水稻OsATL9基因在调控水稻抗性中的应用的制作方法

水稻osatl9基因在调控水稻抗性中的应用
技术领域
1.本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻osatl9基因在调控水稻抗性中的应用。


背景技术：

2.水稻是世界上重要的粮食作物，也是研究单子叶植物功能基因组学的模式植物。在自然生长条件下水稻经常会受到非生物逆境(干旱、低温)和生物逆境(稻瘟菌、白叶枯菌)的危害。
3.在北方特别是东北稻区，水稻生长期短，气温低，从播种到秋季成熟各生育阶段，随时都可能遭受低温危害。1949年以来，东北稻区水稻产量就受到了低温冷害的影响。2002年，黑龙江省东部三江平原遭受历史上70年未遇的混合型低温冷害，造成80万公顷水稻平均减产40％左右，严重的地块几乎绝产。在全球温度升高的大背景下，低温冷害的隐蔽性显著增强，在现实生产中，应充分重视低温冷害的危害性，在我国东北和西南等低温冷凉稻区尤其要加强防范。选育耐冻的水稻品种就显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于为改良水稻抗性提供一种新选择。
5.本发明的技术方案是水稻osatl9基因在调控水稻抗性中的应用。
6.具体的，所述水稻osatl9基因的核苷酸序列如seq id no.17所示。
7.其中，所述调控为正调控。
8.进一步，所述抗性为抗冷害性。
9.具体的，所述调控为调控水稻丙二醛含量、相对电导率和/或冷害相关基因表达水平。
10.优选的，所述冷害有关基因myb、cdpk7、fer1、trx23和lti6a。
11.本发明的下有益效果：本发明通过实验验证了水稻osatl9基因的功能。该基因的编码产物为一种e3泛素连接酶。采用病毒诱导的基因沉默的方法，发现沉默植株与对照植株相比，对冷害的抗性下降，这表明了osatl9正向调控了水稻对冷害逆境的耐性。并进一步研究发现，该调控是通过调节丙二醛含量、相对电导率和冷害相关基因表达水平。
附图说明
12.图1、冷冻处理下，osatl9基因的表达量的变化；ck为对照，cold为冷冻处理。
13.图2、冷害处理后，bmv:osatl9植株降低对冷害的耐性。(a)遭受冷害后，bmv:osatl9沉默植株和对照植株的表型，bmv:00就是指对照植株，也就是该基因没有沉默的植株；bmv：osatl9指的是该基因沉默的植株；左边的图指的是，在没有遭受冷害时，bmv:osatl9沉默植株和对照植株无明显差异，右边的图表示，在遭受了冷害后，恢复6天后，bmv:osatl9沉默植株的恢复率比对照低(b)bmv:osatl9沉默植株中，osatl9基因的沉默效率；
(c)冷害逆境下，bmv:osatl9沉默植株和对照植株的存活率；(d)正常(normal)和冷害(cold)逆境下，bmv:osatl9沉默植株和对照植株的叶绿素含量。
14.图3、bmv:osatl9沉默植株通过调控丙二醛和相对电导率来调控对冷害逆境的耐性。(a)正常和冷害逆境下，bmv:osatl9沉默植株和对照植株中丙二醛的含量；(b)正常和冷害逆境下，bmv:osatl9沉默植株和对照植株中相对电导率。
15.图4、正常(nor)和冷害(cold)处理下，bmv:osatl9沉默植株和对照植株中冷害相关基因的表达情况。
具体实施方式
16.下述实施例中用到的主要实验材料与方法：
17.1、植物材料
18.所采用的水稻品种为原丰早和ir64，“原丰早”用于冷害逆境处理的表达分析；ir64用于病毒诱导的基因沉默(vigs)。
19.2、主要实验试剂
20.trizol试剂购买于thermofisher，实时荧光定量pcr(qrt
‑
pcr)相关的试剂购买于takara公司。其他常规的试剂购买于北京鼎国生物技术有限责任公司。
21.3、植物种植方法
22.水稻(oryza sativa)品种原丰早经过催芽后种植在塑料营养钵(直径8cm，高10cm，每盆播种10株)，置于培养箱中培养。幼苗的生长条件是：28℃，16h光照/8h黑暗。一周龄的水稻幼苗用冷害处理。
23.水稻品种ir64将水稻种子播种于塑料营养钵中，每钵播种5株，生长温度控制在22～24℃，光周期为14h/10h。待植株生长10～14天时，用于vigs侵染实验。
24.4、实施例中用到的引物见表1。
25.表1实施例中用到的引物
26.[0027][0028]
实施例1基因的表达模式分析
[0029]
冷害胁迫采用三周龄左右的“原丰早”水稻放置于4℃光照培养箱中，冷害处理后0、6、12和24h取样，液氮速冻后于
‑
80℃保存备用。
[0030]
总rna的提取采用trizol的方法，具体操作如下：取叶片在液氮中充分研(研磨要迅速，最好不要超过1分钟)；然后将研磨号的粉末装入离心管中；每使用1ml trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4℃，10000rpm离心10～15分钟；把水相转移到新管中并加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20～30分钟；4℃，10000rpm离心10分钟，去上清；加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀(每使用1ml trizol至少用1ml 75％乙醇对沉淀进行洗涤)；4℃，5000rpm离心3分钟，倒出液体；室温放置晾干，根据实验需要，加入30～100μl无rnase水，溶解rna。按照takara反转录试剂盒说明先去除rna中dna的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cdna。qrt
‑
pcr反应采用sybr green i作为反应荧光染料。反应在cfx96tm real
‑
time system(bio
‑
rad,hercules,ca,usa)仪器中进行。以水稻actin基因作为内参基因，检测osatl9基因的表达量。扩增actin基因的引物为表1中seq id no.1和seq id no.2，扩增osatl9基因的引物为表1中seq id no.3和seq id no.4。扩增体系：fast essential dna green master(2
×
)12.5μl，引物1(10μm)0.5μl，引物2(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，ddh2o(双蒸水)补足至25μl。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。
[0031]
osatl9基因的表达受到了冷害逆境的诱导：冷害逆境下，osatl9基因的表达受到了强烈的诱导。冷害6h后，osatl9基因的表达量显著增加，且在测定范围内，持续增加(图1)。
[0032]
实施例2基因沉默vigs载体的构建
[0033]
水稻osatl9基因的系统座位标识码为os05g01940(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。该基因的核苷酸序列如seq id no.17所示，其编码蛋白的氨基酸序列seq id no.18所示。基因沉默表达载体bmv载体由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供。
[0034]
采用表1中seq id no.15和seq id no.16为引物，以水稻基因组dna为模板，扩增osatl9基因，并将其连接到t/a克隆载体pmd19上。经测序验证正确后，以pmd19
‑
osatl9质粒为模板，用特异性引物seq id no.15和seq id no.16进行pcr扩增。pcr产物经l％琼脂糖胶
电泳后，采用dna gel purification kit(sangon,shanghai,china)回收目标条带，用ncoi和avrⅱ(购于neb公司)双酶切回收的目标片段和沉默载体bmv，在37℃温浴4h，酶切的体系分别为：4μl buffer，1.5μl ncoi，1.5μl avrⅱ，10μl bmv载体质粒或者目标片段，添加水补充至40μl。酶切后回收载体质粒或者目标片段，16度t4(takara)连接酶过夜连接，连接体系为：1μl连接缓冲液，1μl t4连接酶，2μl酶切后回收的载体质粒，6μl酶切后回收的目标片段。42℃热击转化大肠杆菌jm109(含50mg/l的卡那霉素的lb平板筛选)，挑取单菌落进行菌落pcr鉴定进行初筛，最终提取质粒进行测序验证，并命名为bmv:osatl9。经电击法将所述沉默表达载体bmv:osatl9转入农杆菌。挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，选取阳性菌斑，在液体培养基中培养，获得农杆菌菌液，
‑
80℃保存备用。
[0035]
实施例3 vigs沉默植株的获得
[0036]
取实施例2得到的于
‑
80℃保存的菌株，在含有50mg/l kan的yep固体养基上28℃划线培养2～3d；挑取单克隆于含抗生素的50ml yep培养基中，250rpm，28℃培养，使菌液浓度达到od
595
为1.0，将分别含有bmv:osatl9和病毒粒子p1300m/rna1 2(该病毒粒子可帮助携带基因的病毒载体在植物体内的移动，由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供)农杆菌液等体积混合。对照组使用分别含bmv和p1300m/rna1 2的农杆菌混合液。混合后农杆菌菌液4000rpm离心10min，去上清，并用等体积的诱导缓冲液重悬，28℃培养3h后，添加100μm乙酰丁香酮(as)，0.4g/l l
‑
半胱氨酸，0.15g/l二巯基苏糖醇(dtt)，0.75mg/l硝酸银。诱导缓冲液配方：10mm 2
‑
吗啉乙磺酸(mes)，10mm mgcl2，200μm乙酰丁香酮(as)。
[0037]
将生长两周的幼苗倒置于农杆菌浸入缓冲液中，进行抽真空处理。真空压力为
‑
4000pa，侵染时间为7min。侵染完后，将缓冲液叶面喷施于幼苗，将幼苗置于24/22℃(白天/黑夜)，14h光照/10h黑暗的培养箱内培养。
[0038]
参照实施例1中的方法提取总rna样品。按照takara反转录试剂盒说明先去除rna中dna的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cdna。qrt
‑
pcr反应采用sybr green i作为反应荧光染料。反应在cfx96tm real
‑
time system(bio
‑
rad,hercules,ca,usa)仪器中进行。用qrt
‑
pcr检测基因的沉默效率。以水稻actin基因作为内参基因，检测osatl9基因的表达量。扩增actin基因的引物为表1中seq id no.1和seq id no.2，扩增osatl9基因的引物为表1中seq id no.3和seq id no.4。扩增体系：fast essential dna green master(2
×
)12.5μl，引物1(10μm)0.5μl，引物2(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，ddh2o(双蒸水)补足至25μl。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。
[0039]
结果见图2b，从图中可以看出osatl9基因在bmv:osatl9沉默植株中的沉默效率约为60％。
[0040]
实施例4水稻osatl9基因在调控水稻抗冷害性中应用
[0041]
将30天苗龄的沉默植株和对照植株移到4℃培养箱(光照条件为14h/10h的光周期)放置2天，然后在25℃条件下恢复生长6天，测定植株的存活率，叶绿素含量，mda含量，电导率和抗冷害基因表达情况。
[0042]
叶绿素含量的测定：称取水稻叶片0.2g左右，液氮研磨后将粉末置于含有5ml 80％丙酮溶液中，混合均匀并静置过夜，4℃(4000rpm)离心20min，取上清，以80％丙酮溶液为空白对照测定663nm和645nm波长下的吸光度值。叶绿素含量根据公式[8.02
×
a663
20.20
×
a645]
×
v/1000
×
w。v是提取液体积；w是样品鲜重。
[0043]
丙二醛(mda)含量的测定：称取水稻叶片组织0.5g，放入研钵中经液氮研磨充分，将粉末转移到含5ml无菌水的离心管中，再向离心管中加入0.5％的tba 5ml使得总体积为10ml。沸水浴煮沸10min，静置冷却后离心10min(4000rpm)。测定上清液在532nm和600nm处的吸光度值。单位鲜重组织mda含量c(μmol/g)根据公式a532
‑
a600＝155000
×
c
×
l算的，其中l为比色杯厚度(cm)。
[0044]
相对电导率的测定：称取0.2g
‑
0.5g左右水稻叶片，用自来水清洗数遍，后用蒸馏水清洗，用滤纸吸干表面水分，置于含10ml去离子水试管中，盖上试管塞置于室温静置12h，测定其电导率r1，在将试管置于沸水浴中煮沸30min，冷却至室温，再次测定电导率r2，相对电导率为r1/r2
×
100％。
[0045]
bmv:osatl9沉默植株，与对照植株相比，对冷害的抗性降低：沉默植株和对照植株同时转移到同一个容器，容器的一侧种上沉默植株，另一侧则种上对照植株。恢复生长10天后转入4℃2天，后转移到正常的生长情况，10天后观察现象。osatl9确实沉默的植株，与对照植株相比，对冷害的抗性降低。与对照植株相比，bmv:osatl9沉默植株的存活率下降，叶绿素含量减少(图2)，这些都表明osatl9正向调控对冷害的耐性。
[0046]
osatl9沉默调控了丙二醛含量和电导率：冷害逆境下，检测bmv:osatl9沉默植株和对照植株体内的丙二醛含量和相对电导率结果显示，干旱条件下，bmv:osatl9沉默植株体内的丙二醛含量(图3a)和相对电导率(图3b)比对照植株显著增加。这表明了osatl9沉默会增加植株体内丙二醛含量和相对电导率。
[0047]
参照实施例1中的方法提取总rna样品。按照takara反转录试剂盒说明先去除rna中dna的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cdna。qrt
‑
pcr反应采用sybr green i作为反应荧光染料。反应在cfx96tm real
‑
time system(bio
‑
rad,hercules,ca,usa)仪器中进行。
[0048]
以水稻actin基因作为内参基因，对已报道的跟冷害有关基因myb、cdpk7、fer1、trx23和lti6a的表达量进行检测。扩增actin的引物为表1中seq id no.1和seq id no.2，扩增myb、cdpk7、fer1、trx23和lti6a的引物为表1中seq id no.5～14。扩增体系：fast essential dna green master(2
×
)12.5μl，引物1(10μm)0.5μl，引物2(10μm)0.5μl，cdna模板0.5μl，ddh2o(双蒸水)补足至25μl。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。
[0049]
如图4所示，冷害逆境条件下，bmv:osatl9沉默植株，与对照植株相比，抑制了冷害相关基因的表达情况。这些都表明了osatl9沉默降低对冷害的逆境的耐性，是通过对冷害反应基因表达的调控来实现的。

技术特征：
1.水稻osatl9基因在调控水稻抗性中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻osatl9基因的核苷酸序列如seq id no.17所示。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控为正调控。4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗性为抗冷害性。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调控为调控水稻活丙二醛含量、相对电导率和/或冷害相关基因表达水平。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述冷害有关基因myb、cdpk7、fer1、trx23和lti6a。
技术总结
本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsATL9基因在调控水稻抗性中的应用。本发明的目的在于为改良水稻抗性提供一种新选择。本发明的技术方案是水稻OsATL9基因在调控水稻抗性中的应用。本发明通过实验验证了水稻OsATL9基因的功能。该基因可正向调控水稻对冷害逆境的耐性。并进一步研究发现，该调控是通过调节丙二醛含量、相对电导率和冷害相关基因表达水平。表达水平。表达水平。


技术研发人员：张慧娟 蒋明
受保护的技术使用者：台州学院
技术研发日：2021.04.06
技术公布日：2021/6/29