一种与奶牛酮病相关的血液中编码基因SOD及其PCR检测试剂盒的制作方法

一种与奶牛酮病相关的血液中编码基因sod及其pcr检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种与奶牛酮病相关的血液中编码基因sod及其pcr检测试剂盒。


背景技术：

2.近些年来，随着我国奶牛养殖业不断向规模化、集约化发展，围产期奶牛代谢性疾病的发病率也随之增加。围产期奶牛处于转变时期，摄取能量达不到体内能量需求，将处于负能量平衡状态。因此奶牛将进行体脂动员，过度的体脂动员会产生大量的非酯化脂肪酸(nonesterified fatty acid，nefa)和β
‑
羟丁酸(β
‑
hydroxybutyric acid，bhba)致使酮病等代谢性疾病的发生。此类疾病不仅使泌乳母牛产乳量明显下降，而且还严重影响产后母牛的发情配种，同时亦常常诱发皱胃变位、胎衣不下、子宫内膜炎、乳房炎等围产期的其他疾病，对奶牛饲养业造成重大经济损失。研究发现动物主要通过酶机制和非酶机制消除体内的自由基，其中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)是最主要的酶之一，它能够清除生物氧化过程中的超氧阴离子自由基(superoxide anion，o2)，被认为是抗氧化系统的第一道防线。sod是自然界最有效的防御氧化侵袭的抗氧化剂之一，sod在消除氧化损伤中发挥了重要作用，还可以参与由病毒感染和细菌引起的免疫反应。当机体发生病变时，自由基增加，从而引发体内sod含量的改变，脂质过氧化物进一步氧化形成脂质过氧化终产物丙二醛(malondialdehyde mda)。mda可引发细胞代谢及功能的障碍，甚至死亡。当体内脂质过氧化反应增强，清除氧自由基能力减弱，则造成体内自由基反应紊乱、微循环障碍和血瘀证，从而导致胎衣不下等疾病。因此对围产期疾病的奶牛血清中sod含量变化进行检测，可以为进一步探讨奶牛围产期疾病的发病机制，预防奶牛围产期疾病提供更可靠的理论依据。
3.sod的检测主要是通过采集血液或组织细胞等样品，分离血清蛋白、生化鉴定等传统方法，但过程繁琐、费力、耗时、外界影响因素多，结果不稳定。因此迫切需要一种高效、快速的检测方法用于sod的检测，及时发现奶牛氧化应激的发生，针对我国奶牛养殖业的发展意义重大。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供奶牛血液中与酮病相关的编码基因sod的核苷酸序列。
5.本发明的第二目的是提供一种与奶牛酮病相关的血液中编码基因sod的pcr检测试剂盒，解决分离血清蛋白、生化鉴定等传统方法繁琐、费力、耗时、外界影响因素多，结果不稳定的问题。
6.本发明的第三目的是提供上述pcr检测试剂盒的用途。
7.本发明通过以下技术方案来实现：
8.一、一种奶牛血液中与酮病相关的编码基因sod，其核苷酸序列如seq id no.1所
示。
9.二、一种用于快速检测奶牛血液中与酮病相关的编码基因sod的pcr检测试剂盒，所述的试剂盒中的引物序列如下：
10.正向引物：tgttctgcggcgtcgttttc(seq id no.1)；
11.反向引物：cctcgaagtggatggtgcct(seq id no.2)。
12.进一步的，所述试剂盒还含有ddh2o、2xtaq master mix、样品基因组dna提取试剂中的一种或多种。
13.进一步的，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
14.进一步的，所述阳性对照为健康奶牛血液中sod基因表达的dna样品。
15.进一步的，所述阴性对照为酮病奶牛血液中sod基因表达的dna样品。
16.三、上述的pcr检测试剂盒在检测和鉴定酮病奶牛氧化应激中的应用。
17.采用上述技术方案的积极效果：本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在sod基因，即酮病奶牛血液中含有143bp核苷酸序列的sod基因，以特异性引物通过pcr技术验证了sod基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中sod基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。
附图说明
18.图1为pcr鉴定sod基因的图片，其中泳道m为：dl500 marker，泳道1为奶牛sod基因片段(143bp处有目的条带)；
19.图2为pcr鉴定sod基因在奶牛血液中分布和片段大小图片；其中泳道m为：dl500 marker；泳道1为健康奶牛sod基因片段(143bp处有目的条带)；泳道2为酮病奶牛sod基因片段(143bp处有目的条带)。
具体实施方式
20.下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
21.实施例1
22.实施例1说明生物学信息学方法鉴定sod基因的分布。
23.在ncbi，使用blastn在线比对软件(http：//blast.ncbinlm.nih.gov/blast.cgi)在全基因组数据库中搜索sod基因，搜索结果表明奶牛机体中含有sod基因(seq id no.1)，且基因长度为134bp的核苷酸序列，在提取rna检测浓度并定量后反转录为cdna，其中健康奶牛血液中sod基因表达量极高；酮病奶牛血液中sod基因表达量极低；二者在143bp均可见条带。生物信息学鉴定结果显示sod特异性良好，可用于建立快速检测奶牛血液中sod的pcr方法。
24.实施例2
25.本实施例说明试剂盒的制备。
26.引物设计与合成：以sod基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组dna序列情况，从中选择最佳检测用引物，其核苷酸序列如下表1所示：
27.表1引物序列
[0028][0029]
上述引物对可单独包装，也可以配成pcr检测液。所述pcr检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
[0030]
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的pcr检测液。
[0031]
进一步地，所述试剂盒还可以含有双蒸水(ddh20)、2xtaq master mix等。
[0032]
实施例3
[0033]
本实施例说明试剂盒的使用。
[0034]
(1)提取样品基因组rna；检测提取样品中rna浓度，定量后反转录为cdna.。提取样品rna步骤为：(a)取处理后的组织及粪便上清液和血液，加入trizol裂解液进行裂解。将2ml ep管中的液体混匀后使用旋涡振荡器进行剧烈的震荡，置于冰上静置放置10min。(b)加入200ul氯仿，将ep管剧烈摇晃1min，使其能更好的萃取核酸，冰上静置10min。(c)12000r/min离心时间为15min，抽取试管中透明液体的三分之二上清液，加入等量的异丙醇轻轻的混匀。冰上静置10min。(d)12000r/min离心时间为10min，进行75％无水乙醇(用depc水配)的配置。(e)弃去上清，加入1ml配制好的75％无水乙醇，轻轻摇晃ep管。(f)8000r/min 4℃离心6min，弃掉上清，ep管室温晾干10min以去除管中的75％无水乙醇。加入10ul depc无菌水溶解沉淀。(e)测得所提取rna浓度后进行计算统一浓度(g)将rna按照试剂盒说明书进行反转录成cdna，放置于
‑
20℃备用。
[0035]
(2)加样：将样品基因组dna、阳性对照或阴性对照分别加入装有pcr反应体系的pcr管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述pcr反应体系中含有前述sod基因检测引物对；pcr检测液配置：双馏水(ddh2o)：9ul；上游引物：1ul；下有引物：1ul；dna样品：1.5ul；2xtaq master mix：12.5ul；共25ul。
[0036]
(3)pcr反应：反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应；pcr反应条件设置为：(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。
[0037]
(4)pcr反应结束后，分析结果。
[0038]
实施例4
[0039]
本实施例说明试剂盒检测奶牛血液中sod基因特异性鉴定。
[0040]
采用实施例2所述试剂盒中的引物，以不同生理病理状态下奶牛血液组分别为模板，pcr方法鉴定sod基因在不同状态下奶牛血液的分布特点。
[0041]
pcr反应体系为(25ul)：9ul双蒸水(ddh20)，12.5ul 2xtaq master mix，sod
‑
f1ul，sod
‑
r 1μl，模板l.5ul。
[0042]
pcr程序为(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。
[0043]
pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，pcr电泳结果表明所有以奶牛血液基因组为模板的泳道中均有143bp目的条带(图1)，表明以实施例2所述试剂盒中特定的sod扩增引物，可以通过pcr方法快速检测出酮病奶牛血液中sod基因。
[0044]
实施例5
[0045]
本实施例说明试剂盒在牛场的应用。
[0046]
采用实施例2中试剂盒，检测5头健康奶牛血液和5头酮病奶牛血液。可快速准确检测出sod基因。具体步骤如下：
[0047]
(1)样品采集
[0048]
本样品采自黑龙江省某牛场。
[0049]
(2)pcr方法检测样本中sod基因
[0050]
将采集血液提取rna定量后反转录为cdna，pcr反应体系为(25ul)：9ul双蒸水(ddh20)，12.5ul 2xtaq master mix，sod
‑
f 1ul，sod
‑
r 1ul，模板l.5ul。pcr程序为(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出134bp的sod条带。结果显示健康奶牛，酮病奶牛都有目的条带，分别为泳道1、2(图2)。
[0051]
本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在sod基因，即酮病奶牛血液中含有143bp核苷酸序列的sod基因，以特异性引物通过pcr技术验证了sod基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中sod基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。