一株具有广谱抑菌功能的昆虫病原线虫共生细菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有广谱抑菌功能的昆虫病原线虫共生细菌及其应用。


背景技术：

2.昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的革兰氏阴性细菌，隶属于变形菌门proteobacteria的γ
‑
亚纲，包括致病杆菌(xenorhabdus)和发光杆菌(photorhabdus)两个菌属，它们分别与斯氏线虫和异小杆线虫侵染期的病原线虫互惠共生(forst et al.,1997)：病原线虫侵染昆虫后，将共生菌释放于昆虫体腔，共生菌大量繁殖并产生毒素和水解性胞外酶，最终导致寄主昆虫死亡。
3.研究表明，昆虫病原线虫共生菌不仅能产生杀虫物质，还能产生多种抗菌化合物，如发光杆菌能够产生羟基芪类抗生素(akhurst et al.,1986)、二苯乙烯衍生物(stilbene)(joycc s a,et al.,2008)、蛋白和肽类(li j et al.,1998)等；致病杆菌可以生产吲哚类衍生物(paul et al.,1981)、二硫吡咯类衍生物(xenorhabdins)(li jianxiong et al.,1995、)线虫素(nematophin)(li.et al.,1997)、异香豆素(mcinerney b v,1991)和假肽类化合物(thaler,2002)等，这些化合物对枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、黄曲霉(aspergillus flavus)、热带念珠菌(candida tropicalis)、新型隐球菌(crytococcus neoformans)等多种革兰氏阳性菌、真菌、酵母菌等表现出较强的抗性。
4.昆虫病原线虫共生菌有广谱抗性，具有成为新型生防资源的开发潜力和应用前景，为生物蛋白质农药的开发拓展了新的道路。然而目前该菌抗菌化合物主要应用于医药方面，未见其开发为生物农药的报道。


技术实现要素：

5.本发明提供一株具有生物农药开发潜质的昆虫病原线虫共生细菌xbd102,该菌株的发酵上清液对多种真菌和细菌有生长抑制作用，可用于新型生物农药的开发与应用。所述xbd102菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏编号cgmcc no:22057。
6.所述菌株是发明人实验室从中国东北采集的土样中分离出来的拟双角斯氏线虫病原共生菌，经分离后，通过检测该菌株的16s rrnagene进行菌种鉴定，使用的pcr扩增引物是：
7.上游引物：27f：5'
‑
agagtttgatcctggctcag
‑
3'；
8.下游引物：1492r:5'
‑
ggttaccttgttacgactt
‑
3'；
9.构建载体并转化至大肠杆菌，进行16s rdna序列比对，结果如图1所示，从图1可以看出，本发明分离筛选得到的是一株昆虫病原线虫共生细菌xenorhabdus budapestensis，命名为xbd102。
10.本发明得到的菌株xbd102可在任何已知的适合昆虫病原线虫共生细菌生长的培养基中发酵培养，得到其发酵代谢物(发酵液)，经沉淀分离后得到其发酵上清液。根据本发明的一种优选的实施方式，培养所述菌株的培养基为nbta琼脂培养基(分离培养基)、lb培养基(种子培养基)、lb液体培养基(发酵培养基)等。
11.本发明还通过实验证明所述菌株具有优良的抑菌或杀虫作用，其发酵代谢产物(如发酵上清液)对多种真菌和细菌有生长抑制作用，可用于新型生物农药的开发与应用。应用时，可采用其发酵代谢物作为生物农药的活性成分，也可直接采用此活性菌株制作成活性菌剂使用。
12.微生物保藏说明
13.本发明提供的昆虫病原线虫共生菌(xenorhabdus budapestensis)xbd102菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，菌株编号cgmcc no:22057。保藏时间：2021年3月23日。详见所附的微生物保藏证明材料。
附图说明
14.图1为xbd102菌株的16s rdna鉴定图谱。
具体实施方式
15.为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
16.发明人通过多次分离筛选，从中国东北采集的土样中分离出一株拟双角斯氏线虫病原共生菌，命名为xbd102(cgmcc no:22057)，经实验检测其代谢产物具有较强的杀虫或抑菌效果。
17.实施例1：菌种鉴定
18.xbd102是本实验室从中国辽宁省采集的土样中分离出来的拟双角斯氏线虫病原共生菌，检测该菌株的16s rrnagene进行菌种鉴定，使用的pcr扩增引物是：
19.上游引物：27f：5'
‑
agagtttgatcctggctcag
‑
3'；
20.下游引物：1492r:5'
‑
ggttaccttgttacgactt
‑
3'；
21.构建载体并转化至大肠杆菌，进行16s rdna序列比对，结果如图1所示，从图1可以看出，本实施例分离筛选得到的是一株xenorhabdus budapestensis，命名为xbd102。
22.实施例2：xbd102发酵液抑菌活性的测定
23.使用nbta琼脂培养基(胰蛋白胨10g/l；牛肉粉3g/l；氯化钠5g/l；氯化三苯基四唑0.04g/l；溴百里酚兰0.025g/l，ph＝7.8)对xbd102划线，28℃静置培养48小时，可见蓝褐色光滑菌落。挑取单菌落至lb培养基(胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；氯化钠10g/l)，28℃；200rpm培养14小时制成发酵种子液，以2％的接菌量将种子液接至含lb液体培养基的三角瓶中，用上述条件发酵48小时，高速离心取上清液，并用无菌滤器(0.22μm)过滤除菌，该无菌发酵上清液即为抑菌试验待测液。
24.1、对真菌的抑制活性鉴定
25.取1ml无菌发酵上清液与9ml融化的pda琼脂培养基(马铃薯200g/l；葡萄糖20g/l；琼脂7.5g/l)混合均匀制成带毒培养基平板，空白对照组由lb培养基与pda琼脂培养基混合
制成。
26.取长势一致且大小均匀的真菌菌饼接至上述试验组和对照组的平板上，在25℃培养箱中静置培养5
‑
8天，调查菌落直径。每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各一次，取其平均值并计算菌丝生长抑制率，计算方法如下：
27.按公式(1)、(2)计算各靶标菌的菌丝生长抑制率，单位为百分率(％)，计算结果保留小数点后两位。
28.式(1)：d＝d1‑
d229.式中：d：菌落增长直径；d1：菌落直径；d2：菌饼直径。
30.式(2)：
[0031][0032]
式中：i：菌丝生长抑制率；d0：空白对照菌落增长直径；dt：发酵液处理菌落增长直径。实验选择多种病原真菌，对其进行抑菌实验后结果如下表所示：
[0033]
病原真菌菌丝抑制率fusarium graminearum fusarium solani fusarium pseudograminearum exserohilum turcicum curvularia lunata geratobasidium cornigeru colletotrichum orbiculare cochliobolus sativus fulvia fulva physalospora piricola alternaria solani rhizoctonia solanikuhn fusarium oxysporum botrytis cinerea pyricularia oryzae
[0034]
备注：菌丝抑制率： ：90％
‑
100％； ：80％
‑
89％； ：70％
‑
79％； 抑制60％
‑
69％；
‑
：抑制率≤59％。
[0035]
从上表可以看出，本发明提供的xbd102发酵液对多种病原真菌具有显著的抑制作用，抑制率至少可以达到60％以上，通常可以达到90％以上。证明其具有广谱抑菌功能。
[0036]
2、对细菌的抑制活性鉴定
[0037]
用na固体培养基培养待测细菌12
‑
16小时，将菌落刮下来后用灭菌水稀释为1
×
107个细胞/ml浓度的悬浮液。
[0038]
在含有18mlnb液体培养基的三角瓶中加入10％的无菌发酵上清液(加入等量lb培养基为空白对照)并接种上述待测细菌悬浮液200μl，测定此时混合液在540nm波长下的吸光值即浑浊度，放入30℃的振荡培养箱中培养(160rpm/min)。
[0039]
培养4～8小时，待测菌达到对数生长期时，测定并记录培养液的浑浊度，并按公式(3)计算细菌的生长抑制率，以百分数(％)表示，计算结果保留小数点后两位。
[0040]
式(3)：
[0041][0042]
式中：p：生长抑制率；a0：空白对照浑浊度增加值；a1：药剂处理浑浊度增加值。
[0043]
实验选择多种病原细菌，对其进行抑菌实验后结果如下表所示：
[0044]
病原细菌抑菌率escherichia coli pectobacterium carotovora xanthomonas oryzae pseudomonas syringae acidovorax avenae
[0045]
备注：抑制率： ：90％
‑
100％； ：80％
‑
89％； ：70％
‑
79％； 抑制60％
‑
69％；
‑
：抑制率≤59％。
[0046]
从上表可以看出，本发明提供的xbd102发酵液对多种病原细菌具有显著的抑制作用，抑制率均可以达到80％以上，十分有效。
[0047]
通过上述实验证明，本发明提供的昆虫病原线虫共生细菌xbd102具有优良的抑菌和/或杀虫作用，其发酵代谢产物(如发酵上清液)对多种真菌和细菌有生长抑制作用，具有广谱抑菌功能，可用于新型生物农药的开发与应用。应用时，可采用其发酵代谢物作为生物农药的活性成分，也可直接采用此活性菌株制作成活性菌剂使用。
[0048]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。