检测绿原酸类化合物的方法及其应用与流程

1.本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及检测绿原酸类化合物的方法及其应用。


背景技术：

2.山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(l.macranthoides hand.
‑
mazz.)、黄褐毛忍冬(l.fulvotomentosa hsu et s.c.cheng)、红腺忍冬(l.hypoglauca miq.)或华南忍冬(l.confusa dc.)的干燥花蕾或带初开的花；金银花为忍冬科植物忍冬(lonicera japonica thunb.)的干燥花蕾或带初开的花，两者均具有清热解毒，疏散风热的功效[1]，作为大宗药食同源产品在中药方制剂、饮料食品产业、保健品产业和化妆品产业中广泛使用[2
‑
4]。《中国药典》2005年版之前，规定金银花与山银花通称为金银花，但2005年版药典对此进行了修订，将灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬，红腺忍冬、华南忍冬并入山银花类别下，而将忍冬作为金银花药材的唯一来源，与山银花分开。目前研究表明。金银花与山银花由于物种、产地等的差异，其活性成分含量、功效和市场价格上均存在着一定的差异性，但目前在保健品市场和中药加工上，经常有人把山银花混入金银花进行销售，此外，对于金银花和山银花活性成分的差异，目前了解的也不是很充分。活性成分是山银花和金银花发挥药效的基础。目前山银花和金银花中主要药效成分包含绿原酸、黄酮、及其皂苷等多种化合物，但针对这些化合物，还缺乏可靠的同时分析方法。
[0003]
由此，检测绿原酸类化合物的方法有待改进。


技术实现要素：

[0004]
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种绿原酸类化合物的方法，该方法分析速度快，灵敏度高，可用于山银花和金银花的种属鉴别和质量评价。
[0005]
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
[0006]
研究表明，山银花和金银花中主要活性成分包含绿原酸类、黄酮类、皂苷类等多种化合物。对于这些化合物的检测，在2020版的《中国药典》中，使用的是液相色谱的分析方法，通过使用紫外检测器或是蒸发光散射检测器对这3类化合物进行分别检测。此外，文献中还有一些使用气相色谱法、气相色谱
‑
串联质谱法、液相色谱法、液相色谱
‑
串联质谱法等分析方法，但大多也是对绿原酸类、黄酮类或是皂苷类化合物进行单一类别的分析，对山银花和金银花中的绿原酸类、黄酮类、皂苷类等多种化合物进行同时分析的方法尚未见文献报道。
[0007]
发明人发现，采用超高效液相色谱
‑
串联质谱能同时检测山银花和金银花中主要的活性成分(8种绿原酸类化合物(1
‑
咖啡酰奎尼酸、3
‑
咖啡酰奎尼酸、4
‑
咖啡酰奎尼酸、5
‑
咖啡酰奎尼酸、3，4
‑
二咖啡酰奎尼酸、3，5
‑
二咖啡酰奎尼酸、4，5
‑
二咖啡酰奎尼酸、1，5
‑
二咖啡酰奎尼酸)、2种黄酮类(木犀草素、木犀草苷)，以及3种皂苷类化合物(川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙、獐牙菜苦苷))
[0008]
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测绿原酸类化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将待测样本进行提取处理，以便得到提取液；以及将所述提取液进行超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述绿原酸类化合物的定性和/或定量检测结果。
[0009]
根据本发明实施例的检测绿原酸类化合物的方法，利用超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱进行检测，分析速度快，灵敏度高，可用于山银花和金银花的种属鉴别和质量评价。
[0010]
另外，根据本发明上述实施例的检测绿原酸类化合物的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0011]
根据本发明的实施例，利用50％甲醇溶液进行所述提取处理。
[0012]
根据本发明的实施例，所述提取处理中，所述待测样本与所述50％甲醇溶液的比例为1g：500ml。
[0013]
根据本发明的实施例，所述提取处理包括：
[0014]
将所述待测样本与所述50％甲醇溶液混合，以便得到混合物；
[0015]
将所述混合物进行超声处理，得到超声后混合物；以及
[0016]
将所述超声后混合物进行冷冻离心，以便得到所述提取液。
[0017]
根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱条件：色谱柱：c18色谱柱；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。
[0018]
根据本发明的实施例，所述c18色谱柱为aglient zorbax extend c18色谱柱，规格为2.1
×
100mm，3.5μm。
[0019]
根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱流动项为a：乙腈，b：0.1％的甲酸水溶液。
[0020]
根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱采用梯度洗脱。
[0021]
根据本发明的实施例，所述梯度洗脱的条件为：0～1.0min，8％a；1.0～7.0min，8％～20％a；7.0～10.5min，20％～40％a；10.5～10.6min，40％～95％a；10.6～12.0min，95％a；12.0～12.1min，95％～8％a；12.1～14.0min，8％a。
[0022]
根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的质谱条件：电喷雾电离源(esi)，负离子模式，多反应监测(mrm)；气体：氮气；碰撞气(cad)压力：5kpa；气(cur)压力：30kpa；
[0023]
雾化气(gs1)压力为55kpa；辅助气(gs2)压力：50kpa；电喷雾电压(is)：
‑
4.5kv：去溶剂温度(tem)：550℃；入口电压(ep)：
‑
10v；碰撞室出口电压(cxp)：
‑
15v。
[0024]
根据本发明的实施例，所述绿原酸类化合物为选自1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、木犀草苷、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙和獐牙菜苦苷中的至少一种。
[0025]
进一步的，根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种检测山银花或金银花的方法。根据本发明的实施例，所述方法是利用前述的检测绿原酸类化合物的方法进行的。
[0026]
根据本发明实施例的检测山银花或金银花的方法，能用于山银花和金银花的种属
鉴别和质量评价，在一些实施例中，可用于金银花和山银花中活性成分的准确测定和金银花中掺杂山银花的快速鉴定，并且，方法快速、准确、灵敏度高。
[0027]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0028]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0029]
图1显示了根据本发明一个实施例的8种绿原酸类化合物在3种色谱柱下的分离度对比示意图，其中，1为1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；2为5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；3为3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；4为4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；5为1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸；6为3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸；7为3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸；8为4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸；
[0030]
图2显示了根据本发明一个实施例的13种化合物提取色谱示意图，其中，1为1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；2为5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；3为3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；4为獐牙菜苦苷；5为4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸；6为1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸；7为木犀草苷；8为3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸；9为3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸；10为4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸；11为灰毡毛忍冬皂苷乙；12为木犀草素；13为川续断皂苷乙；
[0031]
图3显示了根据本发明一个实施例的金银花与山银花中主要活性成分含量比较示意图。
具体实施方式
[0032]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0033]
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0034]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测绿原酸类化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将待测样本进行提取处理，以便得到提取液；以及将所述提取液进行超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述绿原酸类化合物的定性和/或定量检测结果。
[0035]
根据本发明实施例的检测绿原酸类化合物的方法，利用超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱进行检测，分析速度快，灵敏度高，可用于山银花和金银花的种属鉴别和质量评价。
[0036]
根据本发明一些实施例的检测绿原酸类化合物的方法，山银花和金银花中的13种活性成分可以在14min内有效分离，各自的线性关系在线性范围内良好，相关系数均大于0.998，检出限(lod)为：0.5～19.5μg/l，定量限(loq)为1.4～65.1μg/l。本方法分析速度快，灵敏度高，可用于金银花和山银花中活性成分的准确测定和金银花中掺杂山银花的快
速鉴定。
[0037]
根据本发明一些实施例的检测绿原酸类化合物的方法，实现了金银花及山银花中包含8种绿原酸类化合物在内的13种活性成分物质的有效分离和准确定量。该实施例的方法可应用于山银花和金银花的鉴别，同时也为山银花、金银花的质量评价以及构效关系的理解提供了手段。将该实施例的方法应用于实际样品进行分析，结果表明金银花与山银花中的活性成分含量存在明显差异，可应用于山银花和金银花的鉴别，同时也为山银花、金银花的质量评价以及构效关系的理解提供了手段。
[0038]
本文所用术语“活性成分”是指山银花或金银花中已被证明的，在疾病的诊断，治疗，症状缓解，处理或疾病的预防中有药理活性或其他直接作用或者能影响机体的物质或物质的混合物。
[0039]
本文所用术语“山银花”(lonicera flos)是指忍冬科植物灰毡毛忍冬lonicera macranthoides hand.
‑
mazz.、红腺忍冬lonicera hypoglauca miq.、华南忍冬lonicera confusa dc.或黄褐毛忍冬lonicera fulvotomentosa hsu et s.c.cheng的干燥花蕾或带初开的花。山银花为一种大宗的药食同源产品，主要活性成分包括绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙等。
[0040]
本文所用术语“金银花”(lonicera japonicae flos)是指忍冬科植物忍冬lonicera japonica thunb.的干燥花蕾或带初开的花。金银花为一种大宗的药食同源产品，主要活性成分包括绿原酸、木犀草苷等。早期的《中国药典》中，山银花一直被归为金银花名下，直到2005年之后的《中国药典》，才将山银花与金银花区别开来，这也导致市售的山银花和金银花制品常常存在混用现象。
[0041]
本文所用术语“绿原酸类化合物”是指由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(quinic acid，1
‑
羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸一类天然酚类化合物。
[0042]
根据本发明一些实施例的检测绿原酸类化合物的方法，还可以对病人服用的含山银花或是金银花活性成分在体内代谢规律的研究提供技术支撑。
[0043]
根据本发明的实施例，利用50％甲醇溶液进行提取处理。由此，有利于充分提取山银花和金银花的活性成分，检测准确性高。
[0044]
根据本发明的实施例，该提取处理中，待测样本与50％甲醇溶液的比例为1g：500ml。由此，提取溶剂的比例适宜，便于充分提取山银花和金银花的活性成分，检测准确性高。
[0045]
根据本发明的实施例，该提取处理包括：将待测样本与50％甲醇溶液混合，得到混合物；将混合物进行超声处理，得到超声后混合物；将超声后混合物进行冷冻离心，得到所述提取液。由此，有利于充分提取山银花和金银花的活性成分，检测准确性高。
[0046]
根据本发明的实施例，该超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱条件：色谱柱：c18色谱柱；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。由此，有利于山银花和金银花的各种活性成分分离的更充分，色谱峰峰形好。
[0047]
发明人研究发现，绿原酸类化合物以多种异构体形式并存，具有相同的一级特征碎片和二级特征碎片离子，无法仅通过质谱裂解的碎片离子对进行定性，根据本发明的实施例，发明人选取c18色谱柱为aglient zorbax extend c18色谱柱，规格为2.1
×
100mm，3.5μm。实验发现，不仅8种绿原酸类化合物得到了较好分离，且13种化合物在14min内均实
现了有效分离，峰形对称且瘦高。
[0048]
根据本发明的实施例，该超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱流动项为a：乙腈，b：0.1％的甲酸水溶液。由此，该流动相对于绿原酸类化合物的分离度大，有利于化合物的充分分离。
[0049]
根据本发明的实施例，该超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱采用梯度洗脱。进一步地，根据本发明的实施例，该梯度洗脱的条件为：0～1.0min，8％a；1.0～7.0min，8％～20％a；7.0～10.5min，20％～40％a；10.5～10.6min，40％～95％a；10.6～12.0min，95％a；12.0～12.1min，95％～8％a；12.1～14.0min，8％a。由此，绿原酸类化合物峰形对称无拖尾，分离度好。
[0050]
发明人发现，各个化合物在负离子模式下的响应值明显优于正离子模式，选取esi
‑
电离模式。针对绿原酸类化合物的质谱峰特点，以[m
‑
h]
–
和[m hcoo]
–
两个分子离子峰为母离子，并针对该母离子和待测化合物的特定对其他参数进行调整，根据本发明的实施例，该超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的质谱条件：电喷雾电离源(esi)，负离子模式，多反应监测(mrm)；气体：氮气；碰撞气(cad)压力：5kpa；气(cur)压力：30kpa；雾化气(gs1)压力为55kpa；辅助气(gs2)压力：50kpa；电喷雾电压(is)：
‑
4.5kv：去溶剂温度(tem)：550℃；入口电压(ep)：
‑
10v；碰撞室出口电压(cxp)：
‑
15v。由此，检测的灵敏度和准确度高。
[0051]
根据本发明的实施例，该绿原酸类化合物为选自1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、木犀草苷、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙和獐牙菜苦苷中的至少一种。
[0052]
根据本发明的实施例，13种活性成分的监测离子对、碰撞能量(ce)及去簇电压(dp)见表1。
[0053]
表1 13种活性成分化合物的最优质谱参数
[0054]
[0055][0056]
*为定量离子对
[0057]
进一步的，根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种检测山银花或金银花的方法。根据本发明的实施例，所述方法是利用前述的检测绿原酸类化合物的方法进行的。
[0058]
根据本发明实施例的检测山银花或金银花的方法，能用于山银花和金银花的种属鉴别和质量评价，在一些实施例中，可用于金银花和山银花中活性成分的准确测定和金银花中掺杂山银花的快速鉴定，并且，方法快速、准确、灵敏度高。
[0059]
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0060]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。
[0061]
实施例1
[0062]
本实施例中，利用本发明实施例的检测绿原酸类化合物的方法，对山银花和金银花中活性成分同时进行分析，具体如下：
[0063]
1、实验部分
[0064]
1.1仪器、试剂与材料
[0065]
1.1.1仪器
[0066]
exionlc ad 6500超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱联用仪(美国ab sciex公司)；analyst工作站(美国ab sciex公司)；分析天平xp 105(瑞士mettler toledo公司)；milli
‑
q advantage a10超纯水机(美国millipore公司)；数控超声波清洗器kq
‑
500de(昆山市超声仪器有限公司)；高速冷冻离心机beckman allegra x
‑
22r(美国beckman coulter公司)
[0067]
1.1.2试剂
[0068]
甲醇、乙腈、乙醇(色谱纯，美国fisher公司)；甲酸、乙酸(色谱纯，德国cnw科技公司)；甲酸铵、乙酸铵(lc/ms级，美国fisher公司)。
[0069]
1.1.3材料
[0070]1‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸(1
‑
o
‑
caffeoylquinic acid)(cas：1241
‑
87
‑
8，纯度≥98％)，购自于成都植标化纯生物技术有限公司；3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸(3
‑
o
‑
caffeoylquinic acid)(cas：327
‑
97
‑
9，纯度≥96.6％)购自于德国dr.ehrenstorfer gmbh公司；3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸(3,5
‑
dicaffeoylquinic acid)(cas：2450
‑
53
‑
5)、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸(3,4
‑
dicaffeoylquinic acid)(cas：14534
‑
61
‑
3)、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸(4,5
‑
dicaffeoylquinic acid)(cas：32451
‑
88
‑
0)，均购自于北京百灵威科技有限公司，纯度均≥98％；5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸(5
‑
o
‑
caffeoylquinic acid)(cas：906
‑
33
‑
2)、4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸(4
‑
o
‑
caffeoylquinic acid)(905
‑
99
‑
7)、1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸(1,5
‑
dicaffeoylquinic acid)(cas：30964
‑
13
‑
7)，均购自于美国sigma公司，纯度均≥98％；木犀草素(luteolin)(cas：491
‑
70
‑
3，纯度≥94.4％)、木犀草苷(luteolin
‑7‑
o
‑
β
‑
d
‑
glucoside)(cas：5373
‑
11
‑
5，纯度≥93.5％)、川续断皂苷乙(dipsacoside b)(cas：33289
‑
85
‑
9，纯度≥96.8％)、灰毡毛忍冬皂苷乙(macranthoidin b)(cas：136849
‑
88
‑
2，纯度≥97.2％)、獐牙菜苦苷(swertiamarine)(cas：17388
‑
39
‑
5，纯度≥98.3％)均购自于中国食品药品检定研究院。10批山银花、金银花样本均购自于市场，由中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员进行了种属鉴定。
[0071]
1.2实验条件
[0072]
1.2.1溶液的制备
[0073]
标准储备液：分别精密称取1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、木犀草苷、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙、獐牙菜苦苷标准品适量，分别用甲醇溶解配制成浓度1mg/ml的单一标准储备液，
‑
20℃贮存。
[0074]
混合标准溶液：分别取13种活性成分物质的标准储备液，用甲醇稀释配制成10μg/ml的混合标准溶液中间液，4℃贮存。使用时，根据需要用甲醇
‑
水(50:50,v/v)稀释到所需浓度。
[0075]
1.2.2样品制备
[0076]
取样品适量，经粉碎，过40目筛，混匀，制成均匀样品备用。参照《中国药典》2020版，精密称取样品0.1g(精确到1mg)于带刻度的50ml离心管中，加入50ml甲醇
‑
水(50:50,v/v)，密塞，摇匀，超声处理(功率300w，频率40khz)45分钟。放冷，用甲醇
‑
水(50:50,v/v)补足到50ml，摇匀，于8000r/min冷冻离心5min；准确吸取上清液1ml，用甲醇
‑
水(50:50,v/v)稀释定容到100ml，过0.22μm滤膜后上机测定。
[0077]
1.2.3色谱条件
[0078]
色谱柱：aglient zorbax extend c18色谱柱(2.1
×
100mm,3.5μm)；采用乙腈为流动相(a)，0.1％甲酸水溶液为流动相(b)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样体积：2μl。梯度洗脱程序为：0～1.0min，8％a；1.0～7.0min，8％～20％a；7.0～10.5min，20％～40％a；10.5～10.6min，40％～95％a；10.6～12.0min，95％a；12.0～12.1min,95％～8％a；12.1～14.0min，8％a。
[0079]
1.2.4质谱条件
[0080]
电喷雾电离源(esi)，负离子模式，多反应监测(mrm)；实验中所用的气体均为高纯氮气，碰撞气(cad)压力为5kpa，气帘气(cur)压
·
力为30kpa，雾化气(gs1)压力为55kpa，辅助气(gs2)压力为50kpa，电喷雾电压(is)
‑
4.5kv，去溶剂温度(tem)为550℃，入口电压(ep)为
‑
10v，碰撞室出口电压(cxp)为
‑
15v。
[0081]
2结果与讨论
[0082]
2.1实验条件考察
[0083]
2.1.1质谱条件考察
[0084]
本实施例考察了各个化合物在正离子和负离子不同电离模式下质谱响应值。结果表明，各个化合物在负离子模式下的响应值明显优于正离子模式，选取esi
‑
电离模式。负离子模式下进行全扫时，除灰毡毛忍冬皂苷乙、獐牙菜苦苷外，11种活性成分化合物的准分子离子峰主要以[m
‑
h]
‑
形式存在，而灰毡毛忍冬皂苷乙、獐牙菜苦苷同时存在[m
‑
h]
–
和[m hcoo]
–
两个分子离子峰。经考察一级碎片离子的响应灵敏度和稳定性，发现两种物质均以[m hcoo]
–
响应更高，稳定性更好，分别选择[m hcoo]
–
m/z 1443.5、[m hcoo]
–
m/z 419.1作为灰毡毛忍冬皂苷乙、獐牙菜苦苷碰撞诱导解离的母离子。进一步对各个化合物的一级质谱结构进行二级质谱裂解，选择丰度最高的两个特征碎片离子作为定性离子和定量离子，并对碰撞能量(ce)和去簇电压(dp)进行了优化。结果发现，11种化合物均可选择两个子离子组成两个监测离子对，而绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙2种化合物由于负离子模式下结构断裂方式的影响，仅存在一个监测离子对，选择的mrm质谱参数见表1。
[0085]
2.1.2色谱条件考察
[0086]
色谱柱的选择：本实施例选取的13种活性成分物质包含8种绿原酸类化合物，2种皂苷类，2种黄酮类，1种环烯醚萜类。基于液质联用技术精准定性的优点，选取的目标物中皂苷类、黄酮类和环烯醚萜类均能通过不同的分子质量实现准确的定性和定量。但绿原酸类化合物以多种异构体形式并存，具有相同的一级特征碎片和二级特征碎片离子，无法仅通过质谱裂解的碎片离子对进行定性，因此8种绿原酸类化合物快速、有效分离是色谱条件优化的重点。本实施例对比了therom acclaim
tm phenyl
‑
1(2.1
×
150mm,3um)、thermo hypersil gold aq(2.1
×
100mm,1.9um)、aglient zorbax extend c18(2.1
×
100mm,3.5um)3种色谱柱对8种绿原酸类化合物的分离影响，8种绿原酸的分离效果见图1。结果发现，acclaim
tm phenyl
‑
1苯基柱(图1中a部分)虽具有能形成p
‑
p共轭相互作用的能力，但3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸与4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸与3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸在各种流动相梯度下均不能实现有效分离。使用hypersil gold aq色谱柱(图1中b部分)分离时，3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸与4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸依然无法分离，且整体出峰拖尾严重，影响分析结果的准确性。通过zorbax extend c18色谱柱(图1中c部分)可获得良好的峰形，其中3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸与4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸的分离度r＝1.64，3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸与3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸的分离度r＝1.21，不仅8种绿原酸类化合物得到了较好分离，且13种化合物在14min内均实现了有效分离，峰形对称且瘦高(见图2)，故选用了aglient zorbax extend c18色谱柱。
[0087]
流动相的选择：本实施例分别选取甲醇
‑
水和乙腈
‑
水体系对有机相进行考察，结果显示乙腈作为有机相时，洗脱能力优于甲醇，各个目标物的峰形对称性更好，绿原酸类化合物分离度更大。分别加入了不同电解质(0.1％的甲酸、0.1％的乙酸、2.5mmol/l乙酸铵、2.5mmol/l甲酸铵)到水中，采用相同梯度通过目标物灵敏度和分离度考察无机相。结果表明，2.5mmol/l乙酸铵水溶液、2.5mmol/l甲酸铵的水溶液作为无机相时，各个峰形有明显的拖尾；而目标物在0.1％的甲酸水、0.1％的乙酸水溶液中，峰形对称无拖尾，分离度更好。由于灰毡毛忍冬皂苷乙、獐牙菜苦苷均以[m hcoo]
–
作为碰撞诱导解离的母离子，研究中发现在0.1％的甲酸水溶液条件下这两种目标物较0.1％的乙酸水具有更高的响应值和稳定性。因此，本实施例选择了乙腈(a)
‑
0.1％甲酸水溶液(b)为流动相体系进行分离。
[0088]
2.2方法学考察
[0089]
2.2.1线性关系、检出限和定量限
[0090]
取13种活性成分化合物的系列混合标准溶液，以峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x，ng/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程/线性范围和相关系数(r2)。根据3倍信噪比(s/n)确定方法的检出限(lod)，根据10倍s/n确定方法的定量限(loq)，结果见表2。结果表明，目标物在各自的曲线浓度范围内线性关系良好(r2≥0.998)，检出限(lod)为：0.3～5.2ng/ml，定量限(loq)为1.2～16.7ng/ml。
[0091]
表2 13种活性成分化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限
[0092][0093][0094]
y:峰面积；x:质量浓度,ng/ml.
[0095]
2.2.2重复性、精密度、加标回收率的考察
[0096]
分别称取山银花与金银花两种代表性基质样品各18份，每份约为0.1g，按各个化合物在原样品中的含有量水平，分别添加2.5、5.0、10.0mg/g 3个浓度水平的混合标准溶液，每个水平各6份，hplc
‑
ms/ms进行测定，记录峰面积，考察各个化合物在3个水平下的加标回收率、精密度和重复性，结果详见表3。低中高3个添加水平在山银花中的平均回收率范围为76.0～108.2％，相对标准偏差为0.5～6.1％(n＝6)，在金银花中的平均回收率为范围75.7～106.3％，相对标准偏差为0.3～8.2％(n＝6)，均满足实验室方法控制的要求。结果证明本发明实施例的检测绿原酸类化合物的方法稳定可靠，可用于金银花和山银花中13种活性成分物质的测定。
[0097]
表3 13种活性成分在3个水平下的加标回收率及精密度(n＝6)
[0098]
[0099][0100]
2.2.3稳定性考察
[0101]
取山银花样品，加入5.0mg/g水平的混合标准溶液，制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48h进样，测得供试品溶液中1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、獐牙菜苦苷、4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸、3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、木犀草素、川续断皂苷乙含量的rsd分别为：5.3％、2.4％、4.3％、5.7％、4.0％、3.9％、3.5％、4.7％、2.2％、3.6％、5.2％、2.5％、4.4％，说明供试品溶液48h内稳定。
[0102]
2.3样品测定
[0103]
分别对市售的金银花(1～4号)、山银花(红腺忍冬(5号)、灰毡毛忍冬(6～9号)、)，金银花制品(金银花颗粒(10号)等10批次样品进行了活性成分的测定，详细结果见表4。
[0104]
表4样品中13种活性成分测定结果
[0105][0106]
nd：未检测到。
[0107]
结果表明，除1
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸在10批次样品中没有检出外，其余12种活性成分均有不同程度的检出。山银花中的皂苷类(灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙)明显高于金银花，且川续断皂苷乙属于山银花的特有成分，可用于山银花与金银花之间的掺杂鉴别。山银花中的绿原酸类化合物的含量整体高于金银花，含量由高到低主要以3
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、3,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、5
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、4
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸，3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸等化合物形式存在。金银花中的木犀草苷、木犀草素、獐牙菜苦苷含量高于山银花。山银花与金银花中主要活性成分含量比较详见图3。
[0108]
此外，通过测定结果分析，1号样品包装上标注产品名称为金银花，但却有少量的川续断皂苷乙检出，且灰毡毛忍冬皂苷乙的含量明显高于金银花测定均值，低于山银花测
定均值，判断样品为金银花中掺杂了部分山银花进行销售；10号样品为市售的金银花颗粒，但川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙均有检出，说明生产原料可能为山银花，或金银花和山银花的掺杂品；同时通过10号样品分析发现，金银花及山银花中的活性成分会在加工过程中受到工艺方式的影响，导致不同程度的损失，这为金银花和山银花产品的商品化及药效成分的探索提供了参考。综上可知，山银花、金银花在活性成分的含量上存在着较大的差异，可通过本发明实施例的检测绿原酸类化合物的方法同时测定的方法对山银花和金银花进行品种鉴定和质量评价。
[0109]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0110]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种检测绿原酸类化合物的方法，其特征在于，包括：将待测样本进行提取处理，以便得到提取液；以及将所述提取液进行超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱检测，以便获得所述绿原酸类化合物的定性和/或定量检测结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用50％甲醇溶液进行所述提取处理。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取处理中，所述待测样本与所述50％甲醇溶液的比例为1g：500ml。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取处理包括：将所述待测样本与所述50％甲醇溶液混合，以便得到混合物；将所述混合物进行超声处理，得到超声后混合物；以及将所述超声后混合物进行冷冻离心，以便得到所述提取液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱条件：色谱柱：c18色谱柱；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样体积：5μl。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述c18色谱柱为aglient zorbax extend c18色谱柱，规格为2.1
×
100mm，3.5μm。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱流动项为a：乙腈，b：0.1％的甲酸水溶液；任选地，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的色谱采用梯度洗脱，任选地，所述梯度洗脱的条件为：0～1.0min，8％a；1.0～7.0min，8％～20％a；7.0～10.5min，20％～40％a；10.5～10.6min，40％～95％a；10.6～12.0min，95％a；12.0～12.1min，95％～8％a；12.1～14.0min，8％a。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱
‑
串联三重四级杆质谱的质谱条件：电喷雾电离源(esi)，负离子模式，多反应监测(mrm)；气体：氮气；碰撞气(cad)压力：5kpa；气帘气(cur)压力：30kpa；雾化气(gs1)压力为55kpa；辅助气(gs2)压力：50kpa；电喷雾电压(is)：
‑
4.5kv：去溶剂温度(tem)：550℃；入口电压(ep)：
‑
10v；碰撞室出口电压(cxp)：
‑
15v。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绿原酸类化合物为选自1
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、5
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、4
‑
o
‑
咖啡酰基奎宁酸、3,5
‑
二咖啡酰
奎宁酸、3,4
‑
二咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、1,5
‑
二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、木犀草苷、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙和獐牙菜苦苷中的至少一种。10.一种检测山银花或金银花的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1
‑
9任一项所述的检测绿原酸类化合物的方法进行的。
技术总结
本发明公开了检测绿原酸类化合物的方法及其应用，其中，检测绿原酸类化合物的方法包括：将待测样本进行提取处理，以便得到提取液；以及将所述提取液进行超高效液相色谱


技术研发人员：张峰 冯峰 汪恩婷 仲维科 刘芳
受保护的技术使用者：中国检验检疫科学研究院
技术研发日：2021.03.25
技术公布日：2021/6/29