多主棒孢菌CcTLS1蛋白与编码基因及其应用的制作方法

多主棒孢菌cctls1蛋白与编码基因及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及多主棒孢菌cctls1蛋白与编码基因及其应用。


背景技术：

2.多主棒孢菌[corynespora cassicola(berk.&m.a.curtis)c.t.wei]作为一种寄主广泛的植物病原菌，该菌不仅能侵染有重要经济价值的作物，如黄瓜、番茄、辣椒、茄子、番木瓜、大豆和橡胶树等，也能侵染园艺花卉植物。多主棒孢菌具有多种生活方式，包括腐生型、内生型和坏死型。近年来棒孢叶斑病在蔬菜生产中成为重要病害。
[0003]
多主棒孢菌通过菌丝体、分生孢子的形式附着病残体、种子，在土壤中存活，也可以在非寄主植物上存活，成为新的侵染源。多主棒孢菌在病残体上可存活2年。保护地内的病残体经过4个月越夏后，仍有70％的分生孢子萌发，这可成为下茬作物的侵染源。多主棒孢菌的菌丝既能附着种子表层，也能潜入种子内部。从保存6个月的黄瓜种子及砧木用的南瓜种子进行分离培养，均能分离到多主棒孢菌。
[0004]
近年来，对多主棒孢菌致病机理的研究主要集中在生物学特性、致病力分化、毒力相关基因的克隆等方面。据报道，黄瓜上采集的多主棒孢菌可在10
‑
35℃生长，其最适生长温度约为30℃。在25
‑
30℃的温度范围内，多主棒孢菌孢子从一端或两端萌发，相对湿度>90％，其中以水滴萌发率最高。多主棒孢菌主要通过直接接触或气孔侵入黄瓜叶片。从不同寄主植物中分离到的多主棒孢菌进行致病力鉴定和遗传多样性分析，证明多主棒孢菌具有较高的寄主专化性。从日本紫苏、黄瓜、番茄、茄子和甜椒中分离到64株多主棒孢菌，分为7个致病力组(pg1
‑
pg7)。cassiicolin是一种小型分泌型糖蛋白，是多主棒孢菌的重要致病因子，在不同宿主和地理来源的多主棒孢菌分离株中，cassiicolin毒素包含cas1、cas2、cas3、cas4、cas5和cas6共6种不同的亚型。各菌株的侵略能力与其亚型有关，其中携带cas1基因的菌株对橡胶树的侵略能力最强。此外，一些没有cas基因的菌株在橡胶树叶片上也产生了中等症状，表明多主棒孢菌存在不明显的效应因子。
[0005]
与其他丝状真菌病原体一样，多主棒孢菌具有种致病因子，如角质酶、细胞壁降解酶、细胞膜和细胞包涵体降解酶，此外也可通过毒素(cassiicolin)侵入宿主植物并引起疾病，这些毒素通过有丝分裂原活化蛋白激酶(mapk)、ca
2
和camp信号通路等多种途径转运或调控。迄今为止，除了两个mapk基因cck1和cmp1以及cassiicolin编码的基因cas之外，其它致病相关基因很少被克隆和功能鉴定，远不能完全代表多主棒孢菌的致病机制。因此，大量的毒力相关基因仍有待于鉴定、克隆和功能表征。因此，研究多主棒孢菌与寄主植物互作的分子机理至关重要。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供与多主棒孢菌致病力相关的基因，以此作为作用靶点实现棒孢叶斑病的防治。
[0007]
为了解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供了应用，所述应用为下述任一种：
[0008]
p1、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控多主棒孢菌致病力中的应用；
[0009]
p2、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控多主棒孢菌病斑大小中的应用；
[0010]
p3、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控多主棒孢菌菌丝生长速率中的应用；
[0011]
p4、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控多主棒孢菌生长发育中的应用；
[0012]
p5、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控多主棒孢菌的多聚纤维素酶活性中的应用；
[0013]
p6、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控多主棒孢菌纤维二糖水解酶分泌中的应用；
[0014]
p7、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在防治由多主棒孢菌导致的植物病害中的应用；
[0015]
p8、蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在防治由多主棒孢菌导致的黄瓜棒孢叶斑病中的应用；
[0016]
p9、所述蛋白质或所述蛋白质编码基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用；所述的植物病害是由多主棒孢菌导致的黄瓜棒孢叶斑病；
[0017]
所述蛋白质是如下任一种的蛋白质：
[0018]
a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
[0019]
a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有调控多主棒孢菌致病力功能的蛋白质；
[0020]
a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0021]
其中，序列表中的序列1由389个氨基酸残基组成。
[0022]
上述应用中，所述蛋白质来源于多主棒孢菌(corynespora cassicola)。
[0023]
本文中，所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
[0024]
本文中，所述同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0025]
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、98％或99％的同一性。
[0026]
上述应用中，所述蛋白质的编码基因可为如下a1)或a2)或a3)所示的dna分子：
[0027]
a1)编码序列是序列表中序列2所示的dna分子；
[0028]
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质a的dna分子；
[0029]
a3)在严格条件下与a1)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质的dna分子。
[0030]
上述应用中，所述调控所述蛋白质活性或含量的物质可为调控所述蛋白质编码基因的表达的物质。
[0031]
上述应用中，所述调控所述蛋白质编码基因的表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
[0032]
上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
[0033]
所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
[0034]
所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co
‑
suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
[0035]
上述应用中，调控所述蛋白质的编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质，可为如下c1)
‑
c4)任一种物质：
[0036]
c1)抑制或降低上文所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
[0037]
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
[0038]
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
[0039]
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
[0040]
所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
[0041]
本发明还提供上述的蛋白或上述调控所述蛋白质编码基因的表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质。
[0042]
本发明还提供一种降低多主棒孢菌致病力的方法，包括通过抑制或降低目的多主棒孢菌中所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的活性来降低多主棒孢菌致病力；所述蛋白质为下述任一种：
[0043]
a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
[0044]
a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控多主棒孢菌致病力功能的蛋白质；
[0045]
a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
[0046]
上述方法中，所述蛋白质的编码基因可为如下a1)或a2)或a3)所示的dna分子：
[0047]
a1)编码序列是序列表中序列2所示的dna分子；
[0048]
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上文所述蛋白质a的dna分子；
[0049]
a3)在严格条件下与a1)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质的dna分子。
[0050]
上文中，所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
[0051]
上文中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
[0052]
本发明还提供制备重组多主棒孢菌的方法，包括抑制或降低目的多主棒孢菌中所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的活性，得到重组多主棒孢菌。
[0053]
抑制所述蛋白质的编码基因的表达的物质或降低所述蛋白质活性的物质在制备多主棒孢菌抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0054]
上述的物质或上述的降低多主棒孢菌致病力的方法在防治由多主棒孢菌导致的植物病害中的应用也属于本发明的保护范围。所述多主棒孢菌导致的植物病害可为黄瓜棒孢叶斑病。
[0055]
本发明的实验证明，多主棒孢菌cctls1基因被敲除后，所得到的多主棒孢菌敲除突变体相较于野生菌株在黄瓜叶片上病斑面积大幅减小；多主棒孢菌敲除突变体的菌丝生长速度明显低于野生型多主棒孢菌；多主棒孢菌敲除突变体纤维二糖水解酶活性明显低于野生型多主棒孢菌。表明多主棒孢菌敲除突变体cctls1基因的缺失可导致多主棒孢菌对黄瓜侵染能力的下降。本发明所提供的cctls1基因及其应用在黄瓜棒孢叶斑病的防控方面具有重要意义。
附图说明
[0056]
图1为实施例1中pcr鉴定cctls1敲除突变体的结果图。其中，wt为野生型多主棒孢菌hg14102524，p为pcambia1300
‑
δcctls1，δcctls1为cctls1敲除突变体。
[0057]
图2为实施例2中pcr鉴定cctls1回补突变体的结果图。其中，wt为野生型多主棒孢菌hg14102524，p为pcambia1300
‑
cδcctls1，cδcctls1为cctls1回补突变体。
[0058]
图3为实施例3中十字交叉法测定δcctls1(敲除株)、cδcctls1(回补株)、hg14102524(野生型cchb)的病斑直径。
[0059]
图4为实施例4中十字交叉法每24h测定δcctls1、cδcctls1、hg14102524的生长速率的结果图。
[0060]
图5为实施例5中测定δcctls1、cδcctls1、hg14102524的纤维素酶活性的结果图。
具体实施方式
[0061]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0062]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0063]
1、菌株与载体
[0064]
下述实施例中的多主棒孢菌(corynespora cassicoa)菌株hg14102524，载于非专利文献“朱发娣.黄瓜多主棒孢菌(corynespora cassicola)对啶酰菌胺的抗性及其机理研究.中国农业科学院，2018.”，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0065]
下述实施例中的农杆菌菌株agl
‑
1，北京博迈德基因技术有限公司产品，货号为bc302
‑
01。
[0066]
下述实施例中的ppic9k
‑
his质粒，北京华越洋生物科技有限公司产品，货号为vect2430。
[0067]
下述实施例中的pcambia1300质粒，北京华越洋生物科技有限公司产品，货号为vect0070。
[0068]
下述实施例中的neo
‑
gfp质粒，载于非专利文献：“张宇，新型杀菌剂氰烯菌酯抑制亚洲镰孢菌(fusarium asiaticum)单端孢霉烯族毒素合成的机制研究”。
[0069]
2、培养基
[0070]
下述实施例中所用pda培养基的配制方法为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，溶解于水中，定容至1l，121℃蒸汽灭菌20min。
[0071]
下述实施例中所用含有抗生素的pda固体培养基(潮霉素150μg/ml，头孢霉素600μg/ml)为以pda培养基为基础培养基，向础培养基中添加潮霉素和头孢霉素得到的培养基，该培养基中潮霉素的浓度为150μg/ml，头孢霉素的浓度为600μg/ml。
[0072]
下述实施例中所用含有抗生素的pda固体培养基(g418150μg/ml，头孢霉素600μg/ml)为以pda培养基为基础培养基，向础培养基中添加g418和头孢霉素得到的培养基，该培养基中g418的浓度为150μg/ml，头孢霉素的浓度为600μg/ml。
[0073]
下述实施例中所用lb液体培养基的配制方法为：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，nacl 5g，溶解于水中，定容至1l，121℃蒸汽灭菌20min。
[0074]
下述实施例中所用含有抗生素的lb液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)为以lb液体培养基为基础培养基，向础培养基中添加卡那霉素和利福平得到的培养基，该培养基中卡那霉素的浓度为50μg/ml，利福平的浓度为50μg/ml。
[0075]
下述实施例中所用mm基本培养基的配制方法为：10ml k
‑
bufer(ph7.0)，20ml m
‑
nbuffer，1ml 1％(w/v)的cacl2·
2h2o，10ml 20％(w/v)的蔗糖，1ml 0.1％(w/v)的feso4，0.5g nh4no3，溶解于蒸馏水中，定容至1l。113℃蒸汽灭菌20min。其中，k
‑
bufer由溶质和溶
剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：k2hpo4的浓度为200g/l，kh2po4的浓度为145g/l，以h3po3调节其ph值至7.0。m
‑
nbuffer由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质为：mgso4·
7h2o的浓度为30g/l，nacl的浓度为15g/l。
[0076]
下述实施例中所用含有抗生素的mm液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)为以mm基本培养基为基础培养基，向础培养基中添加卡那霉素和利福平得到的培养基，该培养基中卡那霉素的浓度为50μg/ml，利福平的浓度为50μg/ml。
[0077]
下述实施例中所用im培养基的配制方法为：10ml k
‑
bufer(ph7.0)，20ml m
‑
nbuffer，1ml 1％(w/v)的cacl2·
2h2o，2.5ml 20％(w/v)的nh4no3，1ml 0.1％(w/v)的feso4，5ml甘油，5ml 2mol/l的蔗糖，2ml100mmol/l的乙酰丁香酮，40ml1mol/l的mes(ph5.3)溶解于蒸馏水中，定容至1l。113℃，蒸汽灭菌20min。
[0078]
下述实施例中所用cm共培养培养基为以im培养基为基础培养基，向础培养基中添加琼脂粉得到的培养基。该培养基中琼脂粉的含量为1.5％(w/v)。配制后113℃蒸汽灭菌20min。
[0079]
实施例1多主棒孢菌cctls1敲除突变体的获得
[0080]
一、pcambia1300
‑
δcctls1敲除载体的构建
[0081]
多主棒孢菌中cctls1的氨基酸序列见序列表的序列1，编码cctls1蛋白的cds序列见序列表的序列2，多主棒孢菌中cctls1的基因序列如序列表序列4第2049
‑
3270位所示。经uniprotkb数据库(https://www.uniprot.org/uniprot/)分析，cctls1蛋白不含结构域，目前对于多主棒孢菌cctls1基因的具体生物学功能并不清楚。
[0082]
双元载体pcambia1300经限制性内切酶xho i酶切，以去除潮霉素抗性基因，并用t4连接酶进行自连，得到的质粒命名为pcambia1300
‑
xhoi。
[0083]
利用ctab法提取多主棒孢菌hg14102524基因组dna，以该基因组dna为模板，利用maxdnapolymerase，以引物对1(f1和r1组成的引物对)进行pcr扩增，获得cctls1基因5’端片段(含有序列3的第6至1088位)：
[0084]
f1：5
’‑
ccatgattacgaattcatccggtctgttgggtcg
‑3’
(下划线指示的序列为ecor i酶识别位点序列)；
[0085]
r1：5
’‑
aaccgcctctccccggtaccgttgtcagttgtgaggagtatt
‑3’
(下划线指示的序列为kpn i酶识别位点序列)。
[0086]
以上述基因组dna为模板，利用maxdnapolymerase，以引物对2(f2和r2组成的引物对)进行pcr扩增，获得cctls1基因3’端片段(含有序列3的第2868至4160位)：
[0087]
f2：(双下划线指示的序列为xba i酶识别位点序列)；
[0088]
r2：(双下划线指示的序列为pst i酶识别位点序列)。
[0089]
利用质粒小提试剂盒提取ppic9k
‑
his质粒为模板，利用maxdnapolymerase，以引物对3(f3和r3组成的引物对)进行pcr扩增，获得潮霉素抗性基因表达盒片段(含有序列3第1109
‑
2861位)：
[0090]
f3：5
’‑
ggggtaccggggagaggcggtttgc
‑3’
(下划线指示的序列为kpn i酶识别位点
序列)；
[0091]
r3：(双下划线指示的序列为xba i酶识别位点序列)。
[0092]
用in
‑
fusionhdcloningkits(takara)将三种pcr产物(cctls1基因5’端片段、cctls1基因3’端片段和潮霉素抗性基因表达盒片段)连接到pcambia1300
‑
xhoi载体上，具体为：1)将pcambia1300
‑
xhoi和pcr扩增得到的潮霉素抗性基因表达盒片段分别用限制性内切酶kpn i和xba i进行双酶切，in
‑
fusion无缝克隆试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司产品，货号为639648)进行连接，获得质粒1；2)将质粒1在在潮霉素抗性基因的启动子区前的多克隆位点以ecor i和kpn i双酶切进行线性化，用in
‑
fusion无缝克隆试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司产品，货号为639648)连接pcr扩增得到的cctls1基因5’端片段，获得质粒2；3)将质粒2在潮霉素抗性基因的终止子区后的多克隆位点以xba i和pst i进行双酶切线性化，用in
‑
fusion无缝克隆试剂盒连接pcr扩增得到的cctls1基因3’端片段，得到的表达载体为：以潮霉素抗性基因表达盒片段替换pcambia1300
‑
xhoi载体的限制性核酸内切酶kpn i和xba i识别位点间的片段(包括kpn i的识别位点和xba i识别位点在内的小片段)，以cctls1基因5’端片段替换pcambia1300
‑
xhoi载体的限制性核酸内切酶ecor i和kpn i识别位点间的片段(包括ecor i的识别位点和kpn i识别位点在内的小片段)，以cctls1基因3’端片段替换pcambia1300
‑
xhoi载体的限制性核酸内切酶xba i和pst i识别位点间的片段(包括xba i的识别位点和pst i识别位点在内的小片段)，保持pcambia1300
‑
xhoi载体的其它序列不变，得到含有cctls1基因5’端、cctls1基因3’端和潮霉素抗性基因表达盒的重组表达载体，命名为pcambia1300
‑
δcctls1。经测序验证，pcambia1300
‑
δcctls1的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其中，第1109
‑
2861位为潮霉素抗性基因表达盒片段，第6至1088位为cctls1基因5’端片段，第2868至4160位为cctls1基因3’端片段。
[0093]
二、cctls1敲除突变体的获得
[0094]
1、构建cctls1敲除突变体
[0095]
将上述构建的pcambia1300
‑
δcctls1利用农杆菌介导的转化转进野生型多主棒孢菌hg14102524中，得到cctls1敲除突变体。具体步骤如下：
[0096]
(1)以pcambia1300
‑
δcctls1转入农杆菌agl
‑
1(北京博迈德基因技术有限公司产品)，挑取阳性农杆菌(含有pcambia1300
‑
δcctls1的重组农杆菌)单菌落放入到5ml含有抗生素的lb液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)，置于28℃摇床上，200rpm培养24小时。取1ml培养了24小时的菌液加入到20ml含有抗生素的mm液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)中，置于28℃摇床上，200rpm继续培养24小时后，离心机上4000rpm离心10min，收集菌体，菌体用im培养基洗两次，再用im培养基重悬，调od
600nm
至0.25，获得农杆菌菌液a。
[0097]
(2)与此同时用ddh2o及灭菌刷刷取pda培养基上的野生型多主棒孢菌菌株hg14102524孢子，获得孢悬液，用im液体培养基 200μm as(乙酰丁香酮，北京索莱宝科技有限公司产品，货号为a8110)重悬孢子，血球计数板计数，调孢子浓度为1.0
×
106‑7个孢子/ml，获得真菌孢子悬浮液a。
[0098]
(3)将步骤(1)获得的农杆菌菌液a和步骤(2)获得的真菌孢子悬浮液a按1:1体积
比例混匀(各取1ml)，按照每培养皿200μ1涂布于cm共培养培养基平板上的玻璃纸，26℃培养36个小时，获得共培养物a。
[0099]
(4)用3ml无菌水对共培养物a进行冲洗，按照500μl/板涂布于含有抗生素的pda固体培养基(潮霉素150μg/ml，头孢霉素600μg/ml)上培养5
‑
7天，获得cctls1敲除突变体。
[0100]
2、pcr鉴定cctls1敲除突变体
[0101]
ctab法分别提取步骤1获得的cctls1敲除突变体基因组dna和野生型多主棒孢菌hg14102524基因组dna。
[0102]
利用四对引物对，分别对野生型多主棒孢菌hg14102524基因组dna、pcambia1300
‑
δcctls1(见本实施例的步骤一)、cctls1敲除突变体基因组dna进行pcr扩增，结果见图1：
[0103]
第一对引物对扩增潮霉素抗性基因(hph gene)，由fhphu和fhphl构成：
[0104]
fhphu：5
’‑
tgtcctgcgggtaaatagc
‑3’
；
[0105]
fhphl：5
’‑
ttgttggagccgaaatcc
‑3’
。
[0106]
cctls1敲除突变体基因组dna以第一对引物对成功扩增与预期大小(468bp)相等序列，说明潮霉素抗性基因盒成功插入。
[0107]
第二对引物对扩增cctls1基因，由cctls1f和cctls1r构成：
[0108]
cctls1f：5
’‑
atgcgttcctcaatcatcatcgc
‑3’
；
[0109]
cctls1r：5
’‑
ttacaatggctgtcgtactggg
‑3’
。
[0110]
cctls1敲除突变体基因组dna以第二对引物对未扩增到目标条带说明cctls1基因敲除成功；
[0111]
第三对引物对扩增敲除载体的右边界至潮霉素抗性基因盒t
‑
dna序列，由frbu和fhphl构成：
[0112]
frbu：5
’‑
cctcttcgctattacgcc
‑3’
；
[0113]
fhphc：5
’‑
cgatttcggctccaacaa
‑3’
。
[0114]
pcambia1300
‑
δcctls1以第三对引物对成功扩增到敲除载体右边界t
‑
dna序列(2000bp)。
[0115]
第四对引物对扩增cctls1基因5’端同源臂上游至潮霉素抗性基因盒t
‑
dna序列(2153bp)，由f5f和fhphl构成：
[0116]
f5f：5
’‑
caaggatgcgagccgaaagg
‑3’
；
[0117]
fhphl：5
’‑
ttgttggagccgaaatcc
‑3’
。
[0118]
第四对引物只能在cctls1敲除突变体基因组dna出现扩增，条带大小(2153bp)与预想相符，说明潮霉素基因插入到正确的位置。
[0119]
上述结果说明基于多主棒孢菌hg14102524的cctls1敲除突变体构建成功，命名为δcctls1。
[0120]
实施例2、多主棒孢菌cctls1回补突变体的获得
[0121]
一、pcambia1300
‑
cδcctls1回补载体的构建
[0122]
利用ctab法提取多主棒孢菌hg14102524基因组dna，以该基因组dna为模板，利用maxdnapolymerase，以引物对4(f4和r4组成的引物对)进行pcr扩增，获得cctls1基因及其5’端3265kb片段(含有序列4的第6
‑
3270位)：
[0123]
f4：5
’‑
ccatgattacgaattcgctcgggatttggcacacg
‑3’
(下划线指示的序列为ecor i
酶识别位点序列)；
[0124]
r4：5
’‑
ctagaggatccccgggtaccttacaatggctgtcgtactggg
‑3’
(下划线指示的序列为kpn i酶识别位点序列)。
[0125]
以上述基因组dna为模板，利用maxdnapolymerase，以引物对5(f5和r5组成的引物对)进行pcr扩增，获得cctls1基因3’端985kb片段(含有序列5的第4467
‑
5451位)：
[0126]
f5：5
’‑
gttcttctgaagaccaaaagagcattagttcatca
‑3’
(下划线指示的序列为与r6反向互补的序列)；
[0127]
r5：(双下划线指示的序列为sbf i酶识别位点序列)。
[0128]
利用质粒小提试剂盒提取neo
‑
gfp质粒为模板，利用maxdnapolymerase，以引物对6(f6和r6组成的引物对)进行pcr扩增，扩增neo抗性基因表达盒片段(含有序列5的第3292
‑
4456位)：
[0129]
f6：(下划线指示的序列为kpn i酶识别位点序列，双下划线指示的序列为xba i酶识别位点序列)；
[0130]
r6：5
’‑
cttttggtcttcagaagaactcgtcaagaaggc
‑3’
(下划线指示的序列为与f5反向互补的序列)。
[0131]
用in
‑
fusionhdcloningkits(takara)将三种pcr产物(cctls1基因及其5’端3265kb片段、cctls1基因3’端985kb片段和neo抗性基因表达盒片段)连接到pcambia1300
‑
xhoi载体上，具体为：(1)将pcambia1300
‑
xhoi用限制性内切酶kpn i和ecori进行双酶切，与pcr扩增得到的cctls1基因及其5’端3265kb片段通过in
‑
fusion无缝克隆试剂盒进行连接，获得质粒(1)；(2)将质粒(1)用xbai和sbfi双酶切线性化，通过in
‑
fusion无缝克隆试剂盒同时连接pcr扩增得到的neo抗性基因表达盒片段和cctls1基因3’端985kb片段，得到的表达载体为：以cctls1基因及其5’端3265kb片段替换pcambia1300
‑
xhoi载体的限制性核酸内切酶kpn i和ecor i识别位点间的片段(包括kpn i的识别位点和ecor i识别位点在内的小片段)，并以neo抗性基因表达盒片段和cctls1基因3’端985kb片段同源连接后的片段替换pcambia1300
‑
xhoi载体的限制性核酸内切酶xba i和sbf i识别位点间的片段(包括xba i的识别位点和sbf i识别位点在内的小片段)，保持pcambia1300
‑
xhoi载体的其它序列不变，得到含有cctls1基因及其5’端3265kb片段、cctls1基因3’端985kb片段和neo抗性基因表达盒片段的重组表达载体，命名为pcambia1300
‑
cδcctls1。经测序验证，pcambia1300
‑
cδcctls1的氨基酸序列如序列表中序列4所示，其中，第6
‑
3270位为cctls1基因及其5’端3265kb片段，第3292
‑
4456位为neo抗性基因表达盒片段，第4467
‑
5451位为cctls1基因3’端985kb片段。
[0132]
二、cctls1回补突变体的获得
[0133]
1、构建cctls1回补突变体
[0134]
将上述构建的回补载体pcambia1300
‑
cδcctls1利用农杆菌介导的转化转进多主棒孢菌cctls1敲除突变体δcctls1(见实施例1)中得到cctls1回补突变体。
[0135]
(1)以pcambia1300
‑
cδcctls1转入根癌农杆菌感受态细胞agl
‑
1(北京博迈德基因技术有限公司产品，货号为bc302
‑
01)，挑取阳性农杆菌单菌落放入到5ml含有抗生素的lb液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)，置于28℃摇床上，200rpm培养24小时。取1ml培养了24小时的菌液加入到20ml含有抗生素的mm液体培养基(50μg/ml卡那霉素，50μg/ml利福平)中，置于28℃摇床上，200rpm继续培养24小时后，离心机上4000rpm离心10min，收集菌体，菌体用im培养基洗两次，再用im培养基重悬，调od
600nm
至0.6，获得农杆菌菌液b。
[0136]
(2)与此同时用ddh2o及灭菌刷刷取pda培养基上的多主棒孢菌δcctls1孢子，获得孢悬液，用im液体培养基 200μm as(乙酰丁香酮，北京索莱宝科技有限公司产品，货号为a8110)重悬孢子，血球计数板计数，调孢子浓度为1.0
×
106‑7个孢子/ml，获得真菌孢子悬浮液b。
[0137]
(3)将步骤(1)获得的农杆菌菌液b和步骤(2)获得的真菌孢子悬浮液b按1:1体积比例混匀(各取1ml)，按照每培养皿200μ1涂布于cm共培养培养基平板上的玻璃纸，26℃培养36个小时，获得共培养物b。
[0138]
(4)用3ml无菌水对共培养物b进行冲洗，按照500ul/板涂布于含有抗生素的pda固体培养基(g418150μg/ml，头孢霉素600μg/ml)上培养5
‑
7天，获得cctls1回补突变体。
[0139]
2、pcr鉴定cctls1回补突变体
[0140]
ctab法分别提取cctls1回补突变体基因组dna和野生型多主棒孢菌hg14102524基因组dna。
[0141]
利用四对引物对野生型野生型多主棒孢菌hg14102524基因组dna、pcambia1300
‑
cδcctls1(见本实施例的步骤一)、cctls1回补突变体基因组dna进行pcr扩增，结果见图2：
[0142]
第一对引物对扩增neo基因，由neo
‑
f和neo
‑
r构成：
[0143]
neo
‑
f：5
’‑
gtcgacagaagatgatattg
‑3’
；
[0144]
neo
‑
r：5
’‑
tcagaagaactcgtcaagaaggcg
‑3’
。
[0145]
cctls1回补突变体基因组dna以第一对引物对成功扩增与预期大小(1165bp)相等序列，说明neo抗性基因盒成功插入。
[0146]
第二对引物对扩增cctls1基因，由cctls1f和cctls1r构成：
[0147]
cctls1f：5
’‑
atgcgttcctcaatcatcatcgc
‑3’
；
[0148]
cctls1r：5
’‑
ttacaatggctgtcgtactggg
‑3’
。
[0149]
cctls1回补突变体基因组dna以第二对引物对扩增到目标条带(1222bp)，说明回补成功。
[0150]
第三对引物对扩增回补载体的右边界至neo抗性基因盒t
‑
dna序列，由frbuc和neo
‑
r构成：
[0151]
m13r：5
’‑
cacacaggaaacagctatgac
‑3’
；
[0152]
neo
‑
r：5
’‑
tcagaagaactcgtcaagaaggcg
‑3’
。
[0153]
pcambia1300
‑
cδcctls1以第三对引物对扩增质粒载体左边界t
‑
dna序列(4487bp)。
[0154]
第四对引物对扩增cctls1基因5’端同源臂上游至neo抗性基因盒序列(2153bp)，由f4f2和(nneo)neo
‑
r构成：
[0155]
f4f2：5
’‑
gaattagctgcgctcatgcac
‑3’
；
[0156]
neo
‑
r：5
’‑
tcagaagaactcgtcaagaaggcg
‑3’
。
[0157]
第四对引物只能在cctls1回补突变体基因组dna出现扩增，条带大小(4571bp)与预想相符，说明neo基因插入到正确的位置。
[0158]
上述结果说明回补突变体构建成功，命名为cδcctls1。
[0159]
实施例3突变体的致病力检测
[0160]
待测突变体为实施例1构建的cctls1敲除突变体δcctls1(简称敲除株δcctls1)，以及实施例2构建的回补突变体cδcctls1(简称回补株cδcctls1)，对照为野生型多主棒孢菌hg14102524(简称野生型hg14102524)。
[0161]
通过离体贴片培养法来鉴定致病力，具体步骤如下：准备好干净的保湿盒，喷适量清水，使其保湿。将采集好的黄瓜叶片叶背朝上分别在保湿盒内摆好(三片一盒)。分别在pda培养基上活化好的多主棒孢菌(敲除株δcctls1、回补株cδcctls1和野生型hg14102524共三种)用0.5cm的打孔器在菌落边缘打成菌饼，用灭菌镊子夹将菌饼接种到黄瓜叶片上(菌丝朝下)，每片叶上每种多主棒孢菌贴一个菌饼。菌饼切好后，喷适量清水并保湿，待发病，采用十字交叉法测定病斑直径，结果见图3。
[0162]
通过上述方法，验证了cctls1敲除突变体δcctls1对黄瓜的致病力明显减弱，回补突变体cδcctls1恢复了致病力。说明cctls1基因与多主棒孢菌的致病力有关。
[0163]
实施例4突变体菌丝生长速率的测定
[0164]
采用5mm打孔器，将培养好的多主棒孢菌cctls1敲除突变体δcctls1及回补突变体cδcctls1的菌落边沿分别打取菌饼，采用灭菌牙签挑取菌饼，菌丝面朝下贴于pda平板中央，对于每个菌株，设置3个平板重复，每24h采用十字交叉法测定菌落直径。野生型多主棒孢菌hg14102524为对照。
[0165]
结果见图4，验证了cctls1敲除突变体δcctls1在多主棒孢菌生长早期(0
‑
24h)生长缓慢，野生型hg14102524及回补突变体cδcctls1出现快速生长。说明cctls1基因参与多主棒孢菌早期菌丝的生长。
[0166]
实施例5突变体纤维素酶活性测定
[0167]
通过平板测定法测定野生型多主棒孢菌hg14102524、cctls1敲除突变体δcctls1及回补突变体cδcctls1的多聚纤维素酶活性：
[0168]
用打孔器制备直径7mm的多主棒孢菌菌饼(δcctls1，cδcctls1，hg14102524共三种)，用灭菌的牙签将三种菌饼分别接种于平板上，菌丝面朝下，28℃培养3d。羧甲基纤维素平板用0.1％刚果红染液染色30min，之后用1mol/l氯化钠溶液脱色30min，观察并拍照。每个处理重复3次。
[0169]
结果见图5，验证了cctls1敲除突变体δcctls1在羧甲基纤维素平板上虽然分泌纤维素酶但生长缓慢，说明cctls1基因影响多主棒孢菌纤维二糖水解酶的分泌。
[0170]
因此，本发明提供的cctls1基因可以用于植物病害防治，特别是由多主棒孢菌所导致的黄瓜棒孢叶斑病。另，本发明提供的基因可以作为用于植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是多主棒孢菌的药物。
[0171]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。