中任一项的abp，其中abp是四聚体抗体分子或同二聚体且四价抗体分子。
[0238]
第38项：分离的核酸，其编码第1至37项中任一项的abp，或abp的抗原结合片段或单体。
[0239]
第39项：重组宿主细胞，其包含第38项的核酸。
[0240]
第40项：药物组合物，其包含：(i)第1至37项中任一项的abp，或(ii)第38项的核酸，或(iii)根据第39项的重组宿主细胞，以及药学上可接受的载体，稳定剂和/或赋形剂。
[0241]
第41项：用于医学中使用的组分，其中所述组分选自：第1至37项中任一项的abp，第38项的分离的核酸，根据第39项的重组宿主细胞和根据第40项的药物组合物。
[0242]
第42项：第41项的使用的组分，其中在医学上的使用是在治疗与表达flt3有关的增殖性疾病中的使用。
[0243]
第43项：第41或42项的使用的组分，其中所述组分用于增强t细胞介导的对flt3阳性肿瘤细胞的杀伤和/或抑制其增殖。
[0244]
第44项：根据第41至43项中任一项的使用的组分，其中所述组分用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病，其中所述增殖性疾病优选为癌症，其中所述癌症选自白血病，例如急性髓样白血病(aml)或急性成淋巴细胞性白血病(all)，或实体瘤，选自前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌，或鳞状细胞癌；优选地，所述癌症是白血病，例如aml或all。
[0245]
第45项：根据第44项的使用的组分，其中所述癌症与表达flt3的肿瘤细胞相关。
[0246]
附图和序列的简要描述
[0247]
图显示：
[0248]
图1描绘了用于构建本发明中描述的双特异性flt3xcd3抗体变体的fc减弱的iggsc形式。通过使用不同严格性的置换策略的cdr嫁接从flt3抗体4g8的v区人源化获得flt3抗原结合域(v1至v5)的变异。为了产生不同的cd3
‑
抗原结合域(v6至v9)，使用ucht1 scfv序列。
[0249]
图2显示cc
‑
2的重链和轻链的氨基酸序列。a：flt3(4g8)x cd3(人源化的hucht1)双特异性iggsc形式抗体分子的重链序列(seq id no:68)。重链包含4g8的小鼠重链(hc)可变区，igg1 ch1域，igg1铰链区，修饰的igg1 ch2域，igg1 ch3域和人源化cd3(ucht1)单链fv片段。b：显示flt3(4g8)xcd3(人源化hucht1)的kappa轻链的氨基酸序列(seq id no:69)。该轻链使seq id no:68的重链构建体完整，以分别形成嵌合4g8xucht1 iggsc和fabsc分子(见图1)。
[0250]
图3描绘了不同cc
‑
2变体与可溶性重组flt3蛋白的结合。将相应的抗体变体固定到包被有蛋白a的biacore芯片上，并使用biacore x仪(ge healthcare)确定his标记的重组flt3蛋白(sino biologicals)的结合。显示了flt3抗原结合域的各种突变变体(v1至v5)的结果。
[0251]
图4显示了cc
‑
2变体与表达flt3的nalm16细胞的结合。计算的ec50值在图3的相应条上指示。测试了flt3抗原结合域的突变变体(v1至v5)。
[0252]
图5描绘了使用本发明的各种不同的cc
‑
2构建体从aml患者的血液样品中消减白血病细胞。显示了flt3抗原结合域(v1至v5)的突变变体的比较。还指出了图3的biacore结果值和图4的流式细胞术ec50。
[0253]
图6显示了cc
‑
2变体与表达cd3的jurkat细胞的结合。计算的ec50值在图5的相应条上指示。测试了cd3抗原结合域的突变变体(v7至v9)。
[0254]
图7描绘了使用本发明的各种不同cc
‑
2构建体从aml患者的血液样品中消减白血病细胞。显示了cd3抗原结合域的突变变体(v7至v9)的比较。还指示了图6的流式细胞术ec50的值。
[0255]
图8描绘了在流式细胞术测定中通过不同cc
‑
2变体的t细胞活化和母细胞减少的结果。所使用的cc2变体在其flt3抗原结合域和cd3抗原结合域两者中是不同的(使用的抗体为v6
‑
v6(v6)；v6
‑
v9(v9)；v4
‑
v6(v4))。a：cd4阳性细胞减少；b：cd8阳性细胞减少；c：母细胞计数。
[0256]
图9描绘了在流式细胞术测定中通过cc
‑
2的不同变体对nalm16白血病细胞的消减。所使用的cc2变体在其flt3抗原结合域和cd3抗原结合域两者中是不同的(使用的抗体是v6
‑
v6(v6)；v6
‑
v8(v8)；v4
‑
v6(v4)；v6
‑
v7(v7))。
[0257]
图10描绘了cc
‑
2变体4在移植有原发性aml(a)或all(b)的免疫缺陷的nsg小鼠中的体内抗白血病活性。作为实例，显示了具有flt3抗原结合域v4(v4
‑
v6)的cc
‑
2变体。
[0258]
图11描绘了单特异性抗flt3抗体变体的抗体依赖性
[0259]
细胞毒性(antibody
‑
dependent cellular cytotoxicity)(adcc)。显示了通过2h batda
‑
铕细胞毒性测定测量在指定的flt3构建体或fc对照(各5μg/ml)存在下同种异体多克隆自然杀伤细胞(pnkc)对flt3 白血病细胞(sem；dsmz号acc 546)的特异性裂解。
[0260]
本发明的abp全部在序列表和下表1中描述：
[0261]
[0262]
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
实施例
[0276]
现在将通过实施例并且参考在此阐述的描述、附图和表来说明本发明的某些方面和实施方案。本发明的方法、用途和其他方面的此类实施例仅是代表性的，并且不应认为将本发明的范围仅限于此类代表性实施例。
[0277]
实施例显示：
[0278]
实施例1：重组双特异性flt3xcd3 abp(cc
‑
2)的产生
[0279]
使用4g8抗flt3抗体构建iggsc形式的重组双特异性abp(图1)，也就是说，以如下的顺序将小鼠flt3抗体4g8的可变域与cd3抗体ucht1的人恒定区和可变区融合。轻链的vl
‑
cl和重链的vh
‑
ch1
‑
ch2mod
‑
ch3
‑
scfv(ucht1)(见图1)。在这些abp中，flt3结合位点以fab2片段的形式存在，而cd3结合位点以scfv片段的形式存在(再次参见图1)。为了消除fcr结合，将以下修饰引入铰链区和ch2域(eu
‑
索引)中：e233p；l234v；l235a；δg236；d265g；；a327q；a330s(在这方面，也参见国际专利申请wo 2013/092001)。如国际专利申请wo 2013/092001中所述，将构建体克隆到源自pcdna3.1(invitrogen,thermo fisher)的表达载体中，并瞬时转染到cho细胞中。通过用蛋白a树脂(购自ge health care freiburg,germany)的亲和层析从转染细胞的上清液中纯化abp。所得的小鼠flt3xcd3双特异性抗体表示为v6
‑
v6。
[0280]
实施例2：人源化4g8抗体的产生
[0281]
通过将抗体4g8轻链的cdr区(意味着seq id no:5至seq id no:7的cdr环)嫁接到人κ轻序列igkv3
‑
15*01的(可变域)中将4g8抗flt3抗体人源化，所述人κ轻序列igkv3
‑
15*01以登录号m23090存放于imgt/ligm数据库中，另参见ichiyoshi y.,zhou m.,casali p.a human anti
‑
insulin igg autoantibody apparently arises through clonal selection from an insulin
‑
specific'germ
‑
line'natural antibody template.analysis by v gene segment reassortment and site
‑
directed mutagenesis'j.immunol.154(1):226
‑
238(1995)。进一步，将抗体4g8的重链的cdr区(意味着seq id no:01至seq id no:03的cdr环)纳入重链序列ighv1
‑
46*03的(可变域)中，所述重链序列ighv1
‑
46*03以登录号为l06612存放于imgt/ligm数据库中(另参见watson c.t.,et al.complete haplotype sequence of the human immunoglobulin heavy
‑
chain variable,diversity,and joining genes and characterization of allelic and copy
‑
number variation.am.j.hum.genet.92(4):530
‑
546(2013)。所得的人源化4g8用作本发明的突变分析/变体的基础。
[0282]
实施例3：本发明的双特异性flt3xcd3 abp(cc
‑
2)的变体的产生
[0283]
产生人源化4g8的flt3结合域的多个变体(v1至v5)。此外，源自人源化cd3抗体ucht1的cd3结合域scfv的多个公开变体(v7至v9)与本发明的flt3结合域变体以各种组合使用。鉴定以下具有特定技术效果的优选突变变体，所述特定技术效果对于使用此类人源化4g8变体是期望的(cdr带有下划线，并针对称为变体0或v0的人源化4g8 flt3抗原结合域中存在的相应重链和轻链指示突变)：
[0284]
人源化4g8 flt3可变区变体1(v1)
[0285]
重链可变区：
[0286]
突变:k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,k57t,n60a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a,t108l qvqlvqsgaevkkpggslrlscaasgytftsywmhwvrqapgqglewigeidpsdsytdyaqkfkdrvtisrdtskntlylqlsslraedtavyycaraitttpfdfwgqgtlvtvss.
[0287]
轻链可变区：
[0288]
突变:k49y,i55a
[0289]
eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsisnnlhwyqqkpgqaprlliyyasqsasgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyfcqqsntwpytfgggtkleik
[0290]
人源化4g8 flt3可变区变体2(v2)
[0291]
重链可变区：
[0292]
突变:k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,k57t,n60a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a,t108lqvqlvqsgaevkkpggslrlscaasgytftsywmhwvrqapgqglewigeidpsdsytdyaqkfkdrvtisrdtskntlylqlsslraedtavyycaraitttpfdfwgqgtlvtvss
[0293]
轻链可变区:
[0294]
eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsisnnlhwyqqkpgqaprllikyasqsisgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyfcqqsntwpytfgggtkleik
[0295]
人源化4g8 flt3可变区变体3(v3)
[0296]
重链可变区:
[0297]
突变:48i
[0298]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigeidpsdsykdynqkfkdrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycaraitttpfdfwgqgttvtvss
[0299]
轻链可变区:
[0300]
突变:k49y,i55a
[0301]
eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsisnnlhwyqqkpgqaprlliyyasqsasgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyfcqqsntwpytfgggtkleik
[0302]
人源化4g8 flt3可变区变体4(v4)
[0303]
重链可变区:
[0304]
突变:48i
[0305]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywmhwvrqapgqglewigeidpsdsykdynqkfkdrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycaraitttpfdfwgqgttvtvss
[0306]
轻链可变区:
[0307]
突变:49k,87f
[0308]
eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsisnnlhwyqqkpgqaprllikyasqsisgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyfcqqsntwpytfgggtkleik
[0309]
人源化4g8 flt3可变区变体5(v5)
[0310]
重链可变区:
[0311]
突变:k16g,v18l,k19r,v20l,k22a,m69i,t70s,t75k,s76n,v78l,m80l,e81q,s87a,t108l
[0312]
qvqlvqsgaevkkpggslrlscaasgytftsywmhwvrqapgqglewigeidpsdsykdynqkfkdrvtisrdtskntlylqlsslraedtavyycaraitttpfdfwgqgtlvtvss
[0313]
轻链可变区:
[0314]
eivmtqspatlsvspgeratlscrasqsisnnlhwyqqkpgqaprllikyasqsisgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyfcqqsntwpytfgggtkleik
[0315]
人源化ucht1 cd3 scfv变体1(v7)
[0316]
突变:n60a,q61d,k62s,d65g,k73d
[0317]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveikggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstyadsfkgrftisvddskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss
[0318]
人源化ucht1 cd3 scfv变体2(v8)
[0319]
突变:k73d
[0320]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveikggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvddskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss
[0321]
人源化ucht1 cd3 scfv变体3(v9)
[0322]
突变:轻链
–
重链替换(vl
‑
vh
→
vh
‑
vl):
[0323]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvdkskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveik
[0324]
使用以上变体创建双特异性abp形式，如上表1指示。
[0325]
实施例4：人源化4g8的flt3抗原结合域变体的结合亲和力。
[0326]
在图3中，使用可溶性重组flt3蛋白测试了如上指示的不同flt3结合域变体v1至v5的结合的解离常数。将相应的抗体变体固定到用蛋白a包被的biacore芯片上，并使用biacore x仪(ge healthcare)确定his标记的重组flt3蛋白(sino biologicals)的结合。结果列于表2：
[0327][0328]
此外，还使用抗体与其在细胞上表达的靶标的结合来测试抗体的结合亲和力。分析了cc
‑
2变体与表达flt3的nalm16细胞(图4)或表达cd3的jurkat细胞(图6)的结合。使用上面列出的插入序列瞬时转染cho细胞后，产生了v1至v9变体(v6为v6
‑
v6)。通过蛋白a亲和层析和尺寸排阻层析纯化抗体。v1至v5含有如上指示的flt3抗体的不同变体和相同的cd3结合抗体(ucht1变体，其以约10nm的ec50与cd3结合)。v6至v9包含以约1nm的ec50与flt3结合的亲本4g8抗体和不同的ucht1变体。为了测量与flt3和cd3结合的抗体，将nalm16(flt3 )和jurkat(cd3 )细胞与各自的变体温育30分钟，洗涤，并用山羊抗人fcγ特异性且pe缀合的二抗(jackson immuno research)染色，再次洗涤并通过流式细胞术(facscalibur，bd biosciences)进行分析。
[0329]
结论：如图3和4所示，如分别通过表面等离振子共振(biacore)和流式细胞术测量，变体5对flt3具有最高的结合亲和力，其次是v4。
[0330]
实施例5：不同flt3结合或cd3结合域变体从aml患者的血液样品中消减白血病细胞。
[0331]
通过密度梯度离心从急性白血病患者中获得外周血单个核细胞(pbmc)，与1μg/ml的指示的cc
‑
2变体温育5天，并使用facscanto
‑
ii(bd biosciences)通过流式细胞术进行分析。使用针对cd33，cd34或cd117的抗体鉴定白血病细胞。为了校准细胞数目，将限定量的补偿珠(bd biosciences)添加到每个样品中。从用来自两个不同供体的细胞进行的三个(v4，v5，v6，v9)和两个(v3)独立实验获得结果。所有值均与使用具有无关特异性的对照iggsc抗体获得的数据有关。flt3结合变体的结果显示在图5中，cd3结合变体的结果显示在图7中。
[0332]
结论：抗白血病活性最初遵循双特异性分子两侧的亲和力值。对flt3具有最高活性和亲和力的是v5。然而，令人惊讶的是，不太亲和的v4变体具有比其他变体显著更好的针
对白血病细胞的细胞毒性潜力，表明对于某些应用，可以选择flt3抗体的较低亲和力范围。对于cd3结合部分，观察到相似的结果。
[0333]
在图8和9中对不同抗体浓度分析t细胞活性和母细胞减少。获得了患者mm2的pbmc制剂，并与所示浓度的cc
‑
2变体一起温育。5天后，通过流式细胞术评估t细胞活化和白血病细胞的消减(图8)。将nalm16细胞与指定浓度的cc
‑
2变体以2:1的e:t比率温育3天，然后通过流式细胞术进行分析(图9)。
[0334]
实施例6：本发明的abp的体内抗白血病活性
[0335]
为了测试本发明cc
‑
2变体的体内应用，测试了flt3和cd3结合的优选变体在免疫缺陷小鼠模型中的治疗潜力(图10)。对免疫缺陷的nsg小鼠植入原代aml(左)或all(右)细胞。在第7天，注射pbmc以及cc
‑
2(v4
‑
v6)或对照抗体，并在第10天重复bsab治疗。在第17天，通过流式细胞术确定骨髓中的白血病负荷(比率hcd45

/mcd45

细胞)。
[0336]
结论：该实验证明了即使不太亲和的cc2变体，如v4也具有治疗潜力。
[0337]
本文中示例性描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素，一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括”，“包含”，“含有”等应被广泛地且不受限制地阅读。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制的术语，并且不意图使用此类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过示例性实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明所体现的发明进行修改和变型，并且这些修改和变型被认为在本发明的范围内。
[0338]
实施例7：单特异性igg形式的人源化4g8变体
[0339]
为了测试所产生的本发明抗体变体的优越性，将新的可变域序列克隆到单特异性抗flt3人igg形式中。为此，将相应的可变的重链和轻链序列克隆成单特异性人igg形式。为此，对抗体基因进行了密码子优化以在人细胞中表达，并在5’和3’末端设计了nhei和not限制性位点。合成基因，然后按照标准程序将其克隆到哺乳动物表达载体中。在序列验证后，使用plasmid plus纯化试剂盒(qiagen)制备足以进行转染的量的质粒。
[0340]
将hek 293(人类胚胎肾293)哺乳动物细胞传代至瞬时转染的最佳阶段。用表达载体瞬时转染细胞，并再培养6天。
[0341]
通过以4000rpm离心来收获培养物，并通过0.22mm的滤器过滤。第一步纯化通过镍亲和层析进行，使用含有400mm咪唑的pbs进行洗脱。纯化的第二步通过尺寸排阻层析进行，在ph7.2的pbs(磷酸盐缓冲盐水)中洗脱。通过uv分光法测定抗体浓度，并根据需要浓缩抗体。通过sds
‑
page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和hplc(高效液相层析)测定抗体纯度。使用在pbs中以0.2ml/min运行的mabpac尺寸排阻柱，在agilent 1100系列仪器上进行hplc。
[0342]
为了阐明产生的4g8变体的优越性，在adcc测定法中将具有v4变体的重链和轻链可变域序列(分别如seq id no:21和22所示的可变域重链和轻链序列)的单特异性igg与亲本(小鼠)igg v6(可变域重链和轻链序列分别如seq id no:4和8所示)和fc对照进行比较。为此，通过将非塑料粘附的pbmc与从圣犹达儿童研究医院(st jude's children's research hospital)获得的k562
‑
41bbl
‑
il15饲养细胞温育产生pnkc，如先前描述
(schmiedel bj et al.int j cancer 2011；128:2911
–
2922；fujisaki h et al.cancer res 2009；69:4010
–
4017)。如先前所述(baessler t et al.cancer res 2009:69:1037
‑
1045)进行batda
‑
铕杀伤。图11中显示了结果。
[0343]
图11中的数据显示了在指定的效应器:靶标比率下，1个pnkc供体的示例性结果。在该实验设置中可以观察到与v6 flt3单特异性igg抗体变体相比，v4的优越的裂解速率，因此证明了与亲本4g8抗体相比，本发明的变体的改善的治疗潜力。

技术特征：
1.一种能够结合人fms相关酪氨酸激酶3(flt3)的抗原结合蛋白(abp)，其包含：(i)一个，优选两个重链可变域，其包含seq id no:01(sywmh)所示的cdrh1区，seq id no:02(eidpsdsykdynqkfkd)所示的cdrh2区和seq id no:03(aitttpfdf)所示的cdrh3区，或者其中在每种情况下，cdrh1、cdrh2和/或cdrh3独立地包含分别与seq id no:01，seq id no:02或seq id no:03相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的序列；和(ii)一个，优选两个轻链可变域，其包含seq id no:05(rasqsisnnlh)所示的cdrl1区，seq id no:06(yasqsis)所示的cdrl2区和seq id no:07(qqsntwpyt)所示的cdrl3区，或者其中在每种情况下，cdrl1、cdrl2和/或cdrl3独立地包含分别与seq id no:05，seq id no:06或seq id no:07相比具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的序列；其特征在于，所述一个，优选两个重链可变域和所述一个，优选两个轻链可变域各自包含具有人抗体共有框架序列的至少部分的抗体框架区。2.根据权利要求1的abp，其中所述重链可变域人抗体共有框架序列衍生自ighv1
‑
46，优选ighv1
‑
46*3，和/或其中所述重链可变域人抗体共有框架序列衍生自igkv3d
‑
15。3.根据权利要求1或2的abp，其中所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自seq id no:15、17、19、21、23或76的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性或者在每种情况下独立地，任选地与这些序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失；和/或其中所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自seq id no:16、18、20、22、24或77的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性或者在每种情况下独立地，任选地与这些序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4，优选不超过3、2或1个氨基酸取代，插入或缺失。4.根据权利要求3的abp，其中在所述重链可变区中，氨基酸位置16、18、19、20、22、48、57、60、69、70、75、76、78、80、81、87和108是如在seq id no:15、17、19、21或23的任一项中；和/或其中在所述轻链可变区中，氨基酸位置49、55和87是如seq id no:16、18、20、22或24的任一项中；其中编号根据kabat系统。5.根据权利要求1至4中任一项的abp，其中所述重链可变区包含与seq id no:21所示的氨基酸序列具有至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与seq id no:22所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。6.根据权利要求1至4中任一项的abp，其中所述重链可变区包含与seq id no:76所示的氨基酸序列具有至少85％，至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与seq id no:77所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。7.根据权利要求1至6中任一项的abp，其中所述重链可变区包括48i，并且其中所述轻链可变区包括87f，其中编号根据kabat系统。8.根据权利要求7的abp，其中所述轻链可变区还包括49k，其中编号根据kabat系统。9.根据权利要求1至8中任一项的abp，其中所述abp是抗体或其抗原结合片段，其由至少一个，优选两个抗体重链序列，和至少一个，优选两个抗体轻链序列构成，其中所述抗体
重链序列和所述抗体轻链序列各自包含以下组合v0至v5之一中的可变区序列：。10.根据权利要求1至9中任一项的abp，其以小于50μm且大于50nm的k
d
结合所述flt3；优选地，其以小于1μm且大于300nm的k
d
结合所述flt3。11.根据权利要求1至10中任一项的abp，其以低于10nm且高于0.5nm的ec
50
结合表达flt3的人细胞。12.根据权利要求1至11中任一项的abp，其以低于5.5nm且高于4.5nm的ec
50
结合表达flt3的人细胞。13.根据权利要求1至12中任一项的abp，其包括效应器基团和/或其是标记的。14.根据权利要求1至13中任一项的abp，其是分离的和/或基本上纯的。15.根据权利要求1至14中任一项的abp，其是抗体，例如单克隆抗体；或者其是抗体的片段，例如单克隆抗体的片段。16.根据权利要求15的abp，其中所述抗体是嵌合抗体，例如人嵌合抗体。17.根据权利要求15或16的abp，其中所述抗体是igg、ige、igd、iga或igm免疫球蛋白；优选igg免疫球蛋白。18.根据权利要求15至17中任一项的abp，其是选自以下列表的抗体片段：fab，fab
’‑
sh，fv，scfv和f(ab’)2。19.根据权利要求1至18中任一项的abp，其中所述abp经修饰或工程化改造以增加抗体依赖性细胞性细胞毒性(adcc)，优选其中所述abp是无岩藻糖基化的。20.根据权利要求1至19中任一项的abp，其包含一个或多个另外的抗原结合域，其结合除所述flt3以外的抗原，例如存在于哺乳动物t细胞上的抗原，并且最优选人cd3。21.根据权利要求20的abp，其是双特异性的，并且优选地其包含两个结合flt3的结合位点和两个结合除所述flt3以外的抗原，例如存在于哺乳动物t细胞上的抗原，并且最优选结合人类cd3的结合位点。22.根据权利要求21的abp，其中所述两个结合除所述flt3以外的抗原的结合位点结合人cd3，并且优选包含ucht1抗cd3 scfv构建体，例如seq id no:14所示的scfv。23.根据权利要求22的abp，其包含两个抗体重链序列和两个抗体轻链序列，其中所述抗体重链序列和所述抗体轻链序列各自包含以下组合v0至v5的任一个中的氨基酸序列：
。24.一种抗原结合蛋白(abp)或其抗原结合片段，其能够结合人flt3并且能够与根据权利要求1至23中任一项的abp竞争与flt3的结合。25.一种双特异性抗原结合蛋白(abp)，其包含能够结合人fms样酪氨酸激酶3(flt3)抗原的第一抗原结合域和能够结合人分化簇3(cd3)抗原的第二抗原结合域，其中所述双特异性abp：a.根据通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞术分析所述双特异性abp与flt3阳性细胞的结合所测定，以低于10nm的ec
50
结合flt3；和b.根据通过使用荧光激活细胞分选(facs)装置的流式细胞仪分析所述双特异性abp与cd3阳性细胞的结合所测定，以低于200nm的ec
50
结合cd3。26.根据权利要求25的双特异性abp，其中所述双特异性abp以高于0.5nm的ec
50
结合flt3。27.根据权利要求25或26的双特异性abp，其中根据通过表面等离振子共振测量，所述双特异性abp以小于50μm的k
d
结合flt3。28.根据权利要求25至27中任一项的双特异性abp，其中所述双特异性abp以高于1nm的ec
50
结合cd3。29.根据权利要求25至28中任一项的双特异性abp，其与无关对照相比在体外测定法中将患有急性白血病的患者的白血病血液单个核细胞的增殖和/或存活力抑制至等于或小于50％。30.根据权利要求25至29中任一项的双特异性abp，其包含不超过且不少于两个第一抗原结合域和两个第二抗原结合域。31.根据权利要求25至30中任一项的双特异性abp，其中所述抗体中能够介导与fc受体结合的ch2域的至少一个氨基酸残基是缺少或突变的。32.根据权利要求25至31中任一项的双特异性abp，其中所述第一抗原结合域包含根据权利要求1至24中任一项的abp或其抗原结合域。33.根据权利要求25至32中任一项的双特异性abp，其具有结合t细胞和表达flt3的肿瘤细胞的活性，优选地其中所述抗体通过结合flt3和cd3增加t细胞向表达flt3的肿瘤细胞的募集。34.根据权利要求25至33中任一项的双特异性abp，其中所述第二抗原结合域包含
ucht1的重链可变区和轻链可变区。35.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1至24中任一项的abp或abp的抗原结合片段或单体，例如重链或轻链的序列，或编码根据权利要求25至34中任一项的双特异性abp的序列。36.一种核酸构建体(nac)，其包含权利要求35的核酸和一个或多个另外的序列特征，其允许在细胞中表达所编码的abp或双特异性abp或所述abp或双特异性abp的组分(例如抗体重链或轻链)。37.一种重组宿主细胞，其包含权利要求35的核酸或根据权利要求36的nac。38.一种药物组合物，其包含：(i)权利要求1至34中任一项的abp或双特异性abp，或(ii)权利要求35的核酸或根据权利要求36的nac，或(iii)根据权利要求37的重组宿主细胞和药学上可接受的载体、稳定剂和/或赋形剂。39.一种组分，其用于医学中，其中所述组分选自以下列表：权利要求1至34中任一项的abp或双特异性abp，权利要求35的分离的核酸或根据权利要求36的nac，根据权利要求37的重组宿主细胞和根据权利要求38的药物组合物。40.权利要求39使用的组分，其中所述组分用于增强t细胞介导的flt3阳性肿瘤细胞的杀伤和/或抑制flt3阳性肿瘤细胞的增殖。41.根据权利要求33至34使用的组分，其中所述组分用于诊断、预防和/或治疗增殖性疾病，其中所述增殖性疾病与表达flt3有关，并且优选为癌症，例如选自白血病，例如急性髓样白血病(aml)或急性成淋巴细胞性白血病(all)的癌症，或选自前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌，或鳞状细胞癌的实体瘤；优选地，所述癌症是白血病，例如aml或all。42.一种增强对表达人flt3的人细胞的细胞介导的免疫应答的方法，其包括在免疫细胞，例如t细胞或自然杀伤(nk)细胞的存在下使所述细胞与以下接触：权利要求1至24中任一项的abp，或权利要求25至34中任一项的双特异性abp，或编码根据权利要求35的所述abp或双特异性abp的核酸，从而增强针对所述人细胞的细胞介导的免疫应答。43.一种用于预防和/或治疗受试者中的增殖性病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求39中所述的组分；并且其中所述增殖性疾病的特征在于与所述增殖性病症相关的细胞中flt3的表达。
技术总结
本发明提供了具有改善的FLT3结合亲和力和/或抗肿瘤活性的新型人fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)抗原结合蛋白，例如抗体。本发明的FLT3抗体是通过亲本FLT3抗体的突变产生的，并在结合测定法中体外测试以及在小鼠肿瘤模型和人类患者肿瘤样品中体内测试。本发明的抗体以单特异性构建体或双特异性FLT3xCD3抗体形式提供，并显示出优异的靶亲和力和/或肿瘤细胞杀伤。本发明还涉及用于产生本发明的抗原结合蛋白的方法以及编码它们的核酸、表达它们的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及使用本发明的FLT3抗原结合蛋白(ABP)治疗或诊断疾病诸如白血病的方法。血病的方法。


技术研发人员：G.荣格 H.萨利 F.沃格特 L.泽克里-梅特雷夫 M.普夫卢格勒 I.埃尼斯
受保护的技术使用者：图宾根大学
技术研发日：2019.09.11
技术公布日：2021/6/29