一种鸭线粒体COI基因扩增引物及其应用的制作方法

一种鸭线粒体coi基因扩增引物及其应用
技术领域
1.本发明属于鸭类生物线粒体基因获取技术领域，具体涉及一种鸭线粒体coi基因扩增引物及其应用。


背景技术：

2.肉鸭产业是我国畜牧业的重要组成部分。鸭肉在我国是继猪肉和鸡肉之后的第三大肉类产业。2020年，我国肉鸭出栏量达到46.8亿只，占全球总出栏量80％以上，肉鸭产量超过1050万吨，产值超过1250亿元，表明我国对鸭肉需求在上升。此外，鸭在社会文化和生物医学研究中也发挥着重要作用。地方鸭种是一种宝贵的遗传资源，它们对当地环境的高度适应性使它们能够很好地生存。
3.由于世界范围内的选择和驯化，地方鸭种具有很大的遗传多样性。物种内部的遗传多样性可以提高对恶劣环境的适应能力和对疾病的抵抗力。地方鸭品种也可用于增加其他鸭以及纯种商业鸭品种的现有遗传多样性。目前，由于大量引入外来品种，使得地方鸭的遗传多样性减少。因此，需要加强对地方鸭遗传多样性的保护。
4.线粒体dna(mitochondrial dna，mtdna)是存在于细胞质中，其具有分子结构简单、无重组、与核基因无共同序列，进化速度快、母系遗传等特点。由于mtdna基因排列紧凑，几乎没有间隔序列和内含子，易采用通用引物进行pcr扩增获得目的基因片段。因此，线粒体基因可作为重要的分子标记用于生物分子种群遗传学和分子系统学的研究。目前，常用于分子标记的线粒体基因是coi基因，coi条形码已在很多动物中使用。hebert等(2003)研究表明，利用coi基因进行鸟类不同品种分子鉴定具有一定的可行性。黄勋和等(2016)认为coi基因可作为研究鸡品种遗传多样性的候选分子标记。陆俊贤等(2020)认为鸽coi基因突变较少，相对较为保守，可以作为遗传标记研究遗传多样性和起源。但关于鸭coi基因还没有广泛使用且特异性较好的通用引物。因此，筛选特异性较好的coi基因引物能够对鸭的遗传多样性评估和种质资源的保护与开发利用提供技术条件。
5.基于上述内容，提出一种鸭线粒体coi基因扩增引物及其应用。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鸭线粒体coi基因扩增引物及其应用。
7.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
8.本发明提供了一种鸭线粒体coi基因扩增引物，该引物序列为：
9.上游引物序列为coi
‑
f：5'
‑
ccatcttacccgtgacct
‑
3'；
10.下游引物序列为coi
‑
r：5'
‑
tggcttgaaaccagtgta
‑
3'。
11.本发明还提供了一种上述鸭线粒体coi基因扩增引物在在鸭的遗传多样性研究和种质资源的保护开发中的应用。
12.本发明还提供了一种上述鸭线粒体coi基因扩增引物的设计方法，包括以下步骤：
13.登陆美国国立生物技术信息中心下载已有绿头野鸭线粒体基因组全序列，序列号为nc_009684.1；
14.在下载的所述线粒体基因组序列中定位coi基因的位置，其两端各延伸100bp，并保存此部分序列；
15.在所获得的序列中用引物设计软件primer premier 6.0进行上下游引物的设计。
16.本发明还提供了一种利用上述鸭线粒体coi基因扩增引物鉴定鸭线粒体coi基因的方法，采用上述鸭线粒体coi基因扩增引物对鸭的dna模板溶液进行pcr扩增。
17.作为对本发明的进一步改进，pcr扩增条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，重复35次循环，最后72℃延伸10min。
18.作为对本发明的进一步改进，pcr扩增体系包括：灭菌水、2
×
hieff pcr master mix、上游引物、下游引物和dna模板。
19.作为对本发明的进一步改进，pcr扩增体系为50μl，包括：灭菌水9.5μl，2
×
hieff pcr master mix 12.5μl，10μmol/l的上、下游引物各为1.0μl，100ng/μl的dna模板溶液1.0μl。
20.作为对本发明的进一步改进，所述dna模板溶液采用dna提取试剂盒法提取，并用灭菌水稀释至100ng/μl。
21.作为对本发明的进一步改进，pcr扩增后，鸭线粒体coi基因的片段长度为1551bp。
22.作为对本发明的进一步改进，pcr扩增后，通过sanger测序法验证pcr扩增产物。
23.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种鸭线粒体coi基因扩增引物可使获得的鸭线粒体coi基因片段长度增加至1551bp左右，且该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够更好地满足后续鸭线粒体基因组研究以及鸭群体遗传多样性研究的需要以及为鸭种质资源的保护与开发利用提供技术条件。
附图说明
24.图1为所设计的5对引物序列；
25.图2为鸭线粒体dna质检图；
26.图3为本发明实施pcr扩增检验5对引物特异性及扩增效果的电泳图；
27.图4为5对引物扩增产物测序峰图；
28.图5为本发明实施pcr扩增检测所选引物在6种鸭上的特异性及扩增效果的电泳图，6种鸭分别为巢湖鸭(chd)、枞阳媒鸭(zmd)、q1系肉鸭(q1)、q2系肉鸭(q2)、q3系肉鸭(q3)、q5系肉鸭(q5)；
29.图6为本发明实施sanger测序获得6种鸭的coi序列比对图。
具体实施方式
30.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
31.1、材料
32.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用
的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
33.2、方法
34.通过以下步骤进行鸭线粒体coi(即细胞色素氧化酶亚基i(cytochrome oxidase subunit i))基因扩增引物的设计、合成以及完成鸭线粒体coi基因的扩增。
35.2.1下载序列
36.登陆美国国立生物技术中心(ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载绿头野鸭线粒体基因组全序列，其genbank登录号分别为nc_009684.1，并定位其中coi基因的位置。
37.2.2引物设计与合成
38.将genbank下载的绿头野鸭线粒体基因组序列，在coi基因的5'和3'端100
‑
200个碱基对的保守区域内，肉眼观察并结合引物设计软件primer premier 6.0进行上下游引物的设计并对其进行评估。设计引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现等。设计5对引物，并由南京擎科生物科技有限公司合成。
39.2.3 dna提取
40.试验样品来自安徽省的6种鸭的180个体，每种鸭选取30个个体，6种鸭分别为巢湖鸭(chd)、枞阳媒鸭(zmd)、q1系肉鸭(q1)、q2系肉鸭(q2)、q3系肉鸭(q3)、q5系肉鸭(q5)，采用试剂盒法提取dna，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测提取dna的完整性，紫外分光光度计检测浓度和纯度，后用灭菌水稀释至100ng/μl供后续pcr扩增实验，dna模板液冻存于
‑
20℃冰箱备用。
41.2.4使用引物扩增目的片段
42.在50μl的pcr反应体系中，用合成的引物扩增鸭个体的coi基因片段，该体系包括：灭菌水19μl，2
×
hieff pcr master mix 25μl，10μmol/l的上、下游引物各为2μl，100ng/μl的dna模板溶液2μl。为提高产物的特异性，pcr反应采用touchdown程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、56
‑
62℃退火30s、72℃延伸30s，重复10次循环，每次循环降低1℃；然后再95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，重复25次循环；最后72℃延伸20min。
43.2.5筛选引物
44.对5对引物扩增出产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一，扩增效率高的引物3，即：coi
‑
f：5'
‑
ccatcttacccgtgacct
‑
3'，如seq id no.1所示，coi
‑
r：5'
‑
tggcttgaaaccagtgta
‑
3'，如seq id no.2所示。采用5对引物进行pcr扩增获得鸭线粒体coi基因片段的电泳图如图3所示。
45.2.6 pcr扩增
46.用所挑选出的引物3进行pcr扩增，对扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶检测所选生物引物3在6种鸭上的扩增效果。为提高产物的特异性，pcr反应采用touchdown程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、56
‑
62℃退火30s、72℃延伸30s，重复10次循环，每次循环降低1℃；然后再95℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，重复25次循环；最后72℃延伸20min。采用本发明引物进行pcr扩增获得鸭线粒体coi基因片段的电泳图如5所示。
47.2.7测序
48.将得到的pcr扩增产物送南京擎科生物科技有限公司进行sanger测序。经纯化回收后，采用和扩增相同的引物进行正反向双向测序，获得目的片段。该引物设计的目标片段
长度约1600bp，经测序后，删去首尾测序信号不准确的碱基后，可获得1551bp左右的序列长度供后续分析。经测序后获得的部分代表性序列如图6所示。通过对5对引物所扩增出来的引物进行测序，测序结果峰图显示引物1、引物2、引物4、引物5出现双峰，衰减，宽峰，乱峰等情况，说明引物特异性较差，所扩增出的产物不纯。而引物3扩增产物测序结果峰图，整齐且清晰，说明引物特异性好，扩增效果好。
49.其中，6种鸭经过pcr扩增获得的鸭线粒体coi基因序列如下：
50.巢湖鸭(chd)经过pcr扩增获得的线粒体coi基因片段测序后序列如seq id no.3
51.所示；
52.枞阳媒鸭(zmd)经过pcr扩增获得的线粒体coi基因片段测序后序列如seq id no.4所示；
53.q1系肉鸭(q1)经过pcr扩增获得的线粒体coi基因片段测序后序列如seq id no.5所示；
54.q2系肉鸭(q2)经过pcr扩增获得的线粒体coi基因片段测序后序列如seq id no.6所示；
55.q3系肉鸭(q3)经过pcr扩增获得的线粒体coi基因片段测序后序列如seq id no.7所示；
56.q5系肉鸭(q5)经过pcr扩增获得的线粒体coi基因片段测序后序列如seq id no.8所示。
57.测序结果显示，在6个品种中均能测出完整的coi片段，测序结果相同，均为1551bp。
58.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。