一种创制长粒香型水稻种质资源的方法与流程

1.本发明涉及水稻育种技术领域，具体为一种创制长粒香型水稻种质资源的方法。


背景技术：

2.水稻是我国重要的粮食作物，接近80%的人口以大米为主食，常年播种面积和总产量均占粮食作物的首位。在全世界水稻生产中，我国单产和总产都处于领先行列，水稻生产在国民经济中占有十分重要的地位。近年来，随着人们生活水平的提高，对高档优质稻米的需求量越来越大，特别是粒型细长带有香味的长粒香米更易受到消费者们的喜爱。
3.传统的水稻品种改良，主要通过杂交、回交的方式实现优良基因的聚合，但传统育种具有育种周期长、效率低等缺点，还有可能聚合不利基因。针对目前市场对长粒香米的迫切需求，利用基因编辑技术同时对水稻粒型基因和香味基因进行定向编辑，创制新的种质资源，将加快长粒香稻的育种进程。
4.crispr/cas9技术是当前最热门的基因编辑技术，已经成功应用于在作物遗传育种研究中，大量的研究表明，crispr/cas9技术可在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造，在后代中获得无转基因标记的突变体材料，并且能够稳定遗传。为精准、快速改良水稻品质提供了一种新思路。
5.水稻的粒形是水稻产量和品质的关键决定因素之一。gs9基因定位于水稻第9染色体上，是控制粒长的新基因，研究表明，该基因的功能缺失突变体gs9籽粒细长，但不影响植株生长发育、粒重及最后产量，同时gs9调控粒形的效应独立于gs3和gw5等已知基因，目前，gs9基因功能缺失突变在育种中应用较少，对gs9基因进行定向突变是培育最佳粒型水稻的新选择。
6.香米因其独特的芳香气味而倍受消费者欢迎，其市场价格远高于非香味稻米。因此，香味性状已成为重要的优质稻育种目标，倍受水稻育种家重视。香味基因badh2定位于第8染色体上，在香稻品种中，由于badh2基因发生突变，使得香味的主要成分2
‑
乙酰
‑1‑
吡咯啉（2
‑
ap）含量增加，稻米变香。采用基因编辑技术，定向突变香味性状基因badh2，可提高水稻香味性状选育效率，加速香稻品种育种进程。
7.针对上述问题，因此我们提出了一种创制长粒香型水稻种质资源的方法。


技术实现要素：

8.（一）解决的技术问题针对现有技术中对长粒香米的粒形和香味的需求，本发明提供了一种创制长粒香型水稻种质资源的方法，解决了对稻米品质进行精准、快速改良，加速组合多个优良性状基因的问题。
9.（二）技术方案为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种创制长粒香型水稻种质资源的方法，所述长粒香型水稻利用crispr/cas9技术同时定向编辑水稻粒型基因gs9和香味基因
badh2创制长粒香型水稻种质资源。
10.优选的，所述的一种创制长粒香型水稻种质资源的方法，包括以下步骤：s1：靶位点的选择：根据crispr/cas9系统的特征，gs9基因靶位点设计为caggatgcagctggaattga（seq id no:1）；badh2基因的靶位点设计为agctgtacagccagcagcca（seq id no:2）；s2：靶位点接头引物的设计：根据双元载体的特征，接头引物分别设计为gs9
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u3
‑
f/r:（seq id no:3～4)，badh2
‑
u6a
‑
f/r:（seq id no:5～6)，退火合成双链；s3：靶位点接头引物与grna表达盒的连接：步骤s2中合成的引物分别与对应的 pylgrna
‑
u3，pylgrna
‑
u6a质粒链接；s4：grna表达盒扩增：用特异性引物对步骤s3的产物进行扩增（seq id no:7～10）；s5：gs9和badh2基因表达载体的构建：步骤s4中的扩增产物与pylcrispr /cas9pubi
‑
h载体连接构成最终的pylcrispr/cas9
‑
gs9/badh2
‑
grna载体表达载体。
11.优选的，在步骤s1中，分别在水稻gs9基因的第3外显子和badh2基因的第5外显子选择靶位点。
12.优选的，在步骤s2中，把正反向接头引物用水稀释成10μm母液，各取10μl加入80μl去离子水至终体积100μl，混匀后90℃热击30s，移至室温冷却完成退火。
13.优选的，在步骤s5中，将构建的crispr/cas9表达载体转化到农杆菌感受态细胞eha105后进行遗传转化水稻愈伤组织，获得突变体株系。
14.（三）有益效果本发明提供了一种创制长粒香型水稻种质资源的方法，具备以下有益效果：本发明利用crispr/cas9基因编辑技术，同时定向编辑水稻gs9基因和badh2基因，获得不同类型的转基因突变株系，通过自交可在转基因后代中分离到无转基因标记的纯合株系，而且其突变特性可稳定遗传给后代，为快速组合多个优良性状基因改良种质资源提供了一种方便有效的方法。
附图说明
15.图1为本发明pylcrispr/cas9
‑
gs9/badh2
‑
grna载体结构示意图；图2为本发明gs9基因第3外显子基因编辑结构示意图；图3为本发明badh2基因第5外显子基因编辑结构示意图；图4为本发明gs9基因突变植株测序结果；图5为本发明badh2基因突变植株测序结果。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.如图1
‑
5所示，本发明以下实施例以水稻不育系深08s为材料，通过农杆菌介导把
crispr/cas9表达载体转入水稻愈伤组织，获得突变体株系。
18.实施例一：基因编辑表达载体的构建s1：通过ncbi获得gs9（os09g0448500）、badh2(os08g0424500)的基因序列，使用e
‑
crisp靶位点检索网站，以oryza sativa全基因组序列为背景，分别搜索gs9、badh2基因上的靶位点，降低脱靶概率，分别在水稻gs9基因的第3外显子和badh2基因的第5外显子选择靶位点；选择atg附近的靶点，分别设计接头引物gs9
‑
u3
‑
f/r(seq id no:3～4)；badh2
‑
u6
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f/r(seq id no:5～6)；把正反向引物用水稀释成10μm母液，各取10μl加入80μl去离子水至终体积100μl，混匀后90℃热击30s，移至室温冷却完成退火。
19.s2：grna表达盒的构建及扩增s2
‑
1：u3
‑
gs9
‑
grna表达盒的连接并扩增反应体系：1μl(约10ng)pylgrna
‑
u3质粒，加入1μl 10
×
t4 dna连接酶缓冲液、1μl gs9接头引物、bsaⅰ限制性内切酶和t4 dna连接酶，混合均匀；pcr程序：用pcr仪反应5个循环：37℃、5min，20℃、5min；扩增反应体系：2μl连接产物为模板，10μl 2
×
taq pcr mastermix，用pylgrna
‑
u3质粒特异引物uctcg
‑
b1'(seq id no:7)和grcggt
‑
b2(seq id no:8)各1μl，加ddh2o配20μl pcr体系进行扩增；pcr程序：95℃、5min，95℃、1min，60℃、15s，68℃、30s，25个循环；uctcg
‑
b1':ttcagaggtctctctcgcactggaatcggcagcaaagggrcggt
‑
b2:agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctcs2
‑
2：u6a
‑
badh2
‑
grna表达盒的连接并扩增反应体系：1μl(约10ng)pylgrna
‑
u6a质粒，加入1μl 10
×
t4 dna连接酶缓冲液、 1μl badh2 接头引物、bsaⅰ限制性内切酶和t4 dna连接酶，混合均匀；pcr程序：用pcr仪反应5个循环：37℃、5min，20℃、5min；扩增反应体系：2μl连接产物为模板，10μl 2
×
taq pcr mastermix，用pylgrna
‑
u6a 质粒特异引物uctcg
‑
b2'(seq id no:9)和grcggt
‑
bl(seq id no:10)各1μl，加ddh2o配制20μl pcr 体系进行扩增；pcr程序：95℃、5min，95℃、1min，60℃、15s，68℃、30s，25个循环；uctcg
‑
b2':ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagggrcggt
‑
bl:agcgtgggtctcgaccgggtccatccactccaagctcs3：将步骤s3得到的靶点grna表达盒u3
‑
gs9
‑
grna和u6a
‑
badh2
‑
grna用重组酶连接到pylcrispr/cas9pubi
‑
h载体上；反应体系：u3
‑
gs9
‑
grna 4μl，u6a
‑
badh2
‑
grna 4 l，加入0.2μl(约60 ng) pylcrispr/cas9pubi
‑
h质粒， 加10
×
连接酶缓冲液1.5μl，加bsa
ⅰꢀ
0.5μl，加ddh2o至15μl，37℃、10min后，加入1μl t4 dna连接酶，混合均匀；pcr反应程序：37℃、5min，10℃、5min，20℃、5min，12个循环。
20.实施例二：农杆菌介导转化水稻愈伤组织将构建好的crispr/cas9
‑
grna表达载体转入到农杆菌感受态eha105中，诱导水稻
不育系深08s愈伤组织，在共同培养基上暗培养3d。用含羧苄青霉素溶液(500 mg/l)洗愈伤组织；然后接种愈伤组织于筛选培养基，用潮霉素筛选15d，中间可继代一次；把筛选后存活的愈伤组织接种于分化培养基，培养15～21d，中间继代一次；把分化出的幼苗转移至生根培养基进行生根15d。
21.实施例三：转基因株系靶位点突变分析取t0代幼苗叶片采用ctab的方法提取叶片的全基因组dna，通过引物hyg
‑
f/r（seq id no:11～12）进行检测，从20株t0代再生苗筛选出10株阳性苗。
22.分别设计引物seq1
‑
f/r(seq id no:13～14)对gs9基因靶点及其附近的序列进行扩增；引物seq2
‑
f/r(seq id no:15～16)对badh2基因靶点及其附近的序列进行扩增。
23.扩增反应体系：1μl全基因组dna模板，10μl 2
×
taq pcr mastermix，用于扩增的前后引物各1μl，加dd h2o至20μl。
24.pcr扩增程序：95℃、5min，95℃、30s，55℃、30s，72℃、45s，30个循环；最后72℃延伸5min；对pcr扩增产物进行测序，结果表明10株阳性植株中有8株发生了突变。
25.hyg
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f:acggtgtcgtccatcacagtttgcchyg
‑
r:ttccggaagtgcttgacattggggaseq1
‑
f：attgcttcctgctcggttgggaseq1
‑
r:ctttggtggtgcgaggtcatggaseq2
‑
f：tggaatcttactgcagaagggaseq2
‑
r：tacacacatcagcaagctcca实施例四：无标记转基因株系鉴定取双基因均发生突变的t0代转基因植株收种继续种植，提取t1代全基因组dna，通过引物hyg
‑
f/r(seq id no:11～12)进行检测，无t
‑
dna元件插入的植株，用引物seq1
‑
f/r(seq id no:13～14)、seq2
‑
f/r(seq id no:13～14)进行扩增，通过测序，筛选出2株无t
‑
dna元件的双基因纯合突变植株（19
‑
1，19
‑
5），分析gs9、badh2基因突变的具体情况，如图4～5所示。
26.实施例五：t2代植株农艺性状分析及香味鉴定突变体粒长比野生型植株增加12.51%，粒宽较野生型植株降低10.17%，结实率没有显著变化；采用氢氧化钾法进行香味的鉴定：各取10粒糙米，放入小玻璃培养皿中，加10ml 1.7％的koh溶液处理，并盖上培养皿，编号，将其置于室温下10min，然后逐一开盖嗅其气味，结果发现深08s不具有香味，而19
‑
1，19
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5突变体具有香味。