一种与奶牛酮病相关的血液编码基因CYP1A1及其PCR检测试剂盒的制作方法

一种与奶牛酮病相关的血液编码基因cyp1a1及其pcr检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种与奶牛酮病相关的血液编码基因cyp1a1及其pcr检测试剂盒。


背景技术：

2.奶牛酮病是围产期高产奶牛常见的一种以高酮血症、高酮乳症和高酮尿症为主要临床特征的糖脂代谢障碍性疾病。随着奶牛生产周期从妊娠期转变至泌乳期，奶牛能量需求急剧增加，而干物质摄入量减少，导致能量负平衡，引发脂肪动员，导致高非酯化脂肪酸(nonesterified fatty acids，nefa)血症，引发酮病。酮病奶牛机体存在严重的代谢紊乱，在细胞水平上，代谢异常产物增加活性氧(reactive oxygen species，ros)的产生，导致奶牛系统性的氧化应激，并增加乳房炎和子宫内膜炎等感染性疾病的发病率，影响奶牛的整体健康状况，损害奶牛的繁殖性能，并显著降低产奶量，严重影响奶业健康发展。
3.细胞色素酶p450是一组含铁血红素超家族，因还原型p450与一氧化碳具有特殊的亲和力，二者的复合物在分光光度计的450nm处有特异吸收峰而得名。p450有三大家族:cyp1、cyp2、cyp3,是内源性、外源性物质转化酶系的主要成员。细胞色素p450 1a1(cyp1a1 cytochrome p450,family 1,subfamily a,polypeptide 1)是细胞色素p450家族的一个亚型，是活性氧产生的重要调节因子，可通过过量产生ros诱导氧化应激，当细胞内ros过量产生时，抗氧化剂和氧化剂之间的平衡被打破，过剩的ros从多不饱和脂肪酸中提取一个氢原子，形成4
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羟基壬烯醛(hne)和丙二醛(mda)。hne和mda的半衰期比ros长，它们可以从原来的位置扩散到远距离的细胞内和细胞外靶点，从而放大氧化应激的影响。因此对围产期疾病的奶牛血液中cyp1a1含量的变化进行检测，可以为进一步探讨奶牛围产期疾病的发病机制，预防奶牛围产期疾病提供更可靠的理论依据。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供一种与奶牛酮病相关的血液编码基因cyp1a1的核苷酸序列。
5.本发明的第二目的是提供一种与奶牛酮病相关的血液中编码基因cyp1a1的pcr检测试剂盒，解决分离血清蛋白、生化鉴定等传统方法繁琐、费力、耗时、外界影响因素多，结果不稳定的问题。
6.本发明的第三目的是提供上述pcr检测试剂盒的用途。
7.本发明通过以下技术方案来实现：
8.一、一种与奶牛酮病相关的血液编码基因cyp1a1，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.二、一种与酮病相关的编码基因cyp1a1的pcr检测试剂盒，所述的试剂盒中的引物序列如下：
10.正向引物：agaggctggacgagaatgcc(seq id no.2)；
11.反向引物：tgactgtgtcaaacccggct(seq id no.3)。
12.进一步的，所述试剂盒还含有ddh2o、2xtaq master mix、样品基因组dna提取试剂中的一种或多种。
13.进一步的，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。
14.进一步的，所述阳性对照为健康奶牛血液中cyp1a1基因表达的dna样品。
15.进一步的，所述阴性对照为酮病奶牛血液中cyp1a1基因表达的dna样品。
16.三、上述的pcr检测试剂盒在检测和鉴定酮病奶牛氧化应激中的应用。
17.采用上述技术方案的积极效果：本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在cyp1a1基因，即酮病奶牛血液中含有93bp核苷酸序列的cyp1a1基因，以特异性引物通过pcr技术验证了cyp1a1基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中cyp1a1基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。
附图说明
18.图1是pcr鉴定cyp1a1基因的图片，其中泳道m为：dl500 marker，泳道1为奶牛cyp1a1基因片段(93bp处有目的条带)；
19.图2是pcr鉴定cyp1a1基因在奶牛血液中分布和片段大小图片；其中泳道m为：dl500 marker；泳道1为健康奶牛cyp1a1基因片段(93bp处有目的条带)；泳道2为酮病奶牛cyp1a1基因片段(93bp处有目的条带)。
具体实施方式
20.下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
21.实施例1
22.本实施例说明生物学信息学方法鉴定cyp1a1基因的分布。
23.在ncbi，使用blastn在线比对软件(http：//blast.ncbinlm.nih.gov/blast.cgi)在全基因组数据库中搜索cyp1a1基因，搜索结果表明奶牛机体中含有cyp1a1基因(seq id no.1)，且基因长度为93bp的核苷酸序列，在提取rna检测浓度并定量后反转录为cdna，其中健康奶牛血液中cyp1a1基因表达量较高；酮病奶牛血液中cyp1a1基因表达量极高；二者在93bp均可见条带。生物信息学鉴定结果显示cyp1a1特异性良好，可用于建立快速检测奶牛血液中cyp1a1的pcr方法方法(图1)。
24.实施例2
25.本实施例说明试剂盒的制备。
26.引物设计与合成：以cyp1a1基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组dna序列情况，从中选择最佳检测用引物，其核酸序列如下表1所示：
27.表1引物序列
[0028][0029]
上述引物对可单独包装，也可以配成pcr检测液。所述pcr检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
[0030]
也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的pcr检测液。
[0031]
进一步地，所述试剂盒还可以含有双蒸水(ddh20)、2xtaq master mix等。
[0032]
实施例3
[0033]
本实施例说明试剂盒的使用。
[0034]
(1)提取样品基因组rna；检测提取样品中rna浓度，定量后反转录为cdna.。提取样品rna步骤为：(a)取处理后的组织及粪便上清液和血液，加入trizol裂解液进行裂解。将2ml ep管中的液体混匀后使用旋涡振荡器进行剧烈的震荡，置于冰上静置放置10min。(b)加入200ul氯仿，将ep管剧烈摇晃1min，使其能更好的萃取核酸，冰上静置10min。(c)12000r/min离心时间为15min，抽取试管中透明液体的三分之二上清液，加入等量的异丙醇轻轻的混匀。冰上静置10min。(d)12000r/min离心时间为10min，进行75％无水乙醇(用depc水配)的配置。(e)弃去上清，加入1ml配制好的75％无水乙醇，轻轻摇晃ep管。(f)8000r/min 4℃离心6min，弃掉上清，ep管室温晾干10min以去除管中的75％无水乙醇。加入10ul depc无菌水溶解沉淀。(e)测得所提取rna浓度后进行计算统一浓度(g)将rna按照试剂盒说明书进行反转录成cdna，放置于
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20℃备用。
[0035]
(2)加样：将样品基因组dna、阳性对照或阴性对照分别加入装有pcr反应体系的pcr管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述pcr反应体系中含有前述cyp1a1基因检测引物对；pcr检测液配置：双馏水(ddh2o)：9ul；上游引物：1ul；下有引物：1ul；dna样品：1.5ul；2xtaq master mix：12.5ul；共25ul。
[0036]
(3)pcr反应：反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应；pcr反应条件设置为：(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。
[0037]
(4)pcr反应结束后，分析结果。
[0038]
实施例4
[0039]
本实施例说明试剂盒检测奶牛血液中cyp1a1基因特异性鉴定。
[0040]
采用实施例2所述试剂盒中的引物，以不同生理病理状态下奶牛血液组分别为模板，pcr方法鉴定cyp1a1基因在不同状态下奶牛血液的分布特点。
[0041]
pcr反应体系为(25ul)：9ul双蒸水(ddh20)，12.5ul2xtaq master mix，cyp1a1
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f1ul，cyp1a1
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r 1μl，模板l.5ul。
[0042]
pcr程序为(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循
环34次；(e)72℃5min。
[0043]
pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，pcr电泳结果表明所有以奶牛血液基因组为模板的泳道中均有143bp目的条带(图1)，表明以实施例2所述试剂盒中特定的cyp1a1扩增引物，可以通过pcr方法快速检测出酮病奶牛血液中cyp1a1基因。
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实施例5
[0045]
本实施例说明试剂盒在牛场的应用。
[0046]
采用实施例2中试剂盒，检测5头健康奶牛血液和5头酮病奶牛血液。可快速准确检测出cyp1a1基因。具体步骤如下：
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(1)样品采集
[0048]
本样品采自黑龙江省某牛场。
[0049]
(2)pcr方法检测样本中cyp1a1基因
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将采集血液提取rna定量后反转录为cdna，pcr反应体系为(25ul)：9ul双蒸水(ddh20)，12.5ul 2xtaq master mix，cyp1a1
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f 1ul，cyp1a1
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r 1ul，模板l.5ul。pcr程序为(a)94℃3min；(b)94℃30s；(c)60℃35s；(d)72℃35s；步骤(b)～(d)循环34次；(e)72℃5min。pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出93bp的cyp1a1条带。结果显示健康奶牛，酮病奶牛都有目的条带，分别为泳道1、2(图2)。
[0051]
本发明通过广泛而深入的研究，检测出了在酮病奶牛血液中存在cyp1a1基因，即酮病奶牛血液中含有93bp核苷酸序列的cyp1a1基因，以特异性引物通过pcr技术验证了cyp1a1基因在奶牛机体不同状态下的含量；本发明的试剂盒能用于快速高通量的检测出奶牛血液中cyp1a1基因，可作为奶牛酮病氧化应激传统检测的辅助方法，并为奶牛酮病氧化应激的检测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。