一种人急性髓系白血病细胞株及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物学和肿瘤学领域，涉及一种人急性髓系白血病细胞株及其构建方法和应用


背景技术：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemi,aml)是成人最常见的血液系统恶性肿瘤。目前髓系白血病的发病率约为2.57/10万，死亡率约为1.25/10万。aml平均发病年龄为68岁，且随着年龄的增长而增加，65岁以下人群aml发生率为2/10万，65岁以上人群aml发生率升高到20.4/10万。随着中国人口老龄化日益加剧，aml的发病率也呈明显上升趋势。
3.aml发病率增高的同时，其治疗手段相对进展缓慢。aml的两大治疗手段是化疗和移植。除急性早幼粒细胞白血病通过化疗可以达到治愈目的外，移植是其他类型aml治愈的希望，但是也限于供者有限、移植相关的并发症及昂贵的治疗及维持费用。化疗当前仍是aml治疗最主要的手段。以蒽环类加阿糖胞苷组合的“3 7”方案是aml的标准治疗方案。化疗后复发及老年患者的不耐受是亟待解决的问题。总体而言aml患者即便经过积极的治疗远期预后依旧不良，5年总体生存率不足30％，老年患者更是不足20％。
4.近年来随着高通量测序的发展更多aml靶点被发现，针对特异靶点的小分子抑制剂的开发及研究，为aml的治疗带来新的希望，特别是化疗不耐受的老年患者。
5.随着对aml认识的不断深入，我们更加认识到aml是高度异质性的恶性肿瘤。除急性早幼粒细胞白血病外，迄今未发现aml高度特异的分子特点。要实现aml的精准及个体化治疗，仍需不断研究aml的发病机制及分子特点。细胞株是肿瘤研究的基础工具。长久以来肿瘤细胞株基本都是国外建立。血液系统肿瘤细胞株亦是如此。目前用于血液系统研究的细胞株都来自国外遗传背景都是白人或黑人，且数量有限，远远不能涵盖aml的所有类型，更不能全面揭示aml的分子特点。亟待建立亚洲人群的aml细胞株用于aml的发病机制研究。
6.细胞株的体内成瘤能力对肿瘤研究具有重要意义，是评价肿瘤新药及药物新联合方案的重要模型。aml细胞株并不是所有都具有良好的体内成瘤能力，限制了其研究应用。构建具有良好体内成瘤能力的细胞株具有重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种人急性髓系细胞白血病永生化细胞株及其构建方法及应用。
8.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种人急性髓系白血病细胞株，该细胞株命名为人急性髓细胞白血病细胞zyxy
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m1，于2021年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏标号为cctcc no：c202144。
9.本发明还提供如上所述的急性髓系细胞白血病细胞株的子代细胞。
10.进一步地，本发明提供的急性髓系细胞白血病细胞株中存在 2染色体，而研究表明在aml病人中有检测到 2染色体，且 2染色体被认为与aml发生相关，本发明提供的存在
2染色体的aml细胞株可以作为模型研究染色体核型异常在aml的发病中的发病机制等。
11.本发明还将荧光素酶基因整合到上述细胞急性髓系白血病细胞zyxy
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m1的染色体dna上，使细胞表达荧光素酶，构建出稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为zyxy
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m1 luc。
12.本发明还提供如上所述人急性髓系细胞白血病细胞株的用途，选自以下任一项或多项：a.制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型；b.筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物；c.开发肿瘤药物靶点；d.制备肿瘤诊断产品；e.筛选肿瘤生物治疗药物/试剂；f.开发检测肿瘤相关生物工程产品。6.如权利要求5a所述的应用，其特征在于，所述的动物为免疫缺陷小鼠。
13.本发明还提供所述人急性髓系白血病细胞株的构建方法，包括如下步骤：获得新鲜的初发白血病患者高白细胞分离的分离液。取6ml分离液滴加入预先加6ml淋巴细胞分离液的15ml无菌离心管中，离心2000转，20分钟。离心结束后取单个核细胞层至新的15ml无菌离心管中，加入5ml无菌1xpbs重悬细胞，离心2000转，5分钟。弃上清液后，加入无菌的红细胞裂解液常温下裂解细胞5分钟后离心，2000转，5分钟。弃上清，加入5mlimdm完全培养基(imdm 90％ 胎牛血清10％)重悬细胞，离心，1500转，5分钟。弃上清，加入5mlimdm完全培养基，重悬细胞。细胞计数板技术细胞，取1*108细胞加入25cm培养瓶后加imdm培养基至6ml混匀细胞，放入37摄氏度，恒温恒湿培养箱培养细胞。1周后更换新的imdm培养基，直至细胞开始增殖。
14.本发明还提供所述人急性髓系白血病细胞株带荧光素酶基因的细胞株zyxy
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m1 luc的构建方法，包括如下步骤：293t细胞按1
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106/ml浓度铺板10cm平板，铺板24小时后进行病毒包装。包装质粒vsvg、pmd及含荧光素酶基因及稻瘟菌素基因的质粒按2：1：3质量比，总量20μg进行病毒包装。转染试剂为碧云天钙转试剂盒，首先取1.5ml无菌ep管加入含氯化钙的试剂500μl，然后加入按质量比算好的质粒，再加入500μl的2xhbs充分混匀后室温静置20min后，加入293t细胞，混匀后放入37摄氏度恒温恒湿培养箱培养，12小时候转染质粒的293t更换新鲜dmem培养基。48小时后收集转染质粒的293t培养上清，用0.45μm的滤器过滤上清液后4度备用。所述细胞株配成1
×
106/ml的细胞液，按细胞液1ml 病毒液3ml 完全培养基2ml混匀后加入培养瓶进行培养。24小时后转移细胞至新的15ml无菌离心管，离心1500转，5分钟，弃上清，用新的完全培养基重悬细胞后放入培养瓶继续培养。48小时后，更换加杀稻瘟菌素(5μg/ml)的完全培养基，对细胞进行筛选，直至细胞在含杀稻瘟菌素的培养基正常生长后，取培养细胞200μl 20μl的15mg/ml荧光素酶在酶标仪上用自发光程序进行验证，验证后的细胞扩充培养并冻存。
15.本法发明还提供如上述人急性髓系白血病细胞株带荧光素酶基因细胞株zyxy
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m1 luc体内模型的构建及检测方法。zyxy
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m1 luc细胞按1*106/100μl的数量尾静脉注射6周龄免疫缺陷ncg小鼠，注射细胞后的26天、39天进行小鼠活体成像，每只小鼠腹腔注射15mg/ml的荧光素酶后气体麻醉后在小动物活体成像仪进行成像。记录小鼠生存时间。
16.本发明的有益效果是：本发明的人急性髓系白血病细胞株可无限传代，细胞体外形状稳定，并符合临床肿瘤生物学特性。所述的人急性髓系白血病细胞株具有 2染色体，且具有体内成瘤性，可以制备急性白血病的动物模型，且构建出含荧光素酶基因的细胞株，可以更加直观的观察肿瘤的负荷和评价药物疗效。所述急性髓系白血病的细胞株及动物模型，均能用于急性髓系白血病的发生发展的机理研究。还可以利用所述细胞分析抗白血病
新药及联合方案的疗效，进行白血病的药物筛选和评估，可用于指导临床用药。具有良好的科研价值和经济效益。
附图说明
17.下面结合实例和附图对本发明进行进一步说明；
18.图1为所述人急性髓系白血病细胞株显微镜下观察活细胞图(a)及瑞氏
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吉姆萨染色后的结果图(b)；
19.图2为所述人急性髓系白血病细胞株不同细胞密度下的细胞生长曲线；
20.图3为所述急性髓系白血病细胞株的染色体显带结果；
21.图4为所述急性髓系白血病细胞株的小鼠活体成像结果(a)及生存曲线(b)。
具体实施方式
22.下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
23.实例1人急性髓系白血病细胞株制备
24.原代细胞培养：将浙江大学医学院附属第一医院获得的新鲜高白细胞分离标本(男性，61岁，aml
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m2，白细胞125.3*109/l)立即分离白血病单个核细胞。在生物安全柜中，取6ml细胞分离液滴加入预先加6ml淋巴细胞分离液的15ml无菌离心管中，离心2000转，20分钟。离心结束后取单个核细胞层至新的15ml无菌离心管中，加入5ml无菌1xpbs重悬细胞，离心2000转，5分钟。弃上清液后，加入无菌的红细胞裂解液常温下裂解细胞5分钟后离心，2000转，5分钟。弃上清，加入5mlimdm完全培养基(imdm 90％ 胎牛血清10％)重悬细胞，离心，1500转，5分钟。弃上清，加入5mlimdm完全培养基，重悬细胞。细胞计数板计数细胞，取1*108细胞加入25cm培养瓶后加imdm培养基至6ml混匀细胞，放入37摄氏度，恒温恒湿培养箱培养细胞。1周后更换新的imdm培养基去除细胞碎片，继续培养。以后每周更换培养基一次。
25.细胞传代培养：细胞在培养1月时出现大量细胞凋亡及死亡。剩余未死亡细胞呈现不增殖不死亡状态，依旧每周更换培养基。细胞培养3月时细胞开始缓慢增殖，出现抱团生长细胞团，悬浮生长。细胞培养6月时细胞增殖加快。此时每个48小时更换细胞培养基并开始传代，至目前细胞传代已超过50代，呈永生化细胞株。
26.本发明中，细胞呈悬浮状态生长，抱团或单个细胞生长，细胞呈圆形或椭圆形，细胞生长速度稳定，将其命名为人急性髓细胞白血病细胞株zyxy
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m1，于2021年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏标号为cctcc no：c202144。
27.实例2人急性髓系白血病细胞系的生物学性状及应用
28.本发明采用含10％胎牛血清的imdm培养基培养人急性髓细胞白血病细胞株zyxy
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m1，使其可以体外稳定生长并稳定传代。显微镜下观察细胞呈悬浮单个或抱团生长，圆形或椭圆形。瑞氏
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吉姆萨染色，细胞呈核大深染的原始髓系单核细胞形态，符合aml细胞的形态学特征。染色体显带结果表明zyxy
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m1细胞呈 2染色体，染色体核型异常在aml的发病中具有重要的作用，在aml病人中 2染色体又被检测到，且被认为与aml发生相关，本发明提供了首株存在 2染色体的aml细胞株。细胞株转染荧光素酶基因后一定数量细胞尾静脉接种老鼠后能建成白血病的小鼠模型，说明细胞株具有致瘤性。该细胞株可以用于制备肿瘤细胞
模型或制备肿瘤动物模型；筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物；开发肿瘤药物靶点；制备肿瘤诊断产品；筛选肿瘤生物治疗药物/试剂；开发检测肿瘤相关生物工程产品。具体如下：
29.形态学观察
30.将培养的人急性髓系白血病细胞株置于倒置的显微镜下观察并拍照，如图1a所示，细胞呈单个或抱团的悬浮生长，细胞呈圆形或椭圆形。将培养的细胞取1*106个于1.5mlep管中，离心1500转，5分钟，弃上清后加10μl培养基重悬细胞后推片。待细胞涂片干燥后，加瑞氏
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吉姆萨染液染细胞涂片5分钟后，冲洗，晾干。于倒置显微镜下观察细胞形态，如图1b所示，根据瑞氏
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吉姆萨染色显示细胞呈核大深染的原始髓系单核细胞形态，符合aml细胞的形态学特征。
31.体外增殖能力观察
32.将培养的人急性髓系白血病细胞株按0.5，1，2，4，8*105/ml的浓度铺板于96孔板，每孔铺100μl，在0，24，48，72，96小时，分别加20μl的mts，4小时后酶标仪测96孔板的吸光值，利用graphpad作图软件，绘制不同铺板浓度下细胞的增殖曲线如图2所示，细胞株细胞具有良好的体外增殖能力，呈恶性生长。
33.染色体检查
34.将培养的细胞取1*106进行染色体r显带，然后进行人工分析并拍照，结果如图3所示，所述细胞株细胞存在 2染色体。
35.细胞成瘤性
36.将所述细胞株细胞利用慢病毒转染技术携带荧光素酶基因，将1*106/100μl的细胞尾静脉注射免疫缺陷的ncg小鼠(6个重复)，在注射细胞后的26、39天进行小鼠活体成像，结果如图4a所示，小鼠都具有明显的肿瘤负荷。并绘制小鼠的生存曲线如图4b所示，小鼠建模成功后最终都死亡，中位生存时间是97天。
37.细胞str鉴定
38.将培养细胞送上海翼和生物进行细胞str位点和amelogenin位点的基因分型。结果提示所述细胞株与国际已有细胞株不匹配，是独一无二的。细胞str位点和amelogenin位点的基因分型如表一所示。
39.表一：细胞的str位点和amelogenin位点的基因分型结果
[0040][0041][0042]
细胞株白血病标准药物药敏实验
[0043]
将培养细胞按1*105/ml的浓度铺24孔板，每个药物设空白对照孔及7个不同药物浓度，铺板48小时后转板至96孔板，加mts测吸光值，并利用graphpad软件计算药物的半数抑制浓度。结果如表2所示，aml标准化疗药物去甲氧柔红霉素、柔红霉素、高三尖杉酯碱和阿糖胞苷对该细胞株均具有符合实际的抑制作用，说明本发明细胞株是研究及进行白血病药物筛选及研究的良好细胞模型。
[0044]
表2：常规化疗药物单药在该细胞株的半数抑制浓度。
[0045][0046]
以上实施例用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种人急性髓系白血病细胞株，其特征是，命名为人急性髓细胞白血病细胞zyxy
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m1，于2021年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202144。2.根据权利要求1所述的一种人急性髓系白血病细胞株，其特征是，所述人急性髓系白血病细胞株中存在 2染色体。3.如权利要求1所述的急性髓系白血病细胞株的子代细胞。4.一种稳定表达荧光素酶的人急性髓系白血病细胞株，其特征是，所述稳定表达荧光素酶的人急性髓系白血病细胞株通过将荧光素酶基因整合到权利要求1所述急性髓系白血病细胞株zyxy
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m1的染色体dna上得到。5.如权利要求1
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3所述的人急性髓系白血病细胞株的用途，包括以下任一项或多项：a.制备肿瘤细胞模型或制备肿瘤动物模型。b.筛选和/或评价/制备肿瘤治疗药物。c.开发肿瘤药物靶点。d.制备肿瘤诊断产品。e.筛选肿瘤生物治疗药物/试剂.f.开发检测肿瘤相关生物工程产品。6.如权利要求5所述的用途，其特征是，所述制备肿瘤动物模型中，动物为免疫缺陷小鼠。
技术总结
本发明公开了一种人急性髓系细胞白血病细胞株及其应用。急性髓系细胞白血病细胞株命名为急性髓系细胞白血病细胞ZYXY


技术研发人员：金洁 李枫林 王华锋
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2021.03.18
技术公布日：2021/6/29