分泌双特异性T细胞衔接子的CAR-T及治疗实体肿瘤的应用的制作方法

分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t及治疗实体肿瘤的应用1.相关申请2.本技术要求以下临时申请的权益，2020年07月16日提交的us63/052,946，其内容经此引用全文并入本文。
技术领域：
：3.本发明涉及生物医药领域，特别涉及细胞治疗领域，以及分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t，其靶向第一抗原，同时表达和分泌靶向第二抗原的双特异性t细胞衔接子分子。此外，本发明涉及特异性地分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t，该car‑t显示出对表达抗原的肿瘤细胞的杀伤力，以及对肿瘤细胞(包括表达第二抗原但不表达第一抗原的肿瘤细胞)的整体杀伤力增强。本发明进一步涉及生产本发明分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t的方法。
背景技术：
：：4.嵌合抗原受体(car)修饰的t细胞(car‑t)介导的血液病癌症免疫疗法的成功，在其对实体肿瘤的疗效方面还没有得到复制。阻碍car‑t免疫疗法平台在实体肿瘤中取得成功的一个重要因素是一种被称为肿瘤细胞的"抗原逃逸"或"免疫逃逸"现象。当单特异性car‑t细胞被注射到患者体内时，这些细胞靶向抗原高的肿瘤细胞，并成功地消除这些肿瘤性细胞。然而，现在有一个公认的观察结果，即在一个给定的肿瘤组织内，对于任何给定的抗原，都存在着抗原高、抗原低和抗原阴性的群体。单一抗原靶向的car‑t细胞只能杀死或消除抗原高的肿瘤细胞群，而抗原低/阴性的肿瘤细胞群则没有被杀死。这将导致这些逃逸的癌细胞转移和继续生长，并将导致复发。5.双抗原car‑t代表了一种有希望的方法，通过靶向两种不同的抗原，最大限度地减少抗原低或阴性复发(zah,etal.,2016,cancerimmunol.res.4(7):639‑641；wilkie,etal.,2012,j.clin.immunol.32(5):1059‑1070)。为了制备双抗原靶向的car‑t，可以在同一个t细胞上并行共表达第一个抗原a的car和第二个抗原b的car；或者，可以将抗体(通常是scfvs)串联起来，制备双抗原靶向的car‑t。这些方法的一个主要缺点是，car‑t细胞的分布将受到两种抗原的影响和驱动，而其中一些抗原在各种正常组织中的表达水平可能较低。因此，在体内的生物分布模式是复杂的，这可能导致意想不到的严重毒性。6.另一种双靶向方法是在同一个t细胞中表达抗原a的car分子和共表达针对抗原b的双特异性t细胞衔接子。双特异性t细胞衔接子是合成的抗体分子，被有目的地设计为通过cd3衔接来结合和激活t细胞。具体来说，与t细胞上的cd3结合的抗cd3单克隆抗体或单链可变片段(scfv)与抗肿瘤分子结合，所述抗肿瘤分子主要是针对肿瘤抗原的另一个scfv，或者有时是针对肿瘤配体的受体，或针对肿瘤特异性受体的配体。这些双特异性t细胞衔接子分子与t细胞结合，“武装”它们以识别和消除肿瘤细胞(frankel,etal.,2013,curropinchembiol.17(3):385‑392)。为了克服治疗胶质母细胞瘤的异质性问题，egfrviiicar‑t细胞已被设计为分泌针对egfr表达肿瘤细胞的双特异性t细胞衔接子(ross,etal.,2017,plosone,12(8):e0183390；choi,etal.,2019,nat.biotechnol.37(9):1049‑1058)。这项技术的一个主要局限性是，egfrviii是一种非常罕见的肿瘤抗原，而且egfrviii和egfr都只限于特定的肿瘤类型，所以不可能广泛地应用于许多其他的肿瘤类型。7.为了克服上述局限性，我们开发了一种新的方法来实现多种肿瘤类型的双靶向效果。技术实现要素：8.本发明提供了新型工程化免疫细胞，所述细胞包含嵌合抗原受体(car)和分泌的双特异性t细胞衔接子。car与第一肿瘤抗原结合，该抗原在正常组织中表达量较低；而双特异性t细胞衔接子与第二肿瘤抗原结合。这些工程化免疫细胞具有高细胞毒性、高细胞因子和通过结合第二抗原的双特异性t细胞衔接子分子激活jurkat的优势特性。9.在一个方面，本发明提供了包含嵌合抗原受体(car)和分泌的双特异性t细胞衔接子的新型工程化免疫细胞。所述car与第一肿瘤抗原结合，该抗原在正常组织中表达量较低；而双特异性t细胞衔接子与第二肿瘤抗原结合。10.在一些实施方式中，选择对肿瘤最具特异性的抗原(而在正常组织中仅有少量表达)作为第一肿瘤抗原。本发明car‑t细胞的生物分布将由第一肿瘤抗原驱动，并主要在肿瘤组织中。11.在一些实施方式中，第一肿瘤抗原的car‑t细胞表达针对第二肿瘤抗原的双特异性t细胞衔接子，因此可以杀死表达第一或第二抗原的肿瘤细胞，以及表达两种抗原的肿瘤细胞。此外，还会有旁观者效应，即处于肿瘤微环境中的非转导t细胞可以被双特异性t细胞衔接子分子影响，并参与杀伤表达第二抗原的肿瘤细胞。旁观者效应将加强对肿瘤细胞的整体杀伤。12.在一个方面，第一肿瘤抗原选自以下：claudin18.2，cea，或gpc3。13.在一些实施方式中，第一肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno：4所示的氨基酸序列。14.在一些实施方式中，第一肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno.4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。15.在一些实施方式中，第一肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno：5所示的氨基酸序列。16.在一些实施方式中，第一肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno.5的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。17.在一个方面，car包括铰链区和跨膜区，其中所述铰链区和跨膜区的序列包括cd8或cd28的跨膜区或铰链区的序列。18.在一些实施方式中，car包括细胞内信号区，所述细胞内信号区包括选自以下的序列：cd3ζ、fcεriγ、cd27、cd28、4‑1bb、cd134、ox40、cd40、cd40l、tlrs、icos、dap10、dap12的细胞内信号区序列或其组合。19.在进一步的实施方式中，铰链区‑跨膜区‑细胞内信号区是cd8铰链‑cd8跨膜结构域‑4‑1bb共刺激结构域‑cd3ζ。20.在一些实施方式中，铰链区‑跨膜区‑细胞内信号区包括如seqidno:6所示的氨基酸序列。21.在一些实施方式中，铰链区‑跨膜区‑细胞内信号区包括与seqidno.6的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。22.在一个方面，第二肿瘤抗原选自以下：cea或nkg2d配体。23.在一些实施方式中，第二肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno：1所示的氨基酸序列。24.在一些实施方式中，第二肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno：1的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。25.在一些实施方式中，第二肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno:2所示的氨基酸序列。26.在一些实施方式中，第二肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno.2的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。27.在一些实施方式中，第二肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno:3所示的氨基酸序列。28.在一些实施方式中，第二肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno：3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。29.在一个方面，分泌双特异性t细胞衔接子及car的核酸编码区是car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子。30.在一些实施方式中，对于分泌双特异性t细胞衔接子的car‑tlbc010，第一肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno:4所示的氨基酸序列，所述双特异性t细胞衔接子包括seqidno:1所示的氨基酸序列。31.在一些实施方式中，对于分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t，第一肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno:4的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或第二肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno:1的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。32.在一些实施方式中，对于分泌双特异性t细胞衔接子的car‑tlbc021，第一肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno:5所示的氨基酸序列，并且双特异性t细胞衔接子包括如seqidno:2所示的氨基酸序列。33.在一些实施方式中，对于分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t，第一肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno：5的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或第二肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno：2的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。34.在一些实施方式中，对于分泌双特异性t细胞衔接子的car‑tlbc022，第一肿瘤抗原结合结构域包括如seqidno：5所示的氨基酸序列，并且双特异性t细胞衔接子包括如seqidno：3所示的氨基酸序列。35.在一些实施方式中，对于分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t，第一肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno：5的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或第二肿瘤抗原结合结构域包括与seqidno：3的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。36.在一个方面，在将lbc010t细胞和lovo细胞孵化后，lbc010显示出增加的细胞毒性，以杀伤lovo细胞。37.在一些实施方式中，在孵育lbc021/lbc022t细胞和katoiii细胞后，lbc021和lbc022显示出增加的细胞毒性，以杀伤katoiii细胞。38.在一些实施方式中，在孵育lbc010t细胞和lovo细胞后，通过elisa检测，t细胞在受到肿瘤细胞刺激后分泌的ifnγ。lbc010t细胞可以分泌大量的细胞毒性细胞因子。39.在一些实施方式中，将lbc021/lbc022t细胞与lovo细胞孵化后，通过elisa检测，t细胞在受到肿瘤细胞刺激后分泌的ifnγ。lbc021和lbc022t细胞可以分泌大量的细胞毒性细胞因子。40.在一些实施方式中，将nfat启动子控制下表达荧光素酶的jurkat细胞和靶标肿瘤细胞，在car‑t细胞的双特异性t细胞衔接子条件培养基上清液中共同孵育6小时。分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t细胞(lbc010、lbc021和lbc022)成功激活了jurkat细胞。41.在一个方面，分泌双特异性t细胞衔接子的car可以应用于自体和异体环境。现成的细胞类型可用于表达这些双靶向分泌的双特异性t细胞衔接子分子，这些细胞可被注射到患者体内，重复给药以获得最佳疗效和安全性。42.在一些实施方式中，免疫细胞可以是原代t细胞、nk细胞、inkt细胞、ips诱导的nk细胞、脐带血nk细胞、gammadelta(γδ)t细胞、tcr敲除t细胞、病毒特异性t细胞，或ipsc衍生的t细胞。43.在一个方面，本发明的分泌双特异性t细胞衔接子的car可用于治疗实体肿瘤以及液体肿瘤。44.在一些实施方式中，实体肿瘤选自cea阳性肿瘤、claudin18.2阳性肿瘤或gpc3阳性肿瘤。45.在一些实施方式中，实体肿瘤可以是胃肿瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肺癌、卵巢癌或泌尿系统肿瘤。46.单一靶标的car‑t不能清除抗原阴性的肿瘤细胞，然后这些肿瘤细胞通过一种被称为"抗原逃逸"或"免疫逃逸"的现象转移扩散形成二次肿瘤。工程化t细胞同时表达car和双特异性t细胞衔接子，分别针对第一和第二抗原，通过用car转化的t细胞分泌的双特异性t细胞衔接子，“武装”旁观者t细胞，增强肿瘤杀伤力(图1)。我们表达第一肿瘤抗原的car或tcr分子，如claudin18.2,cea,gpc3,cd19,cd20,cd22,bcma,caix,cd446,cd133,egfr,egfrviii,epcam,gd2,epha2,her1,her2,icam‑1,il13ra2,mesothelin,muc1,muc16,nkg2d,psca,ny‑eso‑1,mart‑1,wt1,mage‑a10,mage‑a3,mage‑a4,ebv等，在同一个t细胞中共同表达针对第二肿瘤抗原的双特异性t细胞衔接子分子，如cd3t细胞衔接子，cea,nkg2d,cd19,cd20,cd22bcma,gpc3,epcam,caludin18.2,cd33,cd123,cs1,egfr,egfrviii,flt3等，以及nk细胞衔接子cd16和nkp46。本发明的car‑t细胞的生物分布将由第一肿瘤抗原驱动。通常选择对肿瘤最特异的抗原(而在正常组织中只表达极少)作为第一肿瘤抗原。因此，car‑t细胞的生物分布将主要在肿瘤组织中。重要的是，用于第一肿瘤抗原的car‑t细胞将被修饰上针对第二肿瘤抗原的双特异性t细胞衔接子，因此可以杀死表达第一或第二抗原的肿瘤细胞，以及表达两种抗原的肿瘤细胞。此外，还会有旁观者效应，即处于肿瘤微环境中的非转导t细胞可以被双特异性t细胞衔接子分子所修饰，并参与杀伤表达第二抗原的肿瘤细胞。旁观者效应将加强对肿瘤细胞的整体杀伤。双特异性t细胞衔接子分子增强的杀伤力在以下例子中得到了证明。47.这些双靶向car分子可以在自体和异体环境中应用。现成的细胞类型可用于表达这些双靶向双特异性t细胞衔接子分泌分子，这些细胞可被注射到患者体内，重复给药以获得最佳疗效和安全性。现成的细胞类型包括但不限于nk细胞、inkt细胞、ips诱导的nk细胞、脐带血nk细胞、gammadelta(γδ)t细胞、tcr敲除t细胞、病毒特异性t细胞、ipsc衍生的t细胞等(depil,etal.,2020,natrevdrugdiscov.19(3):185‑199；rezvani,etal.,2017,molther.25(8):1769‑1781；li,etal.,2018,cellstemcell.23(2):181‑192；philip,etal.,2015,cancerres.75(18):3853‑3864；siegler,etal.,2018,cellstemcell.23(2):160‑161；themeli,etal.,2015,cellstemcell.16(4):357‑366)。这种方法将在细胞质量和同一性、制造的可扩展性、精简储存和运输物流，以及精简医院的管理方面提供显著优势。因此，本发明将使癌症患者更容易负担得起细胞治疗，并为进一步与包括小分子药物和抗体药物的其他方式相结合铺平道路。附图说明48.本发明的新颖特征在所附权利要求书中作了具体阐述。对本发明的特性和优点更好的理解，将在下面的实施例和实例中详细说明。49.图1显示了使用负载双特异性t细胞衔接子的car‑t来减轻实体肿瘤中抗原异质性的内容。50.图2显示了共表达双特异性t细胞衔接子分子和car的结构。51.图3显示了携带共表达双特异性t细胞衔接子分子和car的转座子质粒图谱。52.图4a、图4b、图4c显示了流式细胞仪分析car(lbc001和lbc017)和car‑p2a‑ꢀ双特异性t细胞衔接子(lbc010，lbc021和lbc022)在car整合后的表达水平。53.图5显示了elisa检测car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子分泌的抗cd3scfv(sp34)的表达水平。54.图6显示了car(lbc001和lbc017)和car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子(lbc010、lbc021和lbc022)选择靶肿瘤细胞的功能分析。55.图7是显示car‑t细胞的细胞毒性的图。荧光素转化的肿瘤细胞和car‑t细胞孵化后，用荧光仪检测靶标肿瘤细胞的荧光素酶表达。56.图8显示了与肿瘤细胞孵育的car‑t细胞的干扰素‑γ(ifnγ)表达。图8的数值代表t细胞分泌的ifnγ的平均值。57.图9a是jurkatnfat报告分析的图形概要；图9b和图9c显示了jurkat细胞与cart细胞孵育后的荧光素酶表达的绝对单位。58.图10显示了通过facs检测的nkg2d配体、cea和claudin18.2在kato‑iii、hek293t、lovo和k562靶细胞上的抗原表达谱。这些细胞系被用作本发明的car和双特异性t细胞衔接子修饰的t细胞功能试验的代表性靶细胞系，其中表达数据以任意荧光单位显示。具体实施方式59.一般定义60.为方便起见，下文提供了说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明，或从上下文中隐含的意思，以下术语和短语包括以下提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定的实施例，而不是为了限制所要求保护的发明，因为所要求保护的发明的范围只受权利要求书的限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本技术所属领域的普通技术人员普遍理解的含义相同。如果某个术语在本领域的用法与本文提供的定义之间存在明显的差异，则应以说明书中提供的定义为准。61.如本文所用，术语"肿瘤抗原"或"癌抗原"可互换使用，指的是由癌细胞差异表达的抗原，因此可被利用以靶向癌细胞。癌抗原是具有刺激明显的肿瘤特异性免疫反应潜能的抗原。其中一些抗原是由正常细胞编码的，尽管不一定表达。这些抗原可以被描述为那些在正常细胞中通常是沉默的(即不表达)，那些只在分化的某些阶段表达的抗原和那些暂时表达的抗原，如胚胎和胎儿抗原。其他癌症抗原由突变的细胞基因编码，如致癌基因(如激活的ras致癌基因)、抑制基因(如突变的p53)，以及由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。还有一些癌症抗原可以由病毒基因编码，如rna和dna肿瘤病毒上携带的抗原。62.术语"嵌合抗原受体"或"car"是指重组多肽构建体，包括至少一个细胞外抗原结合结构域、一个跨膜结构域和一个细胞内信号结构域(如细胞质结构域)。在一些实施方式中，car多肽构建体的结构域在同一多肽链上(例如，包括嵌合融合蛋白)，而在一些实施方式中，car多肽构建体的结构域彼此不相邻(例如，在不同的多肽链上)。63.在一些实施方式中，细胞内信号结构域可包括源自上述刺激分子和/或共刺激分子的功能信号结构域。在某些实施方式中，细胞内信号结构域包括来自第一信号结构域的功能信号结构域(例如cd3‑zeta的第一信号结构域)。在其他实施方式中，细胞内信号结构域进一步包括一个或多个源自至少一个共刺激分子的功能信号结构域。共刺激信号区是指car的一部分，包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，是淋巴细胞对抗原有效反应所必需的。64.在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，可以加入一个间隔结构域。如本文所用，术语"间隔结构域"一般是指任何寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域连接到多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域。一个间隔结构域可以包含多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。65.所谓"双特异性t细胞衔接子"、"双特异性t细胞衔接子抗体构建体"、“bispecifictcellengagers”、“bispecifictcellengager”、“bite”或“bites”，一般是指各自包括串联的单链可变区片段(scfvs)的多肽，也可以是结合靶抗原的结构域与其他单链可变区片段串联，靶抗原可以是肿瘤抗原。可选择地，例如肿瘤抗原可以是nkg2d，结合肿瘤抗原的结构域可以是nkg2d配体。可选择地，scfvs由连接子(例如，富含甘氨酸的连接子)连接。双特异性t细胞衔接子的一个scfv与t细胞受体(tcr)(例如，与cd3e亚单位)结合，另一个scfv或结合靶抗原的结构域与靶抗原(例如，肿瘤相关抗原)结合。66.在一些实施方式中，"激活"可以指t细胞已被充分刺激以诱发可检测的细胞增殖的状态。在一些实施方式中，激活可以指诱导的细胞因子产生。在其他实施方式中，激活可以指可检测到的效应子功能。至少，本文所用的"激活的t细胞"是一种增殖的t细胞。67.本文所用的术语"工程化"及其语法等同物可以指人为设计的一种或多种核酸的改变，例如生物体基因组内的核酸。在另一个实施方式中，工程化可以指基因的改变、添加和/或删除。一个"工程化细胞"可以指具有添加、删除和/或改变基因的细胞。68.本文所用的术语"细胞"或"工程化细胞"及其语法上的等同物可以指人类或非人类动物来源的细胞。69.变体氨基酸或dna序列可以与天然或参考序列至少有80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的相同。天然序列和突变体序列之间的同源性程度(同一性百分比)可以通过使用世界范围内通常用于此目的的免费计算机程序(如默认设置的blastp或blastn)，来比较这两个序列来确定。70.正如本文所使用的，术语"包括"意味着除了所提出的定义元素外，还可以存在其他元素。使用"包括"表示包含而不是限制。71.本文所用的术语"单链抗体(scfv)片段"是指定义如下的抗体片段。它是一种重组蛋白，包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，通过连接子连接vh和vl这两个结构域，最终形成一个抗原结合位点。scfv的大小一般为一个完整抗体的1/6。优选地，单链抗体是由一个核苷酸链编码的一个氨基酸链序列。本发明中使用的单链抗体可以单独使用或与本领域已知的常规技术相结合，例如，氨基酸的删除、插入、替换、添加、和/或重组、和/或其他修饰方法来进一步修饰。根据抗体的氨基酸序列在dna序列中引入修饰，这对本领域技术人员是已知的，例如，见sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory(1989)n.y。修饰最好是在核酸水平上进行。上述单链抗体也可以包括其衍生物。72.实施例1双特异性t细胞衔接子构建体的设计和产生73.设计了三种新型的双特异性t细胞衔接子分子(表1)，以提高car‑t细胞对实体肿瘤的功能疗效。功能疗效包括但不限于本发明的car‑t细胞的细胞毒性增加。74.a.nkg2d‑双特异性t细胞衔接子：人nkg2d通过g4s连接子与抗人cd3scfv(sp34)连接。75.b.mn14‑双特异性t细胞衔接子：抗人ceacam5(cea)scfv(mn14op)通过g4s连接子与抗人cd3scfv(sp34)连接。76.c.t84.66‑双特异性t细胞衔接子：抗人ceacam5(cea)scfv(t84.66)通过g4s连接子与抗人cd3scfv(sp34)连接。77.表1：双特异性t细胞衔接子分子的氨基酸序列[0078][0079]实施例2使用双顺反子转座子递送双特异性t细胞衔接子和嵌合抗原受体(car)，对原代人类t细胞进行修饰[0080]1.设计car以共同表达双特异性t细胞衔接子分子[0081]本实施例中的car复合物由靶细胞配体结合scfv结构域、cd8铰链结构域、cd8跨膜结构域、4‑1bb共刺激结构域和cd3ζ信号结构域组成。car复合物和双特异性t细胞衔接子分子被一个p2a结构域分开(图2)。双顺反子car构建体被设计为携带双特异性t细胞衔接子构建体。[0082]我们设计并制作了以下car和car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子构建体，如表2所示，这些car的序列见表3。[0083]表2.car和car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子构建体[0084][0085]p2a的氨基酸序列是：gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:7)。双特异性t细胞衔接子和car的信号肽序列的氨基酸序列为：malpvtalllplalllhaarp(seqidno:8)。[0086]表3.car的序列[0087][0088][0089]2.转座子介导的负载有双特异性t细胞衔接子分子car‑t的递送[0090]使用gibson组装技术，将car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子构建体克隆到转座子质粒中。双特异性t细胞衔接子负载的car构建体被克隆到转座子质粒的ef1α启动子的c末端。三个独立的car表达质粒被设计为共表达每个双特异性t细胞衔接子构建体(car‑p2a‑bite)(图3)。[0091]3.用共表达双特异性t细胞衔接子分子的携带car的转座子质粒转导原代t细胞[0092]使用电穿孔方法，用携带car和双特异性t细胞衔接子的转座子转导原代人类t细胞。[0093]实施例3共表达双特异性t细胞衔接子分子的car‑t细胞的鉴定和表达[0094]从健康供体的pbmcs中分离和纯化得到人原代t细胞，用携带car‑p2a‑双特异性t细胞衔接子构建体的转座子电穿孔人原代t细胞。通过流式细胞仪分析转导的car‑t细胞，用af488连接的抗fab'染色来检测其整合。[0095]所有的car‑t细胞都显示出良好的整合水平(图4a、图4b、图4c)。转导的t细胞的流式细胞仪分析以活力(左)和car表达(右)来表示。每个图中的数字代表表达每个参数的亲本细胞的频率。三种新型构建体lbc010、lbc021和lbc022与不表达双特异性t细胞衔接子分子的lbc001和lbc017car‑t细胞，进行了比较。通过facs分析，具有或不具有双特异性t细胞衔接子的car‑t细胞显示出相当的car分子表达。[0096]实施例4car‑t细胞自发分泌双特异性t细胞衔接子[0097]将转导的car‑t细胞在体外扩增48小时，用elisa法测定扩增细胞的培养上清液中的抗人cd3scfv(sp34)水平。通过读取培养基上清液中的抗cd3scfv(sp34)的水平来检测car‑t细胞分泌的双特异性t细胞衔接子。[0098]结果显示，表达双特异性t细胞衔接子的car‑t(lbc0010、lbc021和lbc022)在其培养基中分泌sp34，而在亲代cars(lbc001和lbc017)的培养基中没有观察到这种水平(图5)。[0099]实施例5功能分析[0100]人胚肾细胞系(hek293t)被选为用于研究的抗原阴性对照靶细胞，因为这些细胞不表达第一肿瘤抗原ceacam5(cea)或claudin18.2。然而，如图10所示，hek293t表达低水平的nkg2d配体(nkg2dl)，nkg2dl作为分泌nkg2d‑双特异性t细胞衔接子car的lbc010的靶标。胃肿瘤细胞系lovo被选为靶标细胞系，因为它同时表达第一抗原(cea)和分泌nkg2d‑双特异性t细胞衔接子car的第二抗原(nkg2dl)。胃肿瘤细胞系katoiii被选为lbc021和lbc022的靶标细胞系，因为它同时表达第一(claudin18.2)和第二(cea)抗原。在一些实验中，lovo细胞被用来测试mn14‑双特异性t细胞衔接子和t84.66‑双特异性t细胞衔接子的无细胞上清液的效力，因为它们表达cea抗原。这些不同的细胞系的抗原表达谱如图10所示。[0101]未转导的t细胞和car‑t细胞与第一和第二抗原特异性(cea)肿瘤细胞孵育过夜。将荧光素转导的lovo细胞(表达cea和nkg2dl)与亲本lbc001和分泌双特异性t细胞衔接子的lbc010car‑t细胞孵化，而katoiii‑荧光素细胞(表达claudin18.2和cea)与亲本lbc017和分泌双特异性t细胞衔接子的lbc021和lbc022(e:t比例为0.5:1)细胞孵育(图6)。没有接触过肿瘤的t细胞被用作无肿瘤实验对照。所有靶标细胞都用荧光素酶基因转导。测量了以下参数。[0102]1.car‑t细胞毒性[0103]不同的car‑t细胞以效应子:靶标(e:t)比例为1:1孵育22小时。将荧光素转导的lovo细胞(表达cea和nkg2dl)与亲本lbc001和分泌双特异性t细胞衔接子的lbc010car‑t细胞孵育，而katoiii‑荧光素细胞(表达claudin18.2和cea)与亲本lbc017和双特异性t细胞衔接子分泌的lbc021和lbc022(e:t比例为0.5:1)细胞孵育。孵育后，用光度计测量靶标肿瘤细胞的荧光素酶的表达。根据实验结束时获得的相对荧光素酶单位来测定每种car‑t类型的细胞毒性百分比，并绘制成柱状图。图上的数值代表被杀死的肿瘤细胞的百分比的平均值。[0104]表达双特异性t细胞衔接子的car‑t细胞(lbc010、lbc021和lbc022)在测量的e:t比值上，比亲本car‑ts(lbc001和lbc017)显示出更大的细胞毒性(图7)。[0105]2.细胞毒性细胞因子的表达[0106]不同的car‑t细胞以效应子:靶标(e:t)比例为1:1孵育22小时。lovo细胞(表达cea和nkg2dl)与亲本lbc001和分泌双特异性t细胞衔接子的lbc010car‑t细胞孵育，而katoiii细胞(表达claudin18.2和cea)与亲本lbc017和分泌双特异性t细胞衔接子的lbc021和lbc022(e:t比例为0.5:1)细胞孵育。过夜孵育后，收获培养上清液，用elisa检测t细胞受肿瘤细胞刺激后分泌的ifnγ。未处理的t细胞分泌的ifnγ的od值从剩余实验中扣除，以控制自发的ifnγ分泌。分泌的ifnγ的量是从标准曲线中推算出来的，该标准曲线是使用已知的ifnγ分泌水平绘制成的柱状图。[0107]结果显示，与不表达这些新分子的car‑t相比，表达双特异性t细胞衔接子分子的car‑t细胞分泌更多的细胞毒性细胞因子(图8)。[0108]实施例6jurkat‑nfat报告试验[0109]在该分析试验中，将在nfat启动子下表达荧光素酶的jurkat细胞和靶标肿瘤细胞，在car‑t细胞双特异性t细胞衔接子条件培养基上清液中培养6小时。培养基中的双特异性t细胞衔接子"武装"jurkat细胞，然后被靶细胞上的抗原激活。读数是激活的jurkat细胞的荧光素酶表达量。通过将在nfat启动子下表达荧光素酶的jurkat细胞与靶标肿瘤细胞在从不同car‑t构建体收获的培养上清液中孵育6小时，证实了car‑t细胞分泌的双特异性t细胞衔接子(图9a)。[0110]在lbc001和lbc010的培养上清液中，jurkat细胞与k562细胞(表达双特异性t细胞衔接子特异性nkg2dl，而不表达第一肿瘤抗原cea)进行孵育(图9b)，在lbc017、lbc021和lbc022的培养上清液中，jurkat细胞与lovo细胞(表达双特异性t细胞衔接子特异性cea，而不表达第一肿瘤抗原claudin18.2)分别孵育(图9c)。[0111]结果显示，在存在双特异性t细胞衔接子特异性抗原的情况下，来自分泌双特异性t细胞衔接子的cars(lbc010、lbc021和lbc022)的培养上清液成功激活了jurkat细胞，而来自亲本cars(lbc001和lbc017)的培养上清液未能做到这一点(图9b和图9c)。荧光素酶表达的绝对单位显示，分泌双特异性t细胞衔接子的car‑t的上清液成功地“武装”了jurkat细胞，这些细胞随后被表达双特异性t细胞衔接子特异性抗原的靶细胞激活。[0112]其他实施方式[0113]需要理解的是，虽然已经结合其详细描述了本公开的内容，但上述描述旨在说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围界定。其他方面、优点和修改都在所述权利要求的范围内。[0114]上面描述的各种实施方式可以组合起来，以提供进一步的实施方式。本说明书中提到的和/或应用数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过引用全部纳入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，以采用各种专利、申请和出版物的概念，提供进一步的实施例。[0115]根据上述详细描述，可以对本发明的实施方式进行这些和其他修改。一般来说，在所述权利要求中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制在说明书和权利要求中披露的具体实施方式，而应解释为包括所有可能的实施方式，以及此类权利要求有权获得的全部等同物范围。因此，权利要求不受公开内容的限制。[0116]参考文献列表：[0117]1.zah,e.,lin,m.y.,anne,s.b.,jensen,m.c.&chen,y.y.tcellsexpressingcd19/cd20bispecificchimericantigenreceptorspreventantigenescapebymalignantbcells.cancerimmunol.res.2016jul；4(7):639–641doi:10.1158/2326‑6066.cir‑15‑0231.[0118]2.wilkie,s.etal.dualtargetingoferbb2andmuc1inbreastcancerusingchimericantigenreceptorsengineeredtoprovidecomplementarysignaling.j.clin.immunol.2012oct；32(5):1059‑70doi:10.1007/s10875‑012‑9689‑9.[0119]3.frankel,s.r.&baeuerle,p.a.targetingtcellstotumorcellsusingbispecificantibodies.curr.opin.chem.biol.2013jun；17(3):385‑392.doi:10.1016/j.cbpa.2013.03.029.[0120]4.ross,s.l.etal.bispecifictcellengagerantibodyconstructscanmediatebystandertumorcellkilling.plosone2017aug24；12(8):e0183390,doi:10.1371/journal.pone.0183390.[0121]5.choi,b.d.etal.car‑tcellssecretingbitescircumventantigenescapewithoutdetectabletoxicity.nat.biotechnol.2019sep；37(9):1049‑1058,doi:10.1038/s41587‑019‑0192‑1.[0122]6.depil,s.,duchateau,p.,grupp,s.a.,mufti,g.&poirot,l.‘off‑the‑shelf’allogeneiccartcells:developmentandchallenges.natrevdrugdiscov.2020mar；19(3):185‑199,doi:10.1038/s41573‑019‑0051‑2.[0123]7.rezvani,k.,rouce,r.,liu,e.&shpall,e.engineeringnaturalkillercellsforcancerimmunotherapy.molther.2017aug2；25(8):1769‑1781,doi:10.1016/j.ymthe.2017.06.012.[0124]8.li,y.,hermanson,d.l.,moriarity,b.s.&kaufman,d.s.humanipsc‑derivednaturalkillercellsengineeredwithchimericantigenreceptorsenhanceanti‑tumoractivity.cellstemcell.2018aug2；23(2):181‑192,doi:10.1016/j.stem.2018.06.002.[0125]9.philip,l.p.b.etal.multiplexgenome‑editedt‑cellmanufacturingplatformfor‘off‑the‑shelf’adoptivet‑cellimmunotherapies.cancerres.2015sep15；75(18):3853‑3864,doi:10.1158/0008‑5472.can‑14‑3321.[0126]10.siegler,e.l.,zhu,y.,wang,p.&yang,l.off‑the‑shelfcar‑nkcellsforcancerimmunotherapy.cellstemcell.2018aug2；23(2):160‑161,doi:10.1016/j.stem.2018.07.007.[0127]11.themeli,m.,rivière,i.&sadelain,m.newcellsourcesfortcel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