碱性嗜热无机焦磷酸酶及其在增强聚合酶链式反应和合成UDP-半乳糖反应中的应用的制作方法

碱性嗜热无机焦磷酸酶及其在增强聚合酶链式反应和合成udp
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半乳糖反应中的应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉一种碱性嗜热无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,ppase,ec3.6.1.1)及其在增强聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)反应和合成udp
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半乳糖反应中的应用。


背景技术：

2.产物抑制效应指末端或副产物可以降低催化关键步骤酶活性的现象，是目前导致天然酶反应产率降低的重要因素之一，对工业生产有不利影响。生命体中的dna和rna聚合反应、氨基酸活化、脂肪酸氧化以及辅酶、纤维素、淀粉的合成等多种生命活动都需要磷酸化反应维持平衡，而磷酸化反应不可避免地产生副产物焦磷酸根(ppi)，使得磷酸化反应效率被抑制。例如pcr，反应过程会产生大量ppi从而降低反应效率，因此，消除副产物ppi可以推动磷酸化反应的正向移动。
3.pcr是一种利用微量的dna片段就可以扩增获得大量dna片段的分子生物学技术。因其灵敏度高、特异性强、纯度要求低以及简便快速的特点，在生命研究、临床医学以及刑侦等方面发挥了至关重要的作用。pcr会产生大量副产物ppi，从而阻止pcr的正向进行，因此，提高pcr扩增效率的关键是消除ppi。由于pcr的反应条件是高温碱性环境，这使得酸性条件下清除ppi的化学法效果不佳。生物学上常采用ppase水解ppi，但pcr的高温反应环境会使酶的活性大幅降低甚至失活。因此，开发耐高温及耐碱性的新型酶或其它pcr增强剂成为热点。如专利cn104862288a利用聚合物
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蛋白质偶联技术，在蛋白活性中心附近修饰一个n
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异丙基丙烯酰胺(pnipam)，该聚合物具有温度响应性，可以增强蛋白质的热稳定性使常温蛋白适应高温pcr条件，同时水解ppi以达到增强pcr的效果，最终结果表明，该方法在60℃下的热稳定性比野生型提高88％，pcr效率也有明显提高。嗜热型ppase的开发近年来也小有成就，如专利cn106834249a通过突变提高嗜热ppase的表达效率和热稳定性。但关于嗜热型ppase对于pcr扩增效率提高的专利目前尚未见报道。也有商用的嗜热型ppase，例如从嗜热脂肪肝菌中提取出的ppase，但其价格昂贵，且购买渠道有限。因此，开发一种高效的热稳定性ppase迫在眉睫。本发明从还原硫超嗜热球菌属——thermococcus onnurineus na1中克隆纯化出一种嗜热型ppase，并将其应用于不同长度dna模板的pcr中副产物ppi的去除，有效地提高了pcr扩增效率。目前，未见嗜热ppase用于提高pcr扩增效率的专利。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种碱性嗜热无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,ppase,ec3.6.1.1)及其在增强聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)和合成udp
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半乳糖反应中的应用。本发明所述的碱性嗜热无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,ppase,ec3.6.1.1)是本实验室从嗜热细菌thermococcus onnurineus na1中筛选得到，记为碱性嗜热ppase ton1914，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.本发明所述的一种碱性嗜热ppase ton1914，其是由如下步骤制备得到：
6.(1)通过ncbi genbank搜索得到来自嗜热细菌thermococcus onnurineus na1的碱性嗜热ppase ton1914基因序列(537bp，编码178aa，seq id no.1)；
7.(2)根据酶的核苷酸序列seq id no.1设计引物，利用pcr扩增酶基因；
8.(3)将其与大肠杆菌表达载体pet28a连接构建重组质粒，转化大肠杆菌表达宿主菌bl21(de3)感受态细胞构建重组酶表达菌；
9.(4)利用诱导剂iptg(异丙基硫代半乳糖苷)诱导构建的重组酶表达菌表达嗜热无机焦磷酸酶。表达产物是细胞内可溶性蛋白，通过细胞超声破碎、加热失活进行分离纯化得到碱性嗜热ppase ton1914。
10.本发明的第二个技术方案：碱性嗜热ppase ton1914催化反应的最适温度、最适ph、热稳定性及ph稳定性的测定，具体操作如下：
11.(1)通过测定在20～90℃范围内重组酶催化底物水解的速率来探究碱性嗜热ppase ton1914的最适反应温度，在ph范围为6.0～11.0范围内测定了碱性嗜热ppase ton1914的最适ph；活力测定方法详见实施例2。
12.(2)将碱性嗜热ppase ton1914于70℃、80℃和90℃孵育不同时间取样，测定碱性嗜热ppase ton1914的残余活力，探究碱性嗜热ppase ton1914的热稳定性；活力测定方法详见实施例2。
13.(3)将碱性嗜热ppase ton1914于ph 6～11的缓冲液中分别孵育1h和24h，取样检测残余酶活力，探究ton1914的ph稳定性。活力测定方法详见实施例2。
14.本发明利用实时荧光定量(quantitative real
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time pcr，qpcr)检测嗜热碱性无机焦磷酸酶对于扩增产物长度在500～6700bp的dna片段时的增强效果，提供一种增强pcr扩增效率的策略。在合成udp
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半乳糖反应中添加碱性嗜热无机焦磷酸酶能提高反应的转化率，提供了一种提高udp
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半乳糖产率的策略。
15.本发明的第三个技术方案：碱性嗜热ppase ton1914在增强pcr扩增效率中的应用，是将碱性嗜热ppase ton1914加入到pcr体系中，以提高反应效率。包括以下步骤：
16.(1)确定实验室保存并能够正常表达蛋白的7个用于扩增不同长度片段的质粒模板的浓度，包括pet28a
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tfu2902(扩增片段长度为516bp)、pet28a
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gs01315(扩增片段长度为954bp)、pet28a
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aaci0783(扩增片段长度为1215bp)、pet28a
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st0779(扩增片段长度为1756bp)、pet28a
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tl08779(扩增片段长度为2494bp)、pet28a
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2552(扩增片段长度为3162bp)和pet28a
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tn0602c55s(扩增片段长度为6710bp)。质粒模板的获得方法以pet28a
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tfu2902为例：通过ncbi genbank搜索得到tfu2902的基因序列，根据tfu2902基因的核苷酸序列设计引物，利用pcr扩增基因；将其与大肠杆菌表达载体pet28a经限制酶酶切后连接构建重组质粒即为质粒模板pet28a
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tfu2902。其他六个质粒模板用相似的方法获得。模板浓度0.2～0.3ng/μl，引物浓度300～500nm对pcr扩增效率较好，最终以模板浓度0.25ng/μl，引物浓度300nm进行后续实验。
17.(2)优化pcr体系中碱性嗜热ppase ton1914的加入量：在pcr中，选用酶梯度添加量(终浓度)：0ng/ml～1.5ng/ml。以实验室已有的pet28a
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tfu2902作为模板，加入已稀释的ton1914，进行pcr扩增。结果确定0.5～1.1ng/ml的酶量对pcr扩增效率的促进效果较好，最终选择0.7ng/ml加入后续反应体系。
18.(3)碱性嗜热ppase ton1914对扩增不同片段长度的pcr效率的促进作用：用步骤(1)中的7个不同长度的重组质粒作为模板进行qpcr，探究碱性嗜热ppase ton1914对扩增不同片段长度的pcr效率的促进作用。
19.本发明的第四个技术方案：碱性嗜热ppase ton1914在合成udp
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半乳糖反应中的应用。
20.udp糖焦磷酸化酶tte0732可以催化1
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p
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半乳糖(1
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p
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gal)和utp反应生成udp
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半乳糖(udp
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gal)(专利申请号：202110560931.7)：1
‑
p
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gal utp
→
udp
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gal ppi。在反应中添加碱性嗜热ppase ton1914，可以进一步提高反应转化率。
附图说明
21.图1：碱性嗜热ppase ton1914的最适反应温度曲线；横坐标温度，纵坐标是相对酶活。温度在60℃以上酶活迅速提升，在70～80℃，酶的相对活力可达到95％以上，80℃时达到最大酶活，80～90℃可以达到最大酶活的50％。说明本发明中的碱性嗜热ppase ton1914在高温下发挥催化活性，能用于pcr反应中ppi的去除。
22.图2：碱性嗜热ppase ton1914的最适反应ph曲线；横坐标是ph值，纵坐标是相对酶活。在ph值达到8.0以上酶活力迅速提高，ph 9.0达到最大活力，在ph 8.0～9.5范围内，酶活力可达到最大活力的40％以上。说明碱性嗜热ppase ton1914可在pcr反应条件下维持较高活性。
23.图3：碱性嗜热ppase ton1914的热稳定性曲线；插图为70℃时的碱ton1914热稳定性曲线，其横坐标是时间，纵坐标是相对酶活。在70℃时的半衰期为52h，在80℃和90℃时，半衰期分别为7h和2.5h。说明碱性嗜热ppase ton1914完全可以耐受pcr反应的高温变性步骤，并在整个pcr反应过程中保持高活性。
24.图4：碱性嗜热ppase ton1914的ph稳定性曲线；横坐标是ph值，纵坐标是相对酶活。其中，虚线为1h的ph稳定性曲线，实线是24h的ph稳定性曲线。在ph 7.0～10.0的区间内孵育24h后，酶活力保持了原有活力的80％以上，说明碱性嗜热ppase ton1914具有很高的ph稳定性。
25.图5～图11：碱性嗜热ppase ton1914对扩增片段长度为516～6710bp的pcr扩增效率的增强效果图；图5～图11使用的模板分别是：pet28a
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tfu2902(扩增片段长度为516bp)、pet28a
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gs01315(扩增片段长度为954bp)、pet28a
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aaci0783(扩增片段长度为1215bp)、pet28a
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st0779(扩增片段长度为1756bp)、pet28a
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tl08779(扩增片段长度为2494bp)、pet28a
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2552(扩增片段长度3162bp)、pet28a
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tn0602c55s(扩增片段长度为6710bp)。a图是qpcr荧光图谱，表示随qpcr循环数的增加产物的生成量，横坐标是pcr扩增的循环数，纵坐标是荧光强度变化；b图是qpcr结束后的琼脂糖凝胶电泳图，1与2分别为反应体系中不添加碱性嗜热ppase ton1914与添加碱性嗜热ppase ton1914，m是核酸marker。结果表明，碱性嗜热ppase ton1914对于不同长度dna片段的扩增效率都有明显促进作用，产物量都明显高于未添加碱性嗜热ppase ton1914组。
具体实施方式
26.实施例1：碱性嗜热ppase ton1914工程菌的构建及蛋白的表达纯化，包括以下步
骤：
27.碱性嗜热ppase ton1914基因的克隆
28.碱性嗜热ppase ton1914引物序列如下：
29.上游引物：5'agcatgccatggtgaacccgttccac 3'
30.下游引物：5'ggaccgctcgagctccttcttaccgaac 3'
31.上游引物内切酶位点为nco i(划线部分)，下游内切酶位点为xho i(划线部分)；
32.表1：pcr体系
33.试剂体积(μl)蒸馏水(dw)685
×
buffer20dntps8上游引物1下游引物1基因组dna(实验室保存)1pfu1
34.pcr条件：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，10min；4℃，保存。
35.碱性嗜热ppase ton1914的表达纯化
36.将碱性嗜热ppase ton1914 pcr产物用限制酶nco i和xho i酶切，酶切体系中依次添加10
×
buffer 5μl，pcr产物25μl，两个限制酶各1.5μl，蒸馏水15μl，混匀后于37℃酶切6h。将5μl碱性嗜热ppase ton1914的酶切产物与3μl pet28a载体片段、1μl 10
×
t
4 dna buffer和1μl t
4 dna ligase混合，16℃连接过夜。取5μl连接混合物转化100μl大肠杆菌感受态细胞dh5α，筛选重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)，培养至od
600
为0.6～1.0时加入0.5mm iptg于25℃振荡培养过夜，诱导目标蛋白的表达。表达后的蛋白经细胞破碎，12000rpm离心15min，80℃热处理10min得到碱性嗜热ppase ton1914纯蛋白。
37.质粒的提取、大肠杆菌感受态细胞制备及载体转化方法参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
38.实施例2：碱性嗜热ppase ton1914最适温度、最适ph、热稳定性及ph稳定性的测定
39.1.最适反应温度的测定
40.通过测定在20～90℃重组酶催化底物水解的速率来探究碱性嗜热ppase ton1914的最适反应温度。反应体系中依次添加50mm tris
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hcl(ph 9.0)4ml，10mm焦磷酸钠1ml，10mm mgcl
2 1ml，碱性嗜热ppase ton1914 0.1ml，混匀后于不同温度反应10分钟后置于冰上停止反应，取1ml反应液用于活力测定。活力测定方法：通过正磷酸盐与钼酸铵反应形成磷钼酸，在弱酸条件下经feso4还原为蓝色化合物并在660mm处有吸收峰的原理来检测ppi的水解产物磷酸根。反应体系中加入5ml钼酸铵
‑
feso4显色剂为显色基质，再加入上述反应液1ml，去离子水补齐到10ml体系。对照组不加碱性嗜热ppase ton1914，其它成分与实验组一致。在室温下孵育10min，将显色反应后的实验组和对照组转移至1ml比色皿，于分光光度计测定660nm的吸光值。
41.2.最适反应ph的测定
42.在ph 6.0～11.0的范围内测定碱性嗜热ppase ton1914的最适反应ph，缓冲液分别为50mm的tris
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hcl缓冲溶液(ph6.0、7.0、8.0和9.0)与50mm的gly
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naoh缓冲溶液(ph 9.0、10.0和11.0)，在70℃进行活力测定。测活体系和方法同上。
43.3.热稳定性的测定
44.碱性嗜热ppase ton1914在70℃、80℃和90℃下孵育，分别每隔0.5h、2h以及4h的时间取样，检测酶在100h内酶的热稳定性。测活体系和方法同上。
45.4.ph稳定性的测定
46.碱性嗜热ppase ton1914在ph 6.0～11.0的范围内测定ph稳定性，孵育时间为1h和24h，取样检测剩余酶活力。测活体系和方法同上。
47.实施例3：碱性嗜热ppase ton1914在增强pcr效率中的应用
48.以pet28a
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tfu2902重组质粒作为模板，按表2的体系添加终浓度为0ng/ml～1.5ng/ml的碱性嗜热ppase ton1914，进行qpcr确定碱性嗜热ppase ton1914的添加量。
49.表2：qpcr反应体系用量表
50.试剂体积(μl)试剂盒预混液10上游引物2下游引物2无菌水/ton19142模板4
51.在pcr管中先加入试剂盒预混液10μl，pet28a
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tfu2902质粒模板4μl，再依次加入上、下游引物各2μl，最后加入2μl不同浓度的碱性嗜热ppase ton1914，混匀后进行qpcr。qpcr的反应程序：50℃，2min；95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火/延伸，1min；返回变性重复30个循环；4℃，保存。扩增结束后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物的检测。最终确定碱性嗜热ppase ton1914添加量为0.5～1.1ng/ml对pcr扩增效率的促进效果较好，选取0.7ng/ml的添加量进行后面的实验。
52.7个质粒模板浓度的确定：选择pet28a
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tfu2902、pet28a
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gs01315、pet28a
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aaci0783、pet28a
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st0779、pet28a
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tl08779、pet28a
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2552和pet28a
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tn0602c55s为pcr扩增的模板，在pcr体系中添加不同浓度的模板，根据powerup
tm sybr
tm green master mix试剂盒说明书操作，结果显示模板浓度0.2～0.3ng/μl，引物浓度300～500nm对pcr扩增效率较好，最终以模板浓度0.25ng/μl，引物浓度300nm进行后续实验。进行qpcr时，先加入10μl试剂盒预混液，模板4μl(终浓度为0.25ng/μl)，再依次加入上、下游引物各2μl，最后加入2μl碱性嗜热ppase ton1914(终浓度为0.7ng/ml)，混匀后进行qpcr，通过荧光图谱和琼脂糖凝胶电泳分析产物量，探究碱性嗜热ppase ton1914对扩增不同长度产物的pcr效率的促进作用。对照组不添加碱性嗜热ppase ton1914，其它成分与实验组相同。模板为2中所述的7个重组质粒，其中pet28a
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tfu290用于扩增长度为516bp的产物、pet28a
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gs01315用于扩增长度为954bp的产物、pet28a
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aaci0783用于扩增长度为1215bp的产物、pet28a
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st0779用于扩增长度为1756bp的产物、pet28a
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tl08779用于扩增长度为2494bp的产物、pet28a
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2522用于扩增长度为3162bp的产物和pet28a
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tn0602c55s用于扩增长度为6710bp的产物。结果表明，
碱性嗜热ppase ton1914对以上反应都有促进作用，产物量明显高于未添加碱性嗜热ppase ton1914组。
53.实施例4：碱性嗜热ppase ton1914在合成udp
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半乳糖反应中的应用
54.udp糖焦磷酸化酶tte0732可以催化1
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p
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半乳糖(1
‑
p
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gal)和utp反应生成udp
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半乳糖(udp
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gal)：1
‑
p
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gal utp
→
udp
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gal ppi。在反应中进一步添加碱性嗜热ppase ton1914，可以提高反应转化率。反应体系的成分数据如表2：
55.表3：反应体系的成分数据
[0056][0057][0058]
反应条件：50℃下孵育5h，反应结束后沸水浴1min终止反应，12000rpm离心3min收集上清，并过0.22μm水膜用于hplc液相检测utp剩余量。实验结果表明，添加碱性嗜热ppase ton1914后，反应转化率(转化率＝(utp
(空白组)
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utp
(实验组)
)/utp
(空白组)
*100％)由实验组1的30％提高到实验组2的57％。
[0059]
本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此前面的优选实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。