一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用。


背景技术：

2.泛酸是b族维生素，辅酶a的主要原料，参与人体和动物体内的重要代谢，包括脂肪酸降解与合成、柠檬酸循环、胆碱乙酰化、抗体的合成，促进营养物质的吸收和利用。泛酸不稳定，其商品形式主要以d
‑
泛酸钙(右旋体)形式存在，d
‑
泛酸钙广泛用于医药、食品、饲料工业，尤其是作为食品和饲料添加剂的需求量巨大。
3.d
‑
泛解酸内酯是制造d
‑
泛酸的重要手性中间体，获得d
‑
泛解酸内酯的方法主要包括化学拆分法和微生物酶法。其中化学方法拆分法因成本高、产量小、分离困难、产品光学纯度差等缺点而逐渐式微。
4.微生物酶法拆分最常用的是利用产d
‑
泛解酸内酯酶的微生物选择性水解dl
‑
泛解酸内酯中的d
‑
泛解酸内酯得到d
‑
泛解酸，再将d
‑
泛解酸进行内酯化生成d
‑
泛解酸内酯，该方法因水解时间短，且未水解的l
‑
泛解酸内酯可加碱消旋后可再利用，而成为目前的主流方法。此法最早由日本的fuji公司申请专利[us5275949]，并在日本第一制药公司全球率先实现工业化生产，国内浙江鑫富生化股份有限公司[cn1313402a、cn1793321a]、浙江新和成股份有限公司[cn108004291a]等也都采用了同样的工艺路线。
[0005]
目前世界30％的d
‑
泛酸盐是通过酶催化过程产生，其中镰孢菌属因其良好的催化性能而应用广泛，例如尖镰孢霉菌(fusarium oxysporum)、串珠镰孢霉菌(fusarium moniliforme)以及轮枝镰孢菌(fusarium verticillioides)，提高其酶活主要是通过传统诱变方式及培养基优化。随着分子生物学技术的发展，d
‑
泛解酸内酯水解酶在基因工程领域的研究也有了较大进步，1998年日本kobayashi等对尖镰孢霉菌aku 3702菌株中的d
‑
泛解酸内酯水解酶基因进行研究，首次报道其核苷酸及氨基酸序列，并将该酶基因与载体连接后转入大肠杆菌进行表达[michihiko kobayashi等,1998]；2005年报道的文献中kohsuke honda等人进一步将该基因在米曲霉中进行表达，湿菌体4h可将20％(w/v)dl
‑
泛解酸内酯溶液中的d型内酯转化为d
‑
泛解酸，转化率为49.9％[kohsuke honda等，2005]；江南大学报道的专利cn1597962a将d
‑
泛解酸内酯水解酶基因进行密码子优化后构建成重组表达质粒，转化至大肠杆菌或酿酒酵母中进行过表达，重组大肠杆菌酶活力达37
‑
41u/g，重组酿酒酵母酶活力达60
‑
64u/g；专利cn109456908a将来源于串珠镰孢霉菌cgmcc 0536菌株的d
‑
泛解酸内酯水解酶的编码基因转入乳酸克鲁维酵母细胞，获得产酶菌株，酶活3
‑
5u/ml。
[0006]
然而，现有技术中的d
‑
泛解酸内酯水解酶还不足以满足工业生产的需求，本领域需要开发新的酶活更高的d
‑
泛解酸内酯水解酶。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用。尤其是提供基因定点突变提高酶活的菌株优化方法。提供产酶菌株发酵培养、固定化、包埋方法以及酶活测定方法及其应用。
[0008]
在本发明的第一方面，提供了一种突变型泛解酸内酯水解酶，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的选自下组的一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：第127位、第128位、第129位、第130位和第132位。
[0009]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第127位、第128位、第129位、第130位和第132位发生突变。
[0010]
在另一优选例中，所述突变还包括选自下组的一个或多个位点：第62位、第63位、第73位和第74位。
[0011]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第62位、第63位、第73位、第74位、第127位、第128位、第129位、第130位和第132位发生突变。
[0012]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的第127位、第128位、第129位、第130位和第132位发生突变。
[0013]
在另一优选例中，所述第127位氨基酸残基发生突变是由k突变为t或s。
[0014]
在另一优选例中，所述第128位氨基酸残基发生突变是由k突变为r、q或n。
[0015]
在另一优选例中，所述第129位氨基酸残基发生突变是由d突变为e。
[0016]
在另一优选例中，所述第130位氨基酸残基发生突变是由e突变为a、v、l或i。
[0017]
在另一优选例中，所述第132位氨基酸残基发生突变是由k突变为t或s。
[0018]
在另一优选例中，所述突变选自下组：k127t、k128r、d129e、e130a和k132t。
[0019]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，对应于seq id no:1所示氨基酸序列发生以下突变：k127t、k128r、d129e、e130a和k132t。
[0020]
在另一优选例中，所述第62位氨基酸残基发生突变是由k突变为q或n。
[0021]
在另一优选例中，所述第63位氨基酸残基发生突变是由d突变为n、q、h、k或r。
[0022]
在另一优选例中，所述第73位氨基酸残基发生突变是由d突变为e。
[0023]
在另一优选例中，所述第74位氨基酸残基发生突变是由t突变为s。
[0024]
在另一优选例中，所述突变还包括k62q、d63n、d73e和/或t74s。
[0025]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，对应于seq id no:1所示氨基酸序列发生以下突变：k62q、d63n、d73e、t74s、k127t、k128r、d129e、e130a和k132t。
[0026]
在另一优选例中，所述野生型泛解酸内酯水解酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
[0027]
在另一优选例中，所述的野生型泛解酸内酯水解酶来源于fusarium moniliforme
或fusarium oxysporum，优选为fusarium moniliforme。
[0028]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。
[0029]
在另一优选例中，所述突变型s
‑
氰醇裂解酶中突变位点的数量为1
‑
20个，优选为3
‑
10个，更优选为5
‑
9个。
[0030]
在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶的活性是野生型泛解酸内酯水解酶的至少1.2倍，优选地至少1.3倍；更优选地至少1.5倍。
[0031]
在另一优选例中，所述的活性是指泛解酸内酯水解酶水解d
‑
泛解酸内酯的活性。
[0032]
在另一优选例中，所述的活性是指泛解酸内酯水解酶改变dl
‑
泛解酸内酯水溶液的旋光值的能力。
[0033]
在另一优选例中，其特征在于，所述突变型泛解酸内酯水解酶的氨基酸序列如seq id no:2或3所示。
[0034]
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述多核苷酸分子编码本发明第一方面所述的突变型泛解酸内酯水解酶。
[0035]
在另一优选例中，所述核酸分子选自下组：
[0036]
(a)编码如seq id no:2或3所示蛋白的核酸分子；
[0037]
(b)序列如seq id no:7或8所示的核酸分子；
[0038]
(c)核苷酸序列与seq id no:7所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码seq id no:2所示蛋白的多核苷酸；
[0039]
或者，核苷酸序列与seq id no:8所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码seq id no:3所示蛋白的多核苷酸。
[0040]
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cdna序列、rna序列、或其组合。
[0041]
在另一优选例中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。
[0042]
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变蛋白的orf的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6his)、核定位信号(nls)或其组合。
[0043]
在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的orf序列操作性连接的启动子。
[0044]
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
[0045]
在另一优选例中，所述的启动子为p43启动子。
[0046]
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
[0047]
在另一优选例中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体。
[0048]
在另一优选例中，载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体，优选地，本发明中的载体是质粒。
[0049]
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子。
mu9片段及p43片段为模板，引物p43(bamhi)f/lac(xbai)r进行扩增得到p43
‑
lacton mu9。
[0071]
用限制性内切酶bamhi/xbai酶切载体pht01和p43
‑
lacton mu9片段，连接并转化至e.coli dh10b感受态细胞中，鉴定得到阳性克隆。
[0072]
将pht01
‑
p43
‑
lacton mu9质粒转入宿主细胞枯草芽孢杆菌ar感受态中获得基因工程菌。
[0073]
所述发酵培养基的组成为：蛋白胨0
‑
20g/l、酵母粉0
‑
10g/l、氯化钠0
‑
20g/l、葡萄糖0
‑
50g/l、氯化钙0
‑
5g/l、氯霉素20mg/l、消泡剂1ml/l。补料培养基：500g/l一水合葡萄糖。
[0074]
所述培养条件为：培养温度30℃
‑
32℃，溶氧维持30％，发酵周期46
‑
48h。
[0075]
在本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的突变型泛解酸内酯水解酶、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的酶制剂的用途，用于制备d
‑
泛解酸内酯。
[0076]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0077]
图1显示了puc57
‑
lacton/puc57
‑
lacton mu5/puc57
‑
lacton mu9质粒的构建。
[0078]
图2显示了pht01
‑
lacton/pht01
‑
lacton mu5/pht01
‑
lacton mu9质粒的构建。
[0079]
图3显示了定点突变的lacton mu5和lacton mu9突变体与fusarium oxysporum和fusarium moniliforme来源d
‑
泛解酸内酯水解酶的部分序列比对结果。
具体实施方式
[0080]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种酶活显著提高的泛解酸内酯水解酶突变体菌株。具体地，本发明将d
‑
泛解酸内酯水解酶基因通过定点突变、筛选获得比出发菌株具有更高酶活的突变体菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9，涉及到的d
‑
泛解酸内酯水解酶的氨基酸突变位点有九个，分别为：k62q、d63n、d73e、t74s、k127t、k128r、d129e、e130a、k132t。该酶通过固定化、包埋后获得的菌球可将底物dl
‑
泛解酸内酯280g/l中的d
‑
泛解酸内酯完全水解为d
‑
泛解酸，转化率＞48％，菌球套用20次酶活仍达到湿菌体酶活75％以上，更优可达84.7％。
[0081]
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
[0082]
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括dna、rna或者其杂交体，可以是双链或单链的。
[0083]
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列(例如，seq id no:2
‑
3、7
‑
8)的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：computational molecular biology[计算分子生物学](lesk,a.m.编辑)oxford university press[牛津大学出版社],纽约(1988)；biocomputing:informatics and genome projects[生物运算：
信息学和基因组项目](smith,d.w.编辑)academic press[学术出版社],纽约(1993)；computer analysis of sequence data,part i[序列数据的计算机分析，第i部分](griffin,a.m.和griffin,h.g.编辑)humana press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；sequence analysis in molecular biology[分子生物学中的序列分析](von heinje,g.编辑)academic press[学术出版社](1987)；以及sequence analysis primer[序列分析引物](gribskov,m.和devereux,j.编辑)stockton press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。
[0084]
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cdna或mrna，作为在具有限定的核苷酸序列(即rrna，trna和mrna)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
[0085]
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
[0086]
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。
[0087]
术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。
[0088]
术语“axxb”表示第xx位的氨基酸a变为氨基酸b，例如k127t表示第127位的k变为t，k128r表示第128位的k变为氨基酸r，以此类推。
[0089]
如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
[0090]
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
[0091]
术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链dna的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。
[0092]
术语“野生型泛解酸内酯水解酶”指的是所述泛解酸内酯水解酶突变体所来源的多肽，在优选的实施方式中，所述野生型泛解酸内酯水解酶是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或蛋白质(多肽)，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(pcr)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型泛解酸内酯水
解酶的氨基酸序列，例如seq id no:1所示，所述野生型泛解酸内酯水解酶的来源没有特别限制，优选的来源为fusarium moniliforme，但不限于此。
[0093]
术语“突变的泛解酸内酯水解酶蛋白”、“突变型泛解酸内酯水解酶蛋白”、“突变型泛解酸内酯水解酶”、“突变的泛解酸内酯水解酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”、“本发明蛋白”等可互换使用。优选地，所述突变蛋白在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的选自下组的一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：第127位、第128位、第129位、第130位和第132位。
[0094]
例如，本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的突变多肽除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型泛解酸内酯水解酶蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
[0095]
保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。
[0096]
表a
[0097]
最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)serser
trp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
[0098]
如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的n和/或c末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型泛解酸内酯水解酶蛋白的n和/或c末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段(比如含有本发明突变位点的氨基酸片段)，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。
[0099]
在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型泛解酸内酯水解酶蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型泛解酸内酯水解酶蛋白的生物学活性。例如，突变型泛解酸内酯水解酶蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的n和/或c末端缺失了一个或多个(例如1
‑
50个、1
‑
25个、1
‑
10个或1
‑
5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。
[0100]
此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
[0101]
本发明还提供编码所述突变型泛解酸内酯水解酶的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。优选的所述突变型泛解酸内酯水解酶如seq id no:2
‑
3所示。本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。
[0102]
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。
[0103]
可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。
[0104]
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含泛解酸内酯水解酶突变多肽编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、
体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0105]
本发明还提供了包含本发明泛解酸内酯水解酶突变多肽编码核酸序列、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞，优选为枯草芽孢杆菌。
[0106]
本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或ti
‑
质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、deae
‑
葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。
[0107]
在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。
[0108]
本发明序列表中涉及的序列如下表b所示。
[0109]
表b
[0110]
[0111][0112]
本发明的主要优点包括：
[0113]
(a)枯草芽孢杆菌作为宿主背景清晰且研究透彻，无内毒素及致病原，是fda认证的gras(general ly recognized as safe)生物安全菌株，可用于食品级和医药级产品的生产。
[0114]
(b)培养基成分简单易得、无需昂贵的诱导剂诱导表达，成本低，发酵周期短。
[0115]
(c)对生物酶固定化后制粒，解决了酶的重复利用问题以及存储问题，为工业化生产降低了成本。
[0116]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0117]
实施例1
[0118]
产d
‑
泛解酸内酯水解酶的基因工程菌ar/pht01
‑
p43
‑
lacton的构建1.合成克隆载体puc57
‑
lacton：
[0119]
参考fusarium oxysporum(尖镰孢霉菌，genbank:ab010465)及fusarium moniliforme(串珠镰孢霉菌，genbank:ay728018)菌株的d
‑
泛解酸内酯水解酶基因，核苷酸序列分别如seq id no:4和5所示。将核苷酸序列提交至苏州金唯智生物科技有限公司，进行密码子优化，合成克隆载体puc57
‑
lacton。优化后的序列如序列seq id no:6所示，对应
的氨基酸序列如序列seq id no:1所示。
[0120]
2.构建表达载体pht01
‑
p43
‑
lacton
[0121]
扩增p43启动子、lacton序列，通过overlap获得p43
‑
lacton，将载体pht01与p43
‑
lacton分别用bamhi、xbai进行酶切，连接，转化至e.coli dh10b，在氨苄青霉素抗生素100mg/l的平板37℃培养过夜，筛选获得阳性克隆。
[0122]
表1扩增引物
[0123][0124]
3.构建d
‑
泛解酸内酯酶枯草芽孢杆菌表达菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton
[0125]
pht01
‑
p43
‑
lacton质粒电转化至实验室保藏的枯草芽孢杆菌ar感受态细胞中，在含20mg/l氯霉素抗性平板上37℃过夜培养，验证筛选阳性克隆，获得d
‑
泛解酸内酯酶枯草芽孢杆菌表达菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton。
[0126]
实施例2
[0127]
产d
‑
泛解酸内酯水解酶的基因工程菌ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu5的构建1.构建克隆载体puc57
‑
lacton mu5：
[0128]
以质粒puc57
‑
lacton为模板，引物lac
‑
mutf1/lac
‑
mutr1(序列见表9)，pcr扩增进行定点突变，回收后的扩增产物用dpni酶37℃消化1h，转至ecoli xl1blue感受态细胞中，在氨苄青霉素抗生素100mg/l的平板37℃培养过夜，筛选获得阳性克隆，具体核苷酸序列见序列seq id no:7，对应氨基酸序列见序列seq id no:2。
[0129]
2.构建表达载体pht01
‑
p43
‑
lacton mu5
[0130]
扩增p43启动子、lacton序列，通过overlap获得p43
‑
lacton mu5，将载体pht01与p43
‑
lacton mu5分别用bamhi、xbai进行酶切，连接，转化至e.coli dh10b感受态细胞，在氨苄青霉素抗生素100mg/l的平板37℃培养过夜，筛选鉴定获得阳性克隆。
[0131]
表2扩增引物
[0132][0133]
3.构建d
‑
泛解酸内酯酶枯草芽孢杆菌表达菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu5
[0134]
将pht01
‑
p43
‑
lacton mu5质粒电转化至实验室保藏的枯草芽孢杆菌ar感受态细胞中，在含20mg/l氯霉素抗性平板上37℃过夜培养，筛选获得阳性克隆，即d
‑
泛解酸内酯酶枯草芽孢杆菌表达菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu5。
[0135]
实施例3
[0136]
产d
‑
泛解酸内酯水解酶的基因工程菌ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9的构建
[0137]
1.构建克隆载体puc57
‑
lacton mu9：
[0138]
以质粒puc57
‑
lacton mu5为模板，引物lac
‑
mutf2/lac
‑
mutr2(序列见表9)，pcr扩增进行定点突变，回收后的扩增产物用dpni酶37℃消化1h，转至ecoli xl1 blue感受态细胞中，在氨苄青霉素抗生素100mg/l的平板37℃培养过夜，筛选鉴定获得阳性克隆，具体核苷酸序列如序列seq id no:8所示，对应的氨基酸序列如seq id no:3所示。
[0139]
2.构建表达载体pht01
‑
p43
‑
lacton mu9
[0140]
扩增p43启动子、lacton mu9序列，通过overlap获得p43
‑
lacton mu9，将载体pht01与p43
‑
lacton mu9分别用bamhi、xbai进行酶切，连接，转化至e.coli dh10b感受态细胞，在氨苄青霉素抗生素100mg/l的平板37℃培养过夜，筛选鉴定获得阳性克隆。
[0141]
表3扩增引物
[0142][0143][0144]
3.构建d
‑
泛解酸内酯酶枯草芽孢杆菌表达菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9
[0145]
将pht01
‑
p43
‑
lacton mu9质粒电转化至实验室保藏的枯草芽孢杆菌ar感受态细胞中，在含20mg/l氯霉素抗性平板上37℃过夜培养，验证筛选获得阳性克隆，即d
‑
泛解酸内酯酶枯草芽孢杆菌表达菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9。
[0146]
实施例4
[0147]
产d
‑
泛解酸内酯水解酶的基因工程菌摇瓶培养及酶活实验
[0148]
摇瓶采用lb培养基：氯化钠10g/l，oxoid酵母粉5g/l，oxoid蛋白胨10g/l。
[0149]
将d
‑
泛解酸内酯水解酶枯草芽孢杆菌表达菌株进行摇瓶30
‑
32℃过夜培养，5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞进行酶转化实验。
[0150]
酶活测定方法：精确称量1g湿菌体，取40ml的23％(w/v)dl
‑
泛解酸内酯水溶液，添加氯化钙9mm，恒温磁力搅拌器控制温度28℃
‑
30℃进行酶反应，用12.5％氨水控制ph在6.8
‑
7.2之间，精确计时反应1小时，5000rpm离心20min，留上清测旋光值。
[0151]
酶活测定结果如表4所示。
[0152]
表4摇瓶酶活比较
[0153]
菌株1h旋光相对酶活ar/pht01
‑
p43
‑
lacton 0.304100％ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu5 0.400131.6％ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9 0.506166.4％
[0154]
结果显示，拥有9个氨基酸位点突变的突变体菌株酶活最高，比未突变菌株酶活提高66.4％，比5个氨基酸位点突变的菌株酶活提高34.8％。拥有5个氨基酸位点突变的突变
体菌株的酶活也有显著提高，比未突变菌株酶活提高31.6％。
[0155]
实施例5
[0156]
10l发酵罐培养ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9及酶活测定实验
[0157]
一级种瓶：oxoid蛋白胨10g/l、oxoid酵母粉5g/l、nacl 10g/l、氯霉素20mg/l，摇瓶装液量为250ml摇瓶装50ml，121℃灭菌30min。
[0158]
二级种瓶：蛋白胨0
‑
20g/l、酵母粉0
‑
10g/l、氯化钠0
‑
20g/l、氯霉素20mg/l，摇瓶装液量为1000ml摇瓶装250ml，naoh调ph至7.0，121℃灭菌30min。
[0159]
发酵罐：蛋白胨0
‑
20g/l、酵母粉0
‑
10g/l、氯化钠0
‑
20g/l、葡萄糖0
‑
50g/l、氯化钙0
‑
5g/l、氯霉素20mg/l、消泡剂1ml/l，装液量10l发酵罐装液5l，naoh调ph至7.0，121℃灭菌30min。补料培养基：500g/l葡萄糖溶液。
[0160]
发酵培养过程：按接种量0.4％将保藏的甘油菌接种至一级摇瓶培养基中，220rpm 34
‑
36℃恒温震荡培养20
‑
23h；按接种量6.4％转接至二级摇瓶培养基中，220rpm 34
‑
36℃恒温震荡培养20
‑
23h；按接种量10％转接至发酵罐中，控制溶氧20％以上，培养温度30
‑
32℃，当培养基中糖浓度低于1g/l时开始补料，发酵周期46
‑
48h。
[0161]
酶活测定方法：精确称量10g湿菌体，取100ml的28％(w/v)dl
‑
泛解酸内酯水溶液，添加氯化钙9mm，恒温磁力搅拌器控温28℃
‑
30℃进行酶反应，用12.5％氨水控制ph在6.8
‑
7.2之间，精确计时反应1小时，5000rpm离心20min，留上清测旋光值。
[0162]
酶活测定结果如表5所示。
[0163]
表5 10l发酵罐酶活测定
[0164]
发酵批次周期(h)1h旋光146.5 1.037246.5 1.067348 0.991448 1.194
[0165]
上述结果表明，菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9在10l发酵罐中按反应1h旋光计酶活稳定，发酵罐结果优于摇瓶结果。
[0166]
实施例6
[0167]
3.2t发酵罐罐培养ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9及酶活测定实验：
[0168]
一级种瓶：oxoid蛋白胨10g/l、oxoid酵母粉5g/l、nacl 10g/l、氯霉素
[0169]
20mg/l，摇瓶装液量为250ml摇瓶装50ml，121℃灭菌30min。培养温度34℃
‑
36℃。
[0170]
二级种瓶：蛋白胨0
‑
20g/l、酵母粉0
‑
10g/l、氯化钠0
‑
20g/l、氯霉素20mg/l，摇瓶装液量为1000ml摇瓶装200ml，naoh调ph至7.0，121℃灭菌30min。培养温度34℃
‑
36℃。
[0171]
种子罐：蛋白胨0
‑
20g/l、酵母粉0
‑
10g/l、氯化钠0
‑
20g/l、氯霉素20mg/l、消泡剂1ml/l，装液量为200l罐装液量120l，121℃灭菌30min。
[0172]
培养温度34℃
‑
36℃。
[0173]
发酵罐：蛋白胨0
‑
20g/l、酵母粉0
‑
10g/l、氯化钠0
‑
20g/l、葡萄糖0
‑
50g/l、氯化钙0
‑
5g/l、氯霉素20mg/l、消泡剂1ml/l，3.2t罐装液量1.5t，121℃灭菌30min。培养温度30℃
‑
32℃。补料培养基为500g/l葡萄糖溶液。发酵周期46
‑
48h。
[0174]
酶活测定方法：精确称量10g湿菌体，取100ml的28％(w/v)dl
‑
泛解酸内酯水溶液，
添加氯化钙9mm，恒温磁力搅拌器28℃
‑
30℃进行酶反应，用12.5％氨水控制ph在6.8
‑
7.2之间，精确计时反应1小时，5000rpm离心20min，留上清测旋光值。
[0175]
酶活测定结果如表6所示。
[0176]
表6 3.2t发酵罐酶活测定结果
[0177]
发酵批次周期(h)1h旋光148 0.845247.5 1.010347.5 1.245447.5 1.010
[0178]
上述结果表明，菌株ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9在3.2t发酵罐中按反应1h旋光计酶活稳定，能重现10l罐结果。
[0179]
实施例7
[0180]
生物酶固定化及包埋方法、菌球酶活测定实验：
[0181]
固定化方法：按比例“湿菌体：50％戊二醛：水＝600:70:2000”进行固定化，菌体(ar/pht01
‑
p43
‑
lacton mu9)搅匀后加入终浓度为90mm的无水氯化钙溶液，边加边搅拌，待温度降到9℃左右时加入50％戊二醛，低速搅拌固定化4小时。
[0182]
包埋方法：将固定化后的体系离心，弃上清。湿菌体100g，加入5倍纯水用榨汁机将湿菌体充分打碎，依次加入20g peg200、20g超细硅藻土和10g粉末活性碳，并充分混合均匀；取30g海藻酸钠加入400ml纯化水加热使其完全溶解，冷却后与湿菌体混合搅拌均匀，用滴丸机将料液滴入2％的氯化钙溶液中，得到黑色球状颗粒，搅拌2小时后，分离即可；按照1:1的比例加入底物进行酶活测定。
[0183]
菌球酶活测定方法：将待测菌球用0.2％的cacl2溶液浸泡24小时，用40目筛网分离。称取100g菌球，加入120ml 28％(w/v)dl
‑
泛解酸内酯水溶液，添加氯化钙9mm，恒温磁力搅拌器控温28℃
‑
30℃进行酶反应，用12.5％氨水控制ph在6.8
‑
7.2之间，精确计时反应1小时，用40目筛网分离菌体和溶液。测定溶液旋光值即为菌球酶活。
[0184]
菌球套用过程中若损耗导致菌球重量小于100g，则补充新的菌球至100g，否则无需补充，重复以上菌球酶活测定步骤，直至20次结束。
[0185]
酶活测定结果如表7所示。
[0186]
表7菌球套用20次酶活测定结果
[0187][0188][0189]
菌球在与原料溶液进行充分交换后(一般为4
‑
5次左右)，其酶活能达到固定化后的水平，菌球套用20次酶活仍达到湿菌体酶活75％以上，更优可达84.7％。
[0190]
将水解反应继续进行至d
‑
泛解酸内酯水解完全，结果如表8所示。
[0191]
采用agi lent 1260高效液相系统检测方法为：色谱柱zorbax sb
‑
c18 150
×
4.6mm；流动相：0.02m磷酸二氢钾溶液(ph3.0)与乙腈配比9：1；柱温25℃；流速1.0ml/min；检测波长215nm；进样体积20μl。标准品dl
‑
泛解酸内酯保留时间为7.145min、d
‑
泛解酸钠保
留时间为4.035min。
[0192]
表8完全水解反应数据表
[0193]
实验批次12水解液旋光值 5.770 5.895水解率％48.7548.03转化率％48.5450.53总酯收率％99.79102.50
[0194]
上述结果表明，固定化并包埋之后的菌球能将28％(w/v)dl
‑
泛解酸内酯水溶液中的d型内酯选择性水解，水解率达到48％以上，总酯平衡99.5％以上。
[0195]
上述实施例中涉及的引物如表9所示。
[0196]
表9引物序列表
[0197][0198][0199]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种突变型泛解酸内酯水解酶，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于seq id no:1所示氨基酸序列的选自下组的一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：第127位、第128位、第129位、第130位和第132位。2.如权利要求1所述的突变型泛解酸内酯水解酶，其特征在于，所述突变选自下组：k127t、k128r、d129e、e130a和k132t。3.如权利要求2所述的突变型泛解酸内酯水解酶，其特征在于，所述突变还包括k62q、d63n、d73e和/或t74s。4.一种核酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1所述的突变型泛解酸内酯水解酶。5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的核酸分子。6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体或染色体整合有权利要求4所述的核酸分子。7.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述的突变型泛解酸内酯水解酶或权利要求6所述的宿主细胞。8.如权利要求7所述的酶制剂，其特征在于，所述的酶制剂为固定化酶制剂，较佳地，所述固定化酶制剂是利用戊二醛和氯化钙固定权利要求6所述的宿主细胞制备得到的酶制剂；或者，所述固定化酶制剂是利用硅藻土和活性碳对权利要求6所述的宿主细胞进行包埋所得到的酶制剂。9.一种制备d
‑
泛解酸内酯的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在合适的条件下，将权利要求1所述的突变型泛解酸内酯水解酶、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7所述的酶制剂与底物dl
‑
泛解酸内酯接触，从而将dl
‑
泛解酸内酯中的d
‑
泛解酸内酯水解为d
‑
泛解酸；和(ii)分离所述d
‑
泛解酸，对d
‑
泛解酸进行内酯化，从而得到d
‑
泛解酸内酯。10.权利要求1所述的突变型泛解酸内酯水解酶、权利要求6所述的宿主细胞或权利要求7所述的酶制剂的用途，用于制备d
‑
泛解酸内酯。
技术总结
本发明提供了一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用。具体地，本发明提供了一种酶活显著提高的突变型泛解酸内酯水解酶以及表达该突变型泛解酸内酯水解酶的宿主细胞。本发明还提供了包含所述突变型泛解酸内酯水解酶的酶制剂，可以将底物DL


技术研发人员：邵菲 左静 张莹 夏云重 朱再玲 施明安 张国银
受保护的技术使用者：上海创诺医药集团有限公司
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021/6/29